Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Роль цитоплазматических ферментов в углеводно-фосфорном обмене 10
2. Действие низких температур на ферменты в составе клеток и тканей 22
Экспериментальная часть
3. Материалы и методы 33
4. Криочувствительность ферментов гликолиза в составе тканевых препаратов и клеток при замораживании-отогреве 44
5. Элиминация ферментных белков в экзоцеллюлярную среду как показатель скрытых "латентных" повреждений клеток при замораживании-отогреве
5.1. Значение клеток, сохранившихся после замораживания-отогрева, как источника внеклеточных ферментов 62
5.2. Гликолитическая активность гепатоцитов после замораживания-отогрева 72
5.3. Активность гликолитических ферментов в экзоцеллюлярной среде костного мозга в условиях криоконсервации 77
6. Влияние криопротекторов на элиминацию ферментов при замораживании-отогреве тканей и клеток 82
Заключение 88
Выводы 100
Список литературы 102
- Действие низких температур на ферменты в составе клеток и тканей
- Криочувствительность ферментов гликолиза в составе тканевых препаратов и клеток при замораживании-отогреве
- Значение клеток, сохранившихся после замораживания-отогрева, как источника внеклеточных ферментов
- Активность гликолитических ферментов в экзоцеллюлярной среде костного мозга в условиях криоконсервации
Введение к работе
В настоящее время низкие температуры широко используются для сохранения клеток, органов и тканей в длительно жизнеспособном состоянии, что и обуславливает важное значение экспериментальных исследований по изучению механизма изменений, возникающих на молекулярном, субклеточном и клеточном уровнях в результате низкотемпературного воздействия. Первые шаги в криоконсервации биологического материала подтверждают оптимистические прогнозы применения этого метода для хранения и последующей трансплантации жизненноважных органов человека.
Однако, как известно Z 44_7, прямой путь криоконсервации приводит к нежелательным явлениям, вызванным повреждениями биологического материала. Согласно современным представлениям, повреж-. дающее действие низких температур на клетки и ткани обусловлено влиянием многочисленных факторов, возникающих при замораживании, на морфологическую и функциональную организацию живых систем 64, 159, 2047. Большинство исследований, выполненных как на животных, так и растительных клетках, свидетельствуют, что точка приложения повреждающих факторов локализуется на уровне белковых молекул и мулі тиэнзимных комплексов, связанных с различными мембранными образованиями.
Причем, степень повреждения ферментных белков, как показано /357, зависит от исходной молекулярной структуры фермента, а также его физико-химического микроокружения в составе клетки или модельной системы. В настоящее время известно, что из многих ферментов наиболее чувствительными к действию низких температур в составе бесклеточной системы оказываются энзимы, имеющие олигомер-ную четвертичную структуру С92_7. Установлено также ZT4,26,31,1837, что ферменты и ферментные комплексы, ассоциированные с различными мембранными системами, также изменяют свои каталитические свойства
как следствие первичных изменений липопротеидной структуры мембраны после замораживания изолированных клеточных органелл.
В то же время, вопрос о поведении ферментных белков в составе различных биологических объектов остается окончательно не выяснен. По мнению ряда авторов ZTI25J7, энзимы, находящиеся в составе клеток и тканей,являются более стабильными к низкотемпературному воздействию по сравнению с такими же белками в составе бесклеточной системы, что объясняется наличием в клетке ряда метаболических веществ, субстратов, кофакторов. С другой стороны, имеются данные о том, что замораживание-отогрев клеток и тканей в ряде случаев может приводить к изменению структурно-функционального состояния ферментов 9bJ, Показано также С 214 J, что достаточным условием для появления во внеклеточной среде многих ферментов является не только нарушение мембранной проницаемости, но и снижение энергетического потенциала клетки, контролирующего проницаемость плазматической мембраны для каталитических белков. Как, например, нарушение процессов окислительного фосфорилирования, то есть понижение или блокада продукции энергии, является первопричиной изменения селективной проницаемости клеточных мембран Z 56_7. При низкотемпературном консервировании различных клеток и тканей было обнаружено угнетение гликолиза ZT37J7, снижение уровня гликогена Z H4J7, уменьшение внутриклеточного содержания Фн, АТФ, АД&, АМФ C2&J, что явно свидетельствует о значительном нарушении энергетических процессов в клетках в результате замораживания.
Существенный интерес представляет изучение активности ряда ферментов основных цепных и циклических процессов метаболизма, определяющих энергетический потенциал клетки - гликолиз, цикл трикар-боновых кислот, пентозофосфатный шунт. Состояние отдельных ферментативных звеньев в конечном счете определяет интегральный уровень
энергообеспечения клеток и тканей, что имеет решающее значение для поддержания биологических систем в жизнеспособном и функционально-полноценном состоянии. Особый интерес в этом плане представляют ферменты углеводно-фосфорного обмена, так как они обеспечивают основные каталитические превращения углеводных субстратов на путях их энергетического использования как в физиологических, так и, в особенности, при действии на клетку экстремальных факторов.
Литературные данные по действию низких температур на активность цитоплазматических ферментов малочисленны и носят зачастую прямо противоположный характер. В некоторых случаях наблюдалось снижение активности цитоплазматических ферментов при замораживании-отогреве биологического материала ZTI07J7. Исследованиями других авторов /7104.7 показана активация ферментов углеводно-фосфорного обмена после низкотемпературной консервации биологических объектов. Различное поведение ферментов при действии низких температур обнаружили ZT98_7 при исследовании энзиматической активности в ткани печени, почек, сердца, скелетной мышцы и мозга крыс. Такая противоречивость экспериментальных данных свидетельствует о недостаточной изученности поведения ферментов обменных процессов при действии низких температур.
В настоящее время с целью предохранения биологического материала от повреждающего действия низких температур ведутся интенсивные исследования по изучению механизма защитного действия крио-протекторов. Основным критерием оценки криопротекторных свойств того или иного вещества является жизнеспособность клеток после отогрева, которая во многом зависит от сохранения механизмов аккумуляции и трансформации энергии в клетке, в частности, механизма гликолитического фосфорилирования. Работ по изучению влияния крио-протекторов на активность цитоплазматических ферментов при крио
консервации биологического материала крайне мало.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось исследование криоустойчивости и клеточных механизмов нарушения активности ключевых ферментов углеводно-фосфорного обмена в условиях замораживания-отогрева различных тканевых препаратов и клеточных суспензий.
Выполнение поставленной цели требовало решения следующих конкретных задач:
1. Изучить криочувствительность ферментов гликолиза и пенто- зо-фосфатного шунта (гексокиназы, фосфофруктокиназы, лактатдегид- рогеназы, фосфорилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглю- конатдегидрогеназы) в составе тканевых и клеточных препаратов
при различных режимах замораживания-отогрева.
2. Оценить значение элиминации ферментных белков в экзоцеллю- лярную среду как показателя повреждений клеток при замораживании- отогреве, выяснив при этом:
а. Роль популяции клеток, сохранившихся после замораживания- отогрева, как источника внеклеточных ферментных белков.
б. Характер и причины изменения интенсивности гликолиза в клетках при замораживании-отогреве.
в. Возможность применения ферментных тестов для диагностики полноценности трансплантационного материала в практике криоконсер- вации.
3. Исследовать влияние некоторых криопротекторов на потерю ферментных белков клетками при замораживании-отогреве.
Выбор указанных ферментов углеводно-фосфорного обмена для решения поставленных задач основывался на общих теоретических предпосылках. Известно, что ферменты, активность которых изучалась в работе, занимают узловую позицию на перекрестках основных метабо
лических путей или катализируют начальные реакции обменных процессов, выполняя функцию "ключевых" и, одновременно, функцию алло-стерических регуляторов отдельных участков метаболизма клетки.
В результате проведенных исследований различных тканевых и клеточных препаратов впервые выявлена криоустойчивость "ключевых" ферментов углеводно-фосфорного обмена при замораживании-оттаивании. Получены экспериментальные доказательства того, что источником внеклеточных ферментных белков при замораживании биологического материала являются разрушенные клетки, а также популяция сохранившихся клеток со скрытыми "латентными" повреждениями.
Впервые изучены процессы гликолитического расщепления углеводов в криоконсервированных гепатоцитах и показано, что потеря клеткой в процессе замораживания-отогрева "ключевых" гликолитичес-ких ферментов является одной из основных причин снижения интегральной скорости клеточного гликолиза.
На примере клеток костного мозга человека показано, что определение внеклеточной активности ферментов является достаточно чувствительным биохимическим показателем полноценности биологического материала.
Получены новые данные об эффективности ряда криопротекторов -полиолов в отношении сохранности клеток и предупреждения ферментных нарушений в них при замораживании-отогреве.
Практическая ценность работы заключается в том, что результаты полученные на трупном костном мозге до замораживания свидетельствуют, что определение активности гликолитических ферментов во внеклеточной среде может быть также показателем качества трансплантационного материала на этапе его подготовки к низкотемпературному консервированию.
Разработанный на основании экспериментальных данных способ
оценки структурно-функциональной полноценности клеток костного мозга и лейкоконцентрата от доноров и посмертного происхождения в условиях криоконсервации, используется в работе Харьковской областной станции переливания крови.
Данные, касающиеся особенностей влияния изучавшихся криопро-текторов на содержание клеток и ферментные изменения в них могут быть полезными при разработке способов низкотемпературной консервации клеточных суспензий.
На защиту выносятся следующие основные положения работы:
1. Ключевые ферменты гликолиза и пентозо-фосфатного шунта проявляют криоустойчивость в однократном цикле замораживания-оттаивания. Снижение их внутриклеточной активности обусловлено элиминацией соответствующих каталитических белков в экзоцеллюлярную среду из разрушенных, а также сохранивших морфологическую структуру клеточных элементов.
2. Уровень активности гликолитических ферментов в среде замораживания является объективным показателем структурных повреждений клеток и может применяться в комплексе с другими показателями для оценки качества биологического материала и эффективности его криоконсервации.
Действие низких температур на ферменты в составе клеток и тканей
Одним из важных вопросов, требующих решения для раскрытия общих механизмов криоповреждения биологических объектов, является выяснение структурно-функционального состояния ферментов при действии низких температур, поскольку нормальное функционирование каталитических систем во многом определяет, метаболическую и морфологическую сохранность клетки после охлаждения.
Данные литературы по влиянию действия низких температур на активность ферментов в составе различных клеток и тканей животного и растительного происхождения, малочисленны и довольно противоречивы. Считают, что ферменты, функционирующие в составе клетки, являются более устойчивыми к повреждающим факторам низких температур, чем изолированные.
Например, v.Heber не обнаружил изменения активности каталазы, лактатдегидрогеназы, фосфоглюкоизомеразы и транс-аминазы при замораживании растительных клеток.
При исследовании стабильности ферментов в образцах крови, плазмы и сыворотки при -20С отмечалось изменение активности только лактатдегидрогеназы, в то время как активность ацетилхолинэсте-разы, амилазы, щелочной фосфатази оставалась неизмененной / 182.7.
При исследовании активности 15-ти ферментов в эритроцитах при криоконсервации крови в течение 15 суток отмечалось значительное снижение фосфофруктокиназы, 2,3-лифосфоглицеромутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, тогда как активность фосфоглицерокиназы, энолазы и лактатдегидрогеназь значительно увеличивалась.
В исследованиях других авторов Г 202,1407 низкотемпературное криоконсервирование эритроцитов сопровождалось значительным снижешг ем активности цитоплазматических ферментов.
Так, например, при замораживании и хранении более, чем 5 суток эритроцитов наблюдалось значительное падение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, пируваткиназы, гексокиназы, лактатдегидроге-назы, фосфофруктокиназы 202 J. Активность фосфофруктокиназы повышали добавки А, дифосфоглицерат, АДБ, фосфоэнолпируват, а также комбинации глюкозы с А1Ш»Мд,+. Авторы предполагают, что снижение активности фосфофруктокиназы при криоконсервации эритроцитов обусловлено потерей неорганических фосфатов. В работе Z I407 исследовалась активность 18-ти ферментов после низкотемпературного хранения эритроцитов при -80С в течение года. В эксперименте были использованы эритроциты здоровых людей и больных с мутантной формой пируваткиназы. %тантная форма пируваткиназы отличалась высокой нестабильностью. Ферментативная же активность нормальной пируваткиназы оставалась неизменной в течение всего срока хранения. При этом наблюдалось значительное снижение уровня активности триозофос-фатизомеразы и трифосфоглицераткиназы на 40 и 30$ соответственно.
В ряде работ по низкотемпературному консервированию клеток спермы показано С&2,83, II7,118,174 J, что замораживание-отогрев клеток приводит к освобождению в экстрацеллюлярную среду ряда цитоплазматических ферментов, таких как глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, аспартатаминотрансфераза. Авторы отмечали корреляцию между числом жизнеспособных клеток после замораживания -отогрева и активностью ферментов в экстрацеллюлярной среде.
Процедура замораживания-отогрева, приводящая к полной потере сперматозоидами двигательной активности, приводила в тоже время к значительному выбросу во внеклеточное пространство аспартатамино-трансферазы.
При изучении действия низких температур на сперму быка и хряка наблюдалось уменьшение количества натрия, калия, кальция и фосфора, что авторы /Г 62,837 связывают с усилением обмена ВЄЩЄСТЕ при измененной проницаемости мембраны.
Наблюдаемые при криоконсервации сперматозоидов конформацион-ные изменения мембранных ферментов, ингибирование активности транспорта ионов через клеточную мембрану и угнетение гликолиза говорит о нарушении целостности структур данных клеток.
При замораживании изолированной суспензии клеток печени наблюдался значительный выход из клеток лактатдегидрогеназы, внутриклеточное содержание К"1" резко снижалось. Эндогенное дыхание замороженных клеток стимулировалось сукцинатом, что является свидетельством повреждения ионной проницаемости плазматической мембраны "767.
Исследованиями многих авторов показано С122,168,201,214,215J что достаточным условием для появления во внеклеточной среде многих цитоплазматических ферментов является не только необратимое повреждение мембранных структур, но и снижение энергетического потенциала клетки,контролирующего проницаемость плазматической мембраны для ферментных белков. Предложена модель С75.7, согласно которой в энергетическом обмене клетки значительную роль играет гликолитическая система; от регуляции этой системы зависят такие показатели как фосфорилирующий потенциал, энергетический заряд клетки и окислительно-восстановительное состояние пиридиннуклео-тидов. Установлено, что снижение содержания внутриклеточного А!Ш С 206,214 J приводит к выходу в окружающую среду многих цитоплазматических и мембраносвязанных ферментов.
Шло показано Z"I0_7, что пятидневная консервация костномозговых клеток приводит к снижению гликолитической активности, сопровождающееся ослаблением эффекта Пастера. интенсивность дыхания снижается на 596. Внутриклеточное содержание кТШ в конце недели составляет лишь 3& от исходного. При замораживании гепатоцитов значительно падает содержание гликогена, нарушается белковый синтез, что является свидетельством нарушения энергетического обмена в клетках Z II4_7 .
Вероятно, в сохранении ферментов исключительную роль играет состояние энергетического метаболизма. При исследовании зависимости между выходом ферментов и снабжением сердца кислородом было показано С 60J, что в течение анаэробиоза температурный коэффициент для вышедших ферментов миокарда и снижение энергии, богатой фосфатами в мышцах сердца идентично. Наблюдается достоверная корреляция между скоростью потери ферментов из сердечной мышцы и содержанием мио-кардиальной АЇІ.
Криочувствительность ферментов гликолиза в составе тканевых препаратов и клеток при замораживании-отогреве
Исследование поведения различных ферментов и ферментных систем при действии низких температур имеет большое значение для раскрытия механизмов криоповреждения биологических объектов, так как структурно-функциональное состояние каталитических белков во многом определяет функциональную и метаболическую полноценность клеток и тканей, подвергаемых низкотемпературной консервации.
В настоящей главе поставлена задача изучить активность и выяснить возможный механизм ее нарушения для ключевых ферментов гликолиза в составе тканевых препаратов органов крысы в условиях действия низких температур.
В наших опытах срезы печени подвергались медленному замораживанию до -30 - медленному оттаиванию. Этот режим, согласно данным литературы С 120 7, является наиболее критическим в отношении выживаемости клеток и сохранности клеточных структур в процессе замораживания, так как в этом температурном интервале возникает целый ряд повреждающих факторов (вымораживание воды с сопутствуищиь увеличением концентрации растворенных веществ, изменение рН, осмотические градиенты растворенных веществ) , играющих основную роль в криоповреждении тканевых структур и клеточных мембран.
После медленного замораживания срезов печени до -30С отмечалось достоверное снижение активности всех исследуемых ферментов (таблица I) .
Одновременно наблюдалось появление в среде замораживания довольно высокого уровня активности всех изучавшихся ферментов. При этом необходимо отметить, что в среде, в которой содержались нативные срезы печени, активность ферментов не обнаруживалась.
Одной из возможных причин снижения активности цитоплазматичес-ких ферментов при замораживании-оттаивании срезов печени может быть выход этих ферментов через поврежденную мембрану клеток.
В настоящее время считается установленным, что наиболее повреждаемыми участками клеток при действии низких температур являются прежде всего мембранные структуры /75,6,142,31J. Охлаждение и замораживание вызывают в мембранах выраженные структурные и функциональные повреждения, приводящие к изменению их проницаемости. Обнаруженный довольно высокий уровень цитоплазматических ферментов в среде замораживания может свидетельствовать о выходе изучавшихся ферментов через поврежденную в процееое замораживания клеточную мембрану.
Однако,в условиях нашего эксперимента нельзя было исключить, что снижение ферментативной активности может быть также результатом изменения нативнои структуры каталитических белков под влиянием физико-химических сдвигов, возникающих в клетке в процессе охлаждения.
С целью проверки данного предположения была исследована активность ферментов после медленного замораживания - медленного оттаивания до -30С 2,5%-ного гомогената печени и надосадочной фракции, полученной путем центрифугирования гомогената 5000 о в течение 10 минут . В качестве контроля служила активность ферментов надосадочной фракции 2,5%-ного гомогената печени до замораживания-оттаивания.
Как следует из данных таблицы 2, активность всех изучавшихся ферментов в составе гомогената и надосадочной фракции печени после их замораживания - оттаивания не изменялась.
Результаты, представленные в таблице 2, подтверждают, с одной стороны, устойчивость гликолитических ферментов к действию низких температур и, с другой, дают основание считать выход каталитическго белков во внеклеточную среду через поврежденную замораживанием плазматическую мембрану клеток основной причиной снижения их тканевой активности при медленном замораживании до -30С - медленном оттаивании тканевых срезов.
Качественно подобные результаты были получены и после быстрого замораживания до -196С - быстрого отогрева в 0,15 М растворе хлорида натрия изолированной из печени крыс суспензии гепатоцитов.
Как видно из рисунка I, после быстрого замораживания клеток печени-в экзоцеллюлярнои среде резко увеличивался уровень активности всех изучавшихся ферментов. В то время как в клетках, подвергавшихся замораживанию-отогреву, активность ферментов значительно снижается (рис.2) .
После быстрого замораживания гомогената, приготовленного из клеточной суспензии, а также надосадочной фракции выделенной из этого гомогената, - в обоих случаях не наблюдалось заметных изменений активности цитоплазматических ферментов (таблица 3) .
Подтверждением устойчивости изучавшихся каталитических белков к действию замораживания-отогрева являются результаты, полученные при исследовании активности глнколитичееких ферментов в гомогенатах из замороженных срезов печени, почек и сердца крысы, которые подвергались различным режимам замораживания-отогрева до -19бС.
Значение клеток, сохранившихся после замораживания-отогрева, как источника внеклеточных ферментов
В предыдущем разделе работы было показано, что замораживание-отогрев тканевых срезов и клеточных суспензий изолированных гепатоц тов вызывает выход внутриклеточных ферментов гликолиза в окружающую среду. Однако, представленные данные не дают ответа на вопрос, являются ли источником внеклеточных ферментов только необратимо разрушенные замораживанием клеточные элементы или же определенный вклад в этот процесс вносят также клетки, сохранившие морфологическую организацию, но отличавшиеся повышенной проницаемостью для белковых молекул. Необходимо отметить, что данная проблема представляет интерес не только для криобиологии, но имеет также общебиологическое значение. Хорошо известно, что явление элиминации внутриклеточных белков, в том числе ферментов, широко используется в медицинской практике и различных областях цитопатологии для диагностики локализации повреждения и характера течения патологического процесса в органах и тканях.
Однако, во многих случаях невозможно определить, в какой мере уровень ферментов в экзоцеллюлярной среде отражает глубину клеточного повреждения. Существует мнение /"21,22,47,117,123 7, что освобождение из клетки мембраносвязанных ферментов является результатом нарушения мембранного барьера проницаемости и свидетельствует, по-видимому, о необратимости повреждения соответствующих органелл или клетки в целом. Что касается растворимых цитоплазмати-ческих ферментов, ио согласно имеющимся данным литературы этот вопрос не может решаться столь однозначно.
Показано, например, что появление многих цитоплазматических ферментов во внеклеточной среде является результатом не только повреждения мембранных структур, но и снижения энергетического потенциала клетки, контролирующего проницаемость плазматических мембран для ферментных белков Z I68,20I,2I4_7. Одним из адекватных экспериментальных подходов для выяснения источника внеклеточных ферментных белков при замораживании-отогреве биологического материала может быть сопоставление уровня их активности с изменением количества клеток в этих условиях. Объектом исследования в наших опытах служили лейкоциты человека, которые получали из свежей донорской крови.
Выделенные клетки ресуспендировали в 0,15 М растворе хлористого натрия или гомологичной плазме до конечной концентрации 5-7 тыс. клеток в I мм3. Полученную суспензию лейкоцитов разливали в полиэтиленовые ампулы и замораживали в парах жидкого азота до -30, -70, -140, -19бС со средней скоростью І град, в минуту. По достижении указанных температур пробы извлекались из криостата и оттаивались медленно - на воздухе при +20-22С или быстро - в водяном термостате при +40С. Оттаявшие пробы центрифугировали при 2 тыс. об/мин в течение 10-15 мин до полного осаждения клеток. Надосадоч-ную жидкость сливали и в ней определяли активность гексокиназы, фосфорилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы.
Применяли два способа расчета активности ферментов. В первом варианте активность ферментов рассчитывалась на количество сохранившихся после замораживания лейкоцитов. Контролем служили пробы, которые хранились при +4С. Во втором варианте активность ферментов рассчитывалась на количество разрушенных при замораживании-оттаивании лейкоцитов. Количество разрушенных клеток рассчитывали по разнице между исходным количеством в пробах до замораживания и количеством оставшихся после размораживания . Счет клеток производили в камере Горяева. В этом случае контролем служили пробы, в которых практически полное разрушение клеток производили путем тщательной гомогенизации их в притертом стеклянном гомогенизаторе в присутствии 0,1#-ного раствора тритона Х-100.
Как видно из рис. 7, замораживание суспензии лейкоцитов приводит к значительному разрушению клеток, максимальная потеря которых около 80% наблюдается в диапазоне температур от 0 —30С
С этими данными коррелируют результаты исследования внеклеточноі активности изучавшихся ферментов: в диапазоне температур 0 —30С отмечается значительное повышение уровня активности всех ферментов, тогда как при более низких температурах замораживания существенной динамики этих показателей не отмечалось (таблица 8). Согласно данным литературы /"80, 120, 139, 171, 2057, фазовое превращение воды в сложнокомпонентных растворах происходит главным образом в интервале температур от 0С до -40С.
Известно, что пусковым процессом, ведущим к разрушению клетки в этом интервале температур, является кристаллизация воды, рост кристаллов льда и формирование микроканальцев льда, в которых концентрируется жидкая фаза и сдавливаются клетки. Процесс кристаллизации инициирует возникновение факторов, оказывающих отрицательное действие на клетку /"497. К ним прежде всего относится изменение рН и ионной силы раствора, гиперконцентрационные и электрические эффекты кристаллов льда, последствия дегидратации клетки, пространсі венного сближения макромолекул и механическое воздействие кристаллов льда. Указанные факторы вызывают структурные и биохимические модификации компонентов мембран. Фазовые переходы липидов из жидкокристаллического состояния в состояние геля в температурной зоне 0 - 30С приводят к перераспределению различных компонентов мембран, то есть лежат в основе таких процессов, как латеральная сепарация липидов и агрегация мембранных белков. Согласно / 142.7 в процессе фазового разделения липидов система претерпевает значительные термодинамические изменения, в первую очередь флуктуации по плотности в различных участках мембраны, обуславливающие значительное латеральное сжатие определенной микрозоны мембраны. Все это влияет на состояние соседнего участка таким образом, что вызывает формирование дефектной области между ними /"5,6 J. Возникновение таких областей существенно влияет на проницаемость мембраны для ионов и метаболитов на этом участке.
Активность гликолитических ферментов в экзоцеллюлярной среде костного мозга в условиях криоконсервации
Согласно современным данным литературы, повреждающий эффект низких температур на клетки и ткани является результатом сочетан-ного действия многочисленных физико-химических факторов - низкотемпературного шока, кристаллизационных явлений, осмотических градиентов, высоких концентраций электролитов и метаболитов, эффектов дегидратации и межмолекулярных взаимодействий, изменения рН среды, возникающих в процессе охлаждения и вымораживания внеклеточной и внутриклеточной воды.
Установлено, что точкой приложения указанных повреждающих факторов могут быть белковые структуры, в частности, каталитические белки, которые находятся в клетке в растворимом состоянии или ассоциированы с различными мембранными образованиями Z"8I,98,I06_7.
Очевидно, что структурно-функциональное состояние ферментов, катализирующих важнейшие обменные процессы, во многом будет определять функциональную и метаболическую полноценность тканей, подвергнутых действию холода. В связи с этим представляет несомненный интерес исследование поведения различных ферментных систем в условиях влияния низких температур, что позволит более детально понять механизм криоповреждений как белковых структур», так и клетки в целом.
Целью настоящей работы явилось изучение криоустойчивости и клеточных механизмов нарушения активности ключевых ферментов гликолиза препаратов различного уровня биологической организации.
После медленного замораживания срезов печени до -30С - медленного оттаивания было показано, что достоверное снижение активности гликолитических ферментов в составе срезов сопровождалось повышением уровня их активности в среде замораживания. Эти результаты дают основание считать, что одной из возможных причин снижеия активности цитоплазматических ферментов при замораживании -ттаивании тканевых срезов является выход ферментных белков в окру-ающую среду в результате повреждения клеточных мембран.
Однако, нельзя исключить, что снижение активности гликолитичес-их ферментов при замораживании срезов печени крысы может также вляться результатом нарушения нативной конформации белковых молекул,
С целью проверки данного предположения была исследована актив-ость цитоплазматических ферментов после медленного замораживания о -30С гомогената из срезов печени и надосадочной фракции из го-огенатов. Отсутствие в этих экспериментах изменений активности изу-авшихся ферментов подтвердило с одной стороны, устойчивость гликоли-ических ферментов к действию низких температур, и с другой, дает знование считать выход каталитических белков во внеклеточную среду зновной причиной снижения их тканевой активности при замораживали - оттаивании тканевых срезов печени.
Подобные результаты были получены при замораживании изолирований из печени крыс суспензии гепатоцитов. Установлено, что быстрое шораживание до -19бС клеток печени сопровождается резким увеличены активности всех изучавшихся ферментов в экзоцеллюлярной среде, щовременно в клетках, подвергавшихся замораживанию уровень фер-знтативной активности значительно уменьшался. Дополнительным утверждением устойчивости изучавшихся ферментов явились резуль-ітьі, полученные при исследовании активности ферментов в гомогена-IX из замороженных срезов печени, почек и сердца, которые подверга-ісь различным режимам замораживания - отогрева. Установлено, что зависимо от применявшихся режимов замораживания - отогрева, сумірная ферментативная активность оставалась без существенных изме-$ний. Полученные результаты дают основание считать, что снижение ітивности гликолитических ферментов в составе тканей и изолированных клеток после действия низких температур обусловлено уменьшением внутриклеточного содержания каталитических белков в результате их выхода в экзоцеллюлярнуто среду через поврежденную замораживанием клеточную мембрану и не связано с изменением их функциональных свойств, в этих условиях.
Снижение активности ферментов углеводно-фосфорного обмена в данных исследованиях, очевидно, подобно освобождению лизосомальных ферментов из состава лизосом 34,184.7 и растворимых митохондри-альных ферментов из митохондрий Г 7 J в процессе замораживания -оттаивания этих органелл.
По мнению ряда авторов /"47,83,117 7 освобождение из клетки мембраносвязанных ферментов является результатом полного нарушения целостности мембранного барьера проницаемости и свидетельствует, по-видимому, о необратимости повреждения соответствующих органелл или клетки в целом.
Сейчас уже экспериментально доказано, что при действии низких температур наиболее чувствительными структурами клеток являются биологические мембраны, что обусловлено их сложной структурной организацией, обеспечивающей направленность и скорость протекания клеточной функции Г119 J,
В настоящее время в процессе замораживания выделяют три основных уровня, вызывающих повреждение мембранных структур клеток: I. Физико-химический, проявляющийся в изменении рН, повышении концентрации электролитов, действия осмотических факторов; 2. Термодинамический - проявляющийся в ослаблении гидрофобных взаимодействий, а также фазовых переходах липидов.
