Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА І. Криоконсервирование клеток костного мозга под защитой ПЭО -400
1.1. Причины криоповреждения миелокариоцитов 11
1.2. Криопротекторное действие ПЭО-400 18
ГЛАВА 2. Биологические эффекты ультразвуковых и криоультразвуковых воздействий
2.1. Ультразвуковые воздействия 23
2.2. Криоультразвуковые воздействия 35
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследований
3.1. Объект исследований 42
3.2. Оценка морфо-функциональных характеристик клеток костного мозга 43
3.3. Замораживание и деконсервирование образцов 46
3.4. Ультразвуковые и криоультразвуковые воздействия 48
ГЛАВА 4. Влияние ультразвука на миелокариоциты
4.1. Влияние параметров ультразвуковой обработки и состава среды на сохранность клетов 56
4.2. Влияние ультразвуковой обработки на ультра-структуру ядерных клеток костного мозга 65
4.3. Последействие ультразвукового облучения 72
ГЛАВА 5. Замораживание миелокариоцитов, предварительно обработанных ультразвуком
5.1. Влияние продолжительности экспозиции клеток с ПЗО-400 76
5.2. Влияние температурных режимов экспозиции и облучения ультразвуком 83
5.3. Влияние концентрации криопротектора 88
5.4. Ультраструктурные и цитохимические характеристики щелокариоцитов 90
ГЛАВА 6. Замораживание костного мозга в ультразвуковом поле
6.1. Влияние ультразвуковых воздействий на морфо-функциональное состояние замораживаемых мие л окариоцитов . 97
6.2. Влияние ультразвука на скорость возникновения зародышей льда 105
6.3. Влияние ультразвука на линейную скорость кристаллизации 109
6.4. Влияние ультразвука на перераспределение клеточных элементов в замораживаемой суспензии.
ГЛАВА 7. Влияние ультразвука на миелокариощты в период деконоервирования клеточной суспензии
7.1. Ультразвуковая обработка в процессе размораживания 118
7.2. Облучение ультразвуком размороженных клеточных суспензий 127
Заключение 139
Выводы 148
Внедрение результатов в практику 149
Литература 150
- Причины криоповреждения миелокариоцитов
- Влияние ультразвуковой обработки на ультра-структуру ядерных клеток костного мозга
- Влияние температурных режимов экспозиции и облучения ультразвуком
- Влияние ультразвуковых воздействий на морфо-функциональное состояние замораживаемых мие л окариоцитов
Введение к работе
Замораживание и последующий отогрев в большинстве случаев оказывает сильное повреждающее действие на биологические объекты. Степень повреждения их структур определяется в основном такими факторами как величина кристаллов льда [12б] , продолжительность пребывания клеток в гипертонических средах [225] , обезвоживание клеток [238] , внутриклеточная кристаллизация [235] , рекристаллизация [228] , агрегация и денатурация клеточных белков [l4].
Под влиянием непосредственного воздействия данных факторов у клеток возникают первичные криоповреждения: изменение формы, объема, нарушение целостности мембраны, изменение конформации макромолекул и др. Первичные криоповреждения могут явиться причиной вторичных повреждений, которые развиваются в клетках в различное время после размораживания.
Важность вопросов, связанных с повышением эффективности существующих и разработкой новых способов криоконсервирования биологического материала, обусловливает необходимость всестороннего изучения возможностей увеличения криорезистентности биологических объектов и изыскания способов дополнительной криозащиты их структур [69,80,109] .
В связи с этим в криобиологии наряду с совершенствованием таких традиционных подходов, как определение рациональных для каждого объекта криозащитных сред и режимов криоконсервирования все чаще изучаются возможности использования физических факторов, способных оказывать на криолабильные структуры биологических систем обратимо модифицирующие воздействия. К таким факторам относится и ультразвук (УЗ) низкой интенсивности. Применение ультразвука в медицинских и биологических исследованиях охватывает диапазон его интенсивностей от единиц мВт-см до тысяч Вт-см ,
частоты от десятков кГц до сотен МГц, в импульсном и непрерывном режимах с длительностями озвучивания от мс до многих суток, в экспериментах in vlVO ж In vltr-0, при локальной обработке отдельных органов и при озвучивании больших участков организма [l30] . Наблюдаемые реакции биологических систем на действие этого фактора при таком разнообразии экспериментальных условий многогранны.
Столь же многогранные отклики биологических систем, по-видимому, можно получить и при комбинированном применении ультразвуковых и низкотемпературных воздействий. Подтверждением этому могут служить ряд экспериментальных работ, в которых получены при использовании фактически одинаковых по параметрам ультразвуковых воздействия совершенно противоположные по характеру реакции биообъектов: увеличение чувствительности биологических структур к действию низких температур [ 99,121] и повышение их криорезистент-ности [26,37] . Тем не менее для реализации на практике таких криобиологических эффектов ультразвука необходимо иметь четкие представления о.; суммарных реакциях биологических структур на одновременное действие ряда физико-химических факторов, проявляющихся в облучаемых ультразвуком криобиологических системах.
Если реакции биообъектов на раздельные ультразвуковые и низкотемпературные воздействия изучены хорошо на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях, то возможности целенаправленного влияния на криоконсервируемые объекты с помощью УЗ-воздействий изучены недостаточно. Эффект увеличения криорезистентности получен на весьма ограниченном наборе биологических объектов: мужских половых клетках [24] и безъядерных клетках крови[_Ъ1] .
Практически не освещены возможности аналогичного использования ультразвука при криоконсервировании соматических ядерных клеток, хотя большинство из них имеют довольно высокую криолабиль-
ность.
Не изучены и механизмы ультразвукового воздействия на криобиологические системы.
Учитывая это, целесообразно исследовать возможности применения УЗ-облучений для оптимизации условий низкотемпературного консервирования такой гетерогенной (с точки зрения морфологии, функции, гистогенеза и криорезистентности) популяции ядерных клеток, как популяция миелокариоцитов.
Это позволит повысить эффективность способов замораживания и отогрева кроветворных клеток, сохранность которых в большинстве случаев не превышает 50-70$ [75,92,Ю4Д4б] и выявить подходы к использованию УЗ-воздействий при криоконсервировании весьма крио-лабильных биологических систем, состоящих из ядерных клеток.
В связи с этим цель настоящей работы - анализ, обобщение и развитие представлений о механизмах комбинированного действия ультразвука и низких температур на клеточные структуры и изуче-. ние возможности, применения УЗ-воздействий для оптимизации условий низкотемпературного консервирования ядерных клеток костного мозга.
В задачи исследования входило:
Изучение влияния ультразвуковых облучений, проводимых во время подготовки к замораживанию, замораживания и деконсервиро-вания костного мозга, на структурное состояние миелокариоцитов.
Определение оптимальных режимов УЗ-воздействий, необходимых для повышения устойчивости ядерных клеток костного мозга в процессе криоконсервирования.
Исследование механизмов ультразвукового влияния на криобиологические системы.
Анализ литературы свидетельствует о том, что биологические
эффекты ультразвука и низких температур определяются множеством факторов, таких как время и интенсивность воздействия, временная и пространственная структура звукового поля, физиологическое состояние объекта, качественный и количественный состав среды, внешние условия и т.п. Ввиду того, что такое число переменных затрудняет анализ их влияния, в данной работе поочередно рассмотрены зависимости эффекта от величины наиболее часто варьируемых в экспериментах параметров ультразвукового воздействия (частота, интенсивность, время облучения) на фоне стандартных манипуляций с клеточными суспензиями, проводимых при криоконсервировании костного мозга под защитой ПЭО-400.
В связи с тем, что в литературе имеются лишь отрывочные данные о реакциях клеток костного мозга на ультразвуковые воздействия [,187,200-202] , ряд исследований был направлен на выяснение возможных структурных и функциональных изменений, возникающих в миелокариоцитах при варьировании параметров и условий ультразвукового воздействия, и на выбор безопасных доз ультразвуковой обработки.
В результате проведенных исследований впервые получены сведения о влиянии на структурно-функциональные показатели ядерных клеток костного мозга комбинированных воздействия ультразвука и низких температур (при различных их сочетаниях), которые позволили установить факт положительного влияния УЗ-облучений на сохранность миелокариоцитов в процессе криоконсервирования.
Показано, что резистентность ядерных клеток костного мозга к УЗ-воздействиям коррелирует с их криорезистентностыо и повышается при обработке клеток ПЭО-400.
Установлено, что облучение деконсервируемых миелокариоцитов ультразвуком низкой интенсивности снижает проницаемость их мемб-
ран для эозина и некоторых ферментов, а также способствует частичной репарации поврежденных клеточных структур.
Выявлено влияние данного физического фактора на защитное действие ПЭО-400 для криоконсервируемых миелокариоцитов,
Изучено влияние ультразвука на кинетику кристаллизации модельных систем и клеточных суспензий.
Основные положения, выносимые на защиту:
Ультразвуковая обработка костного мозга во время экспозиции его с ПЭО-400 и в процессе замораживания, усиливая защитное действие этого криопротектора на миелокариоциты в первом случае и оказывая влияние на их взаимодействие с растущими кристаллами льда - во втором, повышает сохранность данных клеток при криокон-сервировании.
Облучение ультразвуком низкой интенсивности деконсервируе-мых миелокариоцитов повышает барьерные свойства их мембран, способствует частичной репарации поврежденных клеточных структур и оказывает декомпактизирующее действие на клеточные конгломераты, возникающие в процессе криоконсервирования.
Устойчивость ядерных клеток костного мозга к УЗ-воздейст-виям находится в прямой зависимости от их криорезистентности и повышается при обработке этих клеток ПЭО-400.
Выполненные исследования являются частью научной работы Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР по теме "Изучение влияния физических и химических факторов на кинетику некоторых процессов, протекающих в клетках и тканях при криоконсерви-ровании с целью усовершенствования способов замораживания" (номер государственной регистрации 79015698).
В процессе их выполнения разработан новый подход для повышения эффективности криоконсервирования ядерных клеток, основанный
на дополнительном использовании ультразвуковых воздействии.
Разработаны оптимальные режимы ультразвуковой обработки миело-кариоцитов в процессе подготовки к замораживанию, во время замораживания и в период деконсервирования, необходимые для повышения устойчивости данного вида клеток к действию низкотемпературных факторов, а также частичной репарации повреждений, возникающих в криоконсервированных клетках.
Установлена связь между криорезистентностью миелокариоцитов и их устойчивостью к ультразвуковым воздействиям, а также показана возможность увеличения данной устойчивости обработкой клеток ДЭО-400.
Эти данные могут использоваться при разработке новых способов криоконсервирования ядерных клеток, отбора клеточных суспензий с целью криоконсервирования и сонопротекции биологических структур.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Взаимодействие ультразвука с биологической средой" (Пущино, 1979), семинаре "Изменение структуры и свойств водных систем под влиянием физико-химических воздействий" (Киев, 1980), Ш Всесоюзной конференции "Ультразвук в биологии и медицине" (Ташкент, 1980), I Украинском съезде гематологов и трансфузиологов (Харьков, 1980), Научно-практической конференции "Эффективность использования современных технических средств в медико-биологических исследованиях" (Харьков, 1980), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Ультразвук в биологии и медицине" (УЕИОМЕД-5, Пущино,1981), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной конференции "Взаимодействие ультразвука с биологической средой" (Ереван, 1983), П Всесоюзной конференции по теоретическим и при-
кладным вопросам криобиологии (Харьков, 1984).
Основные положения, результаты и выводы диссертации опубликованы в открытой печати в 15 научных работах.
Полученные результаты легли в основу изобретений:
А.с. 822799 (СССР), "Способ консервирования клеточных суспензий" ;
А.с. 997649 (СССР), "Способ размораживания биологических объектов";
А.с. 9578II (СССР), "Способ деконсервирования клеточных суспензий";
А.с. III0430 (СССР), "Устройство для замораживания и отогрева биологических объектов".
Работа состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований с обсуждением результатов, заключения, выводов, раздела "Внедрение в практику", списка цитированной литературы.
Причины криоповреждения миелокариоцитов
Сравнительная оценка состояния клеток костного мозга, хранящегося при субнулевых температурах (+4...-2С), показывает, что за счет дегенерации и гибели менее стойких клеточных элементов суспензии очень быстро изменяется ее качественный и количественный состав 75,114] .
По данным А.Г.Федотенкова и соавторов [l44] некробиотические изменения в миелокариоцитах, хранящихся при 0С в среде ЦОЛИПК-З, наступают спустя трое суток от начала консервирования. Однако электронно-микроскопические исследования выявляют определенные изменения субмикроскопической структуры клеток уже спустя сутки от начала хранения их в этих условиях [92] .
Так как жизнеспособность миелокариоцитов во многом зависит от состава консервирующей среды [ ИЗ] , рациональный подбор ее компонентов позволяет несколько замедлить эти процессы [ 50 ] . Тем не менее многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что консервирование костного мозга в жидких средах позволяет хранить его в диапазоне субнулевых температур не более 5-8 суток [88,143,145] . Более продолжительное консервирование этих ..клеток возможно только при более низких температурах.
Однако опыты замораживания миелокариоцитов непосредственно в консервирующих растворах (без применения криопротекторов) не обеспечили достаточной сохранности их структур, несмотря на существенное варьирование режимов охлаждения и отогрева [ 138J .
Мнения-авторов по вопросу криорезистентности различных гемопоэтических клеток существенно расходятся.
Согласно электронно-микроскопическим исследованиям наименее криорезистентны молодые клетки гранулоцитарного ряда 92 J .
По данным 6ои-ГОпсІе[і7з] большей криолабильностью характеризуются зрелые клетки миелоидного ряда, а лучше всего сохраняются развивающиеся, в частности ретикулярные клетки. Высокая травмати-зация зрелых клеток в процессе замораживания - отогрева отмечена и в ряде других работ [l76,236j .
В то же время С.С.Лаврик[ 75 J считает, что из клеток белого ряда наиболее устойчивы к действию низких температур палочко-сег-ментоядерные нейтрсфилы, а раньше всех разрушаются промиелоциты и миелоциты.
Основной причиной повреждения биологических структур в процессе криоконсервирования является смена фазовых состояний в образце [бб] . В связи с этим многие авторы при замораживании клеточных суспензий костного мозга акцентируют внимание на температурном диапазоне -3 ... -70С [92,I06,I46J . Медленное охлаждение клеточной суспензии в данной температурной зоне приводит к формированию в межклеточном пространстве крупных кристаллов льда [ 92 ] . В межкристаллических каналах возникают гиперконцентрации солей, происходит сильное обезвоживание клеток [223,237-239j .
Непосредственных механических травм клеток внеклеточными кристаллами льда не наблюдали [ 122 J , поэтому некоторые исследователи полностью отрицают механическую травму, как причину гибели клетки [2241 . С помощью криомикроскопических исследований показано, что кристаллы льда не разрушают гемопоэтические клетки, а лишь иногда деформируют их мембраны. К повреждениям быстрее всего приводят сжатие клеток в межкристаллических каналах и деформация .мембран при захвате клеток растущими кристаллами льда 17, 122,244] Оценка величины переохлаждения протоплазмы клеток в кристаллизующейся суспензии показала, что переохлаждение клеток, захваченных растущими кристаллами льда, меньше, чем клеток, располагающихся в каналах [ 5б] . Следовательно степень дегидратации клеток, захваченных кристаллами, и клеток, находящихся в межкристаллических каналах, будет различной.
По мнению авторов [92 J , дегидратационные процессы являются одним из основных факторов повреждения гемопоэтических клеток при замораживании.
Резкая дегидратация может привести к соприкосновению внутриклеточных структур, которые в нормальном состоянии отдалены друг от друга. В результате этого происходит формирование химических связей, отсутствующих в нативных биологических системах 237] .
По данным работ [74,92,166,217] обезвоживание клеток при охлаждении может оказывать действие аналогичное с дегидратирующим действием концентрированных растворов электролитов, приводя к замене в белковых молекулах S"\\ на S -5 связи. Повреждающая роль таких замен для клеточных мембран показана j.evltt $ 2J2I9] и A.M.Белоусом с соавторами [її] .
Повышение концентрации органических и неорганических веществ за счет вымораживания воды многие авторы относят к первичным механизмам криоповреждений [125,133,252] . Считается, что гиперконцентрационный фактор играет существенную роль при медленных скоростях охлаждения [234] . Возникновение гиперконцентрированных растворов в замораживаемой буферной системе может сопровождаться выпаданием в осадок некоторых ее компонентов, что сразу же сказывается на величине рН этой системы. Отклонение рН от оптимальных значений в свою очередь вызывает ряд необратимых изменений в биологических структурах [92] . Дополнительным повреждающим фактором могут выступать изменения осмотического давления, обусловленные вымораживанием воды и ростом концентрации осмотически активных веществ 126,241] . Только резкое снижение температуры суспензии от +37С до 0С может приводить, по данным Ф.И.Осташко 96 J , к падению осмотического давления внутри клетки на 1,1-10 Н«м , в то время как для возникновения осмотического шока достаточно, чтобы давление изменилось всего на 6,1-104 - 7,1-Ю4 И-м 2. В случае охлаждения суспензии клеток с большой скоростью вода не успевает выйти из клетки и возрастает вероятность возникновения внутриклеточной кристаллизации 239] . Интенсивность повреждающего действия внутриклеточных кристаллов зависит от их формы, размеров, количества и скорости кристаллизации 244,256 J. Однако образование внутриклеточного льда не всегда вызывает повреждения клеточных структур. При высоких скоростях охлаждения в зоне кристаллообразования идет рост мелких кристаллов, что уже само по оебе снижает криоповреждаемость клеток [ 100] . Кроме того, степень повреждения внутриклеточными кристаллами, вследствие увеличения их размеров на этапе рекристаллизации, резко снижается по мере возрастания скорости отогрева суспензии [іОЗ, 214] . Для ядерных клеток зависимость выживаемости от скорости отогрева начинает проявляться, если скорость их замораживания превышает 1,6 С-с"1 [Ю2] .
Влияние ультразвуковой обработки на ультра-структуру ядерных клеток костного мозга
Отличия в чувствительности клеток к ультразвуковому воздействию связаны с их морфологическими особенностями и функциональными состояниями. В первую очередь резистентность клеток к ультразвуку определяется структурой их клеточной мембраны в наибольшей степени подверженной влиянию факторов, действующих в ультразвуковом поле.
Клеточные мембраны подвергаются периодическим механическим воздействиям действию акустических потоков, возникающих как внутри, так и вне клеток. Напряжения сдвига за счет этих потоков могут достигать величин 10 ... 10 хН;см в то время как уже на-пряжения 10 иН»см вызывают увеличение проницаемости цитоплаз-матических мембран [б,179] , понижают поверхностный заряд кле -ток, увеличивая скорость их оседания в поле гравитационных сил t199J , и изменяют поверхностную энзиматическую активность[242]. Подтверждением возникновения механических напряжений в цитоплаз-матических мембранах служат экспериментальные факты об изменении формы клеток при кратковременном их облучении ультразвуком [18б].
Присутствие в среде микропузырьков газа резонансных размеров значительно увеличивает эффективность ультразвукового воздействия. Свободные газовые пузырьки возбуждают около себя интенсивные акустические течения [87] . Теоретические оценки указывают на возможность возникновения течений около пузырьков со скоростями 0,1 ... 1,0 м-сек"1 [88] .
Однако самого факта появления пульсирующих газовых пузырьков в среде еще недостаточно для разрушения клеток. Эффект начинает проявляться, если амплитуда пульсаций возрастает до определенной величины. Этот предел различен для различных клеток и зависит от размеров клетки, ее формы и от прочности цитоплазматической мембраны. Так, выход гемоглобина из эритроцитов в ультразвуковом по-, ле частоты 20 кГц происходит при увеличении амплитуды колебаний пульсирующих пузырьков до 15-20 мкм [ 168] в то время как разрушение лейкоцитов начинается при 8 мкм [l83J .
Наблюдались также случаи, когда ультразвуковые воздействия вызывали лизис клеток печени крыс (I МГц; 2,5 Вт«см" 2; 3-I02c)[262j и разрушение ядер клеток Неба (0,75 МГц; 2 Вт. см-2) Q270,271 ] , не нарушая при этом целостности цитоплазматических мембран. Первопричиной этих разрушений были нарушения в мембранах внутриклеточных органелл.
Специфические нарушения ядер клеток при сохранности цитоплазматических мембран не могут обусловливаться кавитацией и микропотоками и предположительно объясняются возникновением резонансных волн на поверхности ядерных мембран [270,271J .
Под действием ультразвуковых воздействий (0,8 и 2 МГц; 0,5 ... 3 Вт-см ; 1,2-10 ... 6-10йс). наблюдали также изменение числа гранул гликогена в клетках, нарушение целостности эндоплазмати-ческого ретикулума, увеличение количества лизосом, изменение структуры митохондрий [ 10,265] .
Поражающее действие ультразвуковых колебаний на один и тот же объект при равных интенсивностях увеличивается с уменьшением их частоты. Так, при воздействии на амебы ультразвука с частотой 1,0 МГц половина их погибала за 6«10лс (10 мин) при интенсивное-ти 200 Вт-см , а на более низких частотах (20 ... 40 кГц) при той же экспозиции разрушение всех клеток происходило уже при ин-тенсивностях 10-100 Вт-см -2 [ 182,196,197,246] .
Однако исследование зависимости скорости разрушения клеток крови от частоты ультразвука не дало однозначных результатов. наблюдали максимальную скорость гемолиза эритроцитов при частоте 0,1 МГц, обнаружил максимум их гемолиза в области частот 0,3 ... 0,6 МГц. В.Б.Ако-нян [б] отмечает, что при равных интенсивностях ультразвука скорость гемолиза клеток при частоте 2,6 МГц значительно ниже, чем при 0,88 №Гц. (2.%орпоп иУ&птМОІ 84,185] полагают, что скорости гемолиза эритроцитов тем меньше,чем выше частота ультразвуковых колебаний. Механизм разрушения клеток при высоких частотах имеет также в основном механическую природу [203 ] . Облучаемые клетки начинают разрушаться не сразу же после включения ультразвука и процесс разрушения заканчивается не мгновенно после его выключения. Чем выше интенсивность ультразвука, тем короче промежуток времени между началом воздействия и началом процесса разрушения и тем длительнее последействие [32j . Разрушению структуры клеток предшествуют заметные изменения их физиологического состояния. Как физический фактор ультразвуковые колебания способны вызвать в биологических объектах целый ряд структурных, физиологических и физико-химических изменений. При этом помимо непосредственного действия на клетки ультразвук может вызывать физико-химические изменения и в окружающей их среде. Переменные напряжения акустического поля.докавитационных ин —о тенсивностей (0,05 ... 0,3 Вт см ; I МГц) вызывают расшатывание структур клеточных мембран и десорбцию с поверхности молекул белков и гликопротеинов, что подтверждается изменениями энзима-тической активности поверхности эритроцитов [43,114,242J , потерей лимфоцитами и соматическими клетками человека, антигенов, связанных с мембранами, повышением адгезивных свойств клеток, появлением во внешней среде заметных количеств гликопротеинов [156, 248,249] .
В.Б.Акопяном [б] было показано, что при обработке суспензии эритроцитов (17 000 клеток в мм ) в физиологическом растворе ультразвуком интенсивностью 0,05 Вт«см (0,9 МГц) в первую же минуту с поверхности каждой клетки десорбируется 2 І0""і4г вещества белковой природы (масса эритроцита ю 1иг). Дальнейшее облучение ультразвуком не приводило к повышению, в среде концентрации де сорбированного вещества. После прекращения ультразвукового воздействия "смытые" макромолекулы в течение нескольких минут сорбировались на поверхности клеток. Скорость оседания эритроцитов увеличивается уже при интенсив нос тях ультразвука 8 мВт «см (I МГц), что свидетельствует, вероятно, об уменьшении их поверхностного заряда l95] .
Влияние температурных режимов экспозиции и облучения ультразвуком
При клинической апробации этого способа лечения было установлено, что в группе больных, которым область раковой опухоли обра-батывали ультразвуком 0,4 ... 0,5 Вт»см за 3 мин до криовоз-действия, некрозы развивались ко второму - четвертому днЮ, в то время, как в контрольной группе - лишь к четвертому-шестому дню С99] . При этом средние величины зон некрозов и замораживания в первой группе находились в отношении 1:1, во второй -1:2.
Другой группой исследователей [ІІ7-ІІ9Д2І] на аналогичных (опухолевых) объектах была показана возможность усиления крио-деструкции за счет охлаждения ткани до -196С и последующего ее оттаивания непосредственно в ультразвуковом поле небольшой интенсивности (0,4 ... 2,0 Вт-см""2). По выраженности деструктивных изменений изученные режимы криоультразвуковых воздействий располагались в следующем убывающем порядке: I) облучение ультразвуком присутствовало и на этапе замораживания, и на этапе оттаивания; 2) облучение ультразвуком присутствовало только на этапе оттаивания; 3; облучение ультразвуком проводилось только на этапе замораживания [ 58,12l] .
Высокую жизнеспособность опухоли при самых различных неблагоприятных воздействиях обычно связывают с гетерогенностью ее клеточного состава, с присутствием в популяции весьма резистентных клеток. Предполагают, что при совместных криоультразвуковых воздействиях [ 121J точно так же как и при последовательных 158J , имеет место неспецифическая сенсибилизация ультразвуком популяции опузолевых клеток к действию низких температур. Неспецифическая стимуляция метаболизма ультразвуком, по-видимому, влечет за собой целую цепь событий, в результате которой популяция опухо-; левых клеток оказывается в уязвимом состоянии: ускоряется движение клеток по митотическому циклу, кратковременно расходуются различные клеточные резервы, количество эндогенных протекторов - (в том числе и криопротекторов) стабилизирующих клеточные структуры, изменяются физико-химические параметры клеточных компонентов [35,99] .
При замораживании и отогреве ткани в ультразвуковом поле степень криодеструкции усиливается за счет механического фактора. Эти повреждения связывают с влиянием микропотоков, возникающих на акустических неоднородностях, роль которых выполняют зародыши кристаллизации и микроскопические газовые пузырьки. В качестве дополнительных факторов, усиливающих степень криодеструкции, авторы [ 118] рассматривают возникновение под действием ультразвука мелкодисперсной кристаллической структуры и ультразвуковую интенсификацию процессов расстеклования и рекристаллизации. Возможно, что в последний процесс может включаться и макромолеку-лярная структура. Считается, что вследствие указанных причин происходят повреждения субклеточных структур (ядер, митохондрий, лизосом, мембранных образований), которые отрицательно сказываются на жизнеспособности клеток.
Наряду с этим механический и тепловой факторы ультразвукового поля рассматриваются в некоторых криобиологических ситуациях как дополнительные факторы, способствующие повышению сохранности биологических структур [8,48,49] . К тому же и стимулирующий эффект, возникающий при воздействии ультразвука на замораживаемую или размораииваемую живую ткань, зачастую приводит к ускорению восстановительных процессов в клетках поврежденных замораживанием. Так, к примеру, 3-4-х кратная ультразвуковая обработка (3 МГц; 0,5 Вт. см ; 3«1(Гс) тканей уха кролика, поврежденных криохирургическим инструментом, вызывает заметное ускорение в них синтеза каллогена[ 273J , а аналогичное однократное облучение опухолевого очага ультразвуком (880 кГц; 0,4 ... 0,5 Вт-см"2 ) наряду с усилением криодеструкции опухолевых клеток, ускоряет процесс регенерации нормальных клеток, что в среднем на 10 дней уменьшает срок полной эпителлизации ран, возникающих за счет криовоздействия [ 99,157] .
Так как вопросы, связанные с увеличением сохранности биологических структур в процессе замораживания и обеспечения необходимых условий для репарации возникающих при этом криоповреждений являются основными проблемами криобиологии, эти проявления ультразвуковых воздействий находят применение при разработке способов криоконсервирования биообъектов.
Так, замора живание спермы сельскохозяйственных животных в ультразвуковом поле (880 кГц; 0,1 ... 0,2 Вт см"2) позволило повысить среднюю активность половых клеток на 0,8 ... 2 балла]_24, 26,29,269] .
При этом абсолютный показатель живучести и время переживае-мости спермы, замороженной с одновременным облучением ультразвуком, также были выше, чем у спермы, которую замораживали без ультразвуковой обработки.
Положительное действие ультразвуковых колебаний на процесс замораживания спермиев авторы объясняют многосторонним влиянием ультразвука на клетки и окружающую их среду. Это прежде всего стимулирующее действие на спермин [_22,232 І, в основе которого лежит активизация ультразвуком биологически важных процессов обмена веществ и энергии, повышающее их стойкость к неблагоприятным внешним воздействиям. Помимо этого прямого влияния на клетки ультразвуковые колебания облегчают процесс подготовки к предстоящему замораживанию, повышая проницаемость их цитоплазматических мембран для криопротектора [ 23 J . С другой стороны, ультразвук диспергирует лецитин яичного желтка, присутствующий в разбавителе, и формирует мельчайшие замкнутые пузырьки из биомолекулярных липидных слоев [l89J . Однако фазовых изменений при этом не происходит и лецитин сохраняет прежнюю ламелярную структуру [l78J , хорошо предохраняющую мембраны спермиев от температурного шока. Во время снижения температуры ультразвуковые колебания стабилизируют процесс фазового перехода вода - лед, создают дополнительные центры кристаллизации в замораживаемой сперме и тем самым снимают глубокое ее переохлаждение, формируя равномерную мелкокристаллическую структуру льда [ 25 ] .
Влияние ультразвуковых воздействий на морфо-функциональное состояние замораживаемых мие л окариоцитов
Через 20...30 мин пропитывания клетки заливали отверждаемой средой еще на такое же время и после этого их распределяли в заливочные капсулы, заливали свежей средой и выдерживали 24 часа в термостате при температуре +60С.
Полимеризованные блоки затачивали и ультрамикротомировали на ЖГП. Ультратонкие срезы монтировали на палладированные сеточки и окрашивали в насыщенном водном растворе уранилацетата. После промывки в дистиллированной воде срезы окрашивали цитратом свинца по методу Рейнольдса [ііб] .
Окрашенные срезы дважды промывали и после высушивания изучали в электронном микроскопе ЭИВ-ЮОА или ЭМВ-ЮОБР.
В опытах по изучению переживаемости ядерных клеток во времени, суспензию костного мозга помещали в герметически закрытых флаконах в холодильник и хранили их в гипотермических условиях (при +4С), периодически оценивая морфо-функциональное состояние мие-локариоцитов. Подготовка образцов костного мозга к замораживанию включала в себя введение в клеточную суспензию определенного количества 50$ раствора ПЭ0-400 и экспозицию клеток с этим веществом в течение ЗОмин [92] . Рабочий 50% раствор ПЭО-400 приготавливали путем смешивания исходного раствора с 0,1 М раствором фосфатного буфера (рН 7,0) в соотношении 1:1. Поскольку в системе вода - ПЭО равновесие устанавливается медленно [47] , для получения однородных смесей растворение ускоряли нагреванием до +40...+50С, либо выдерживали при комнатной температуре в течение нескольких дней. Криопротектор к суспензии клеток добавляли в охлажденном виде небольшими порциями, тщательно перемешивая суспензию. Образцы костного мозга замораживали в полиэтиленовых ампулах объемом 2 см по стандартной двухэтапной программе, охлаждая их со скоростями: 1,6 10" С«с" - на первом этапе (до -15С) и 3,3 ... б.О -с"1 - на втором этапе (от -15С до -I96C) [l05, 106,149] . Первый этап охлаждения осуществляли в специальном устройстве второй - погружением ампул с суспензией непосредственно в жидкий азот. По окончанию замораживания образцы переносили в бункер, наполненный жидким азотом, где они хранились в течение необходимого времени.
При определении числа возникших центров кристаллизации исследуемую среду разбивали на большое число малых изолированных между собой частичек (капель). Для этих целей использовали генератор аэрозолей аналогичный описанному в работе 151j . Капли взвешивали в смеси вазелинового масла с нептаном (1:1) и охлаждали под микроскопом в специальной ячейке с излучателем ультразвука, Размер капель в.экспериментах колебался в пределах 30 ...50 мкм. Замораживание исследуемых образцов и поддержание заданной температуры в течение эксперимента производили парами жидкого азота. Температуру контролировали медь-константановой дифференциальной термопарой. Зародыши, превратившиеся в центры кристаллизации, за-кристаллизовывали те капли, в которых они возникали. Закристаллизовавшуюся каплю в дальнейшем считали одним центром кристаллизации. Скорость охлаждения образцов была близкой к скорости охлаждения суспензий костного мозга на первом этапе замораживания. При достижении определенного переохлаждения подсчитывали в поле зрения микроскопа число закристаллизовавшихся капель. Сравнивая результаты определения количества закристаллизовавшихся капель без ультразвука и с ультразвуком определяли увеличение д/о, под действием данного физического фактора.
Линейную скорость кристаллизации определяли по времени прохождения кристаллизационным фронтом определенного расстояния. Предназначенные к размораживанию ампулы вынимали из бункера и быстро (в течение 5-Ю с) помещали в размораживатель. Для равномерного отогревания образцы подвергали постоянному покачиванию с частотой 1-2 Гц. Чтобы не допускать перегрева клеток размораживание осуществляли до полного исчезновения в суспензии твердой фазы. Во времени это обычно составляло ЪКг - 1,2 «Иге, а тем-пература образца за этот промежуток повышалась до +2 ... +5С.
Размороженную суспензию клеток переносили из ампул в стеклянный флакон и при необходимости проводили мероприятия по реабилитации деконсервированных миелокариоцитов. При использовании деко нсервированного костного мозга в опытах in vitxo криопротек-тор удаляли из суспензии. Для этого к размороженным миелокарио-цитам добавляли по каплям раствор среды ЦОЛИПК-3 в соотношении 1:5 после чего образцы центрифугировали 10 мин со скоростью 800-1000 . Полученный осадок ресуспендировали в цельной сыворотке ІУ группы [263] .
