Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Холестерин биологических мембран 9
1.1.1. Холестерин как структурный компонент биомембран 9
1.1.2. Влияние холестерина на активность мембраносвязанных ферментов 14-
1.1.3. Участив холестерина биомвмбран в регуляции процессов клеточной пролиферации 19
1.2. Холестерин и канцерогенез 23
1.2.1. Холестерин плазмы крови и развитие новообразований 23
1.2.2. Регуляция биосинтеза и распада холестерина в опухолевых клетках 25
1.2.3. Холестерин плазматических мембран опухолевых клеток 27
Глава 2. Материалы и методы 35
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Сравнительное исследование содержания ли-пидов в нормальных и в опухолевых клетках. 48
3.2. Встраивание и выведение холестерина из плазматических мембран опухолевых и нормальных клеток с помощью липосом 50
3.2.1. Характеристика липосом 50
3.2.2. Изменение липидного состава опухолевых и нормальных клеток при встраивании и выведении холестерина из плазматических мембран 52
3.3. Изменение микровязкости липидов мембран опухолевых и нормальных клеток при встраивании и выведении холестерина 60
3.1. Активность Иа, К-АТФазы и 5-нуклеотидазы при изменении отношения холестерин/фосфолипиды в опухолевых и нормальных клетках 65
3.5. Влияние встраивания холестерина в плазматические мембраны клеток гепатомы Зайделя, опухоли яичников и лимфобластного лейкоза L 1210 на их перевиваемость 73
Глава 4. Обсуждение результатов 80
Выводы 89
Список литературы 90
- Холестерин как структурный компонент биомембран
- Холестерин плазматических мембран опухолевых клеток
- Изменение липидного состава опухолевых и нормальных клеток при встраивании и выведении холестерина из плазматических мембран
- Активность Иа, К-АТФазы и 5-нуклеотидазы при изменении отношения холестерин/фосфолипиды в опухолевых и нормальных клетках
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование изменений плазматических мембран клеток при канцерогенезе является одной из актуальных задач современной онкологии. Микровязкость липидной фазы плазматической мембраны является существенным фактором регуляции внутриклеточных процессов (Finean et al, 1978). Трансформация ( Burger, 1973; Van Blitterwizk e.a,1977), рост ( Collard et al., 1977), клеточный цикл ( De Laat et ai,I977) и дифференциация КЛвТОК ( Kanasaki et al.,I978; Coulon-Morelec,Buc-Caronf,1981) сопровождаются изменением еидкостности липидного бислоя плазматических мембран.
Одним из основных структурных компонентов липидного бислоя плазматической мембраны является холестерин ( De Duve, 1971), содержание которого в значительной мере определяет ее микровязкость (Владимиров, Добрецов, 1980).
В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает проблема роли холестерина в развитии онкологических заболеваний. Большинство литературных данных свидетельствует о снижении содержания холестерина в плазматической мембране опухолевых клеток при одновременном понижении микровязкости ее липидного бислоя ( inbar, 1980). Однако эти исследования выполнены преимущественно на лейкемических клетках. Результаты же, полученные на других опухолях противоречивы. Ряд авторов обнаружили повышение содержания холестерина в опухолевых клетках ( Phiiippot et al., 1976; Schmidt-Ullrich et al., 1976), другие - выявили снижение вГО При Канцерогенезе ( Inbar, 1980).
Все это делает необходимым более углубленное исследование
влияния холестерина на физические свойства фосфолипидного бислоя и активность ферментов плазматических мембран опухолевых клеток.
Цель работы. Целью настоящей работы было сравнительное исследование влияния встраивания и выведения холестерина на микровязкость фосфолипидного бислоя и активность ферментов плазматической мембраны клеток некоторых асцитных опухолей и нормальных клеток, а также выяснение возможного цитостатического действия встраивания холестерина в опухолевые клетки.
Конкретные задачи исследования:
Измерить содержание холестерина, фосфолипидов, активности Na, К-АТФазы и 5'-нуклеотидазы в опухолевых и нормальных клетках.
Исследовать изменение отношения холестерин/фосфолипиды в опухолевых и нормальных клетках при экспериментальном встраивании и извлечении холестерина.
Исследовать микровязкость фосфолипидного бислоя мембран опухолевых и нормальных клеток при изменении молярного отношения холестерин/фосфолипиды.
Выяснить взаимосвязь между микровязкостью мембран опухолевых и нормальных клеток и активностью мембраносвязанных ферментов Na, К-АТФазы и 5'-нуклеотидазы.
Выяснить влияние встраивания холестерина в клетки гепато-мы Зайделя, лимфобластноиг лейкоза Ы2Ю и асцитной опухоли яичников на их перевиваемость экспериментальным животным.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенной работы было выявлено снижение молярного отношения холестерин/фосфолипиды в мембранах клеток трех различных ти-
пов асцитных опухолей по сравнению с нормальными клетками. Полученные данные свидетельствуют о снижении активности Ыа, К-АТФазы и 5г.нуклеотидазы в расчете на миллиграм фосфолипидов в этих клетках.
Показано, что эффективность встраивания и выведения холестерина из плазматической мембраны опухолевых и нормальных клеток зависит от величины исходного показателя молярного отношения холестерин/фосфолипиды. Наиболее существенное повышение содержания холестерина наблюдалось в опухолевых клетках, для которых были характерны самые низкие исходные значения отношения холестерин/фосфолипиды.
Выявлено, что встраивание холестерина в клетки трех типов асцитных опухолей и двух типов нормальных клеток сопровождается увеличением микровязкости липидов мембран, оцененной с помощью флюоресцентных и спиновых зондов. При выведении холестерина из обогащенных им мембран наблюдалось уменьшение микровязкости фосфолипидного бислоя мембран.
Для опухолевых и нормальных клеток продемонстрирована регуляторная роль холестерина по отношению к активности ферментов плазматической мембраны Ыа, К-АТФазы и 5'нуклеотидазы. При увеличении микровязкости мембран, вследствие встраивания холестерина, наблюдалось уменьшение активности Na, К-АТФазы и 5»-нуклеотидазы, и наоборот, при снижении микровязкости липид-ной фазы мембран, обогащенных холестерином, после его выведения наблюдалось возрастание активности этих ферментов.
Положение о регуляторной роли холестерина нашло подтверждение в опытах по перевивке опухолевых клеток, в которое было встроено дополнительное количество холестерина. Обогащенные
холестерином опухолевые клетки оказались менее инвазивными по сравнению с исходными. В этой части работы продемонстрировано цитостатическое действие холестерина на клетки некоторых ас-цитвых опухолей.
Данные о сниеєнии отношения холестерин/фосфолипиды в опухолевых клетках могут быть использованы при разработке новых диагностических подходов в онкологии, а результаты по цитоста-тическому действию холестерина на опухолевые клетки - для разработки новых методов противоопухолевой терапии.
- 8 -СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДСК - дифференциальная сканирующая колориметрия РСА - рентгеноструктурный анализ ЯМР - ядерный магнитный резонанс ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ЛУК - ледяная уксусная кислота ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ТХУ - треххлоруксусная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АМФ - аденозинмонофосфорная кислота 5-ns -5-доксилстеариновая кислота *э / - соотношение интенсивностей флюоресценции энсиыеров
и мономеров лирена ФХЛ - фосфатидилхолиновые липосомы ХФХЛ - холестерин-фосфатидилинхолиновые липосомы
ЛИГ - липопротеиды ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ' ЛОВП - липопротеиды очень высокой плотности ЛНП - липопротеиды низкой плотности ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности Tt — температура фазового перехода фосфолипидов
Холестерин как структурный компонент биомембран
Согласно современным представлениям мембраны клеток млекопитающих в своем составе содержат нейтральные липиды и фосфо-липиды. Нейтральные липиды представлены исключительно холестерином, тогда как фосфолипиды весьма гетерогенны по составу. Холестерин рассматривается как структурный компонент липидного бислоя плазматических мембран клеток (De Duve, 1971). По данным многих исследователей внутриклеточные мембраны содержат значительно меньше холестерина или не содержат его вообще ( Aman-Costesec et el., 1974a, 1974b; Beafay et al., 1974a, 1974b; De Duve, 1971; Demel et al., 1972).
О структурной роли холестерина, локализованном в мембране, судят в настоящее время по взаимодействию его с другими липид-ными компонентами мембраны, - фосфолипидами. Рассматривая взаимодействие холестерина с фосфолипидами в биомембранах, следует прежде всего обратить внимание на количественное соотношение этих липидных компонентов, определяющее во многом свойства мем-бравы. Молярное отношение холестерин/фосфолипиды в плазматической мембране лимфоцитов человека и мыши равно 0,67 и 0,79, а в лейкемических лимфоцитах - 0,39 и 0,37 соответственно ( inbar, 1980). Плазматические мембраны эритроцитов, а также миелиновые мембраны нервных клеток характеризуются высоким молярным отношением ХОЛеСТврИН/фОСфОЛИПИДЫ: 0,90 И 1,30 СООТВвТСТВвННО (Dor-ling, Le Page, 1973). В искусственных мембранах возможны и более высокие соотношения холестерин/фосфолипиды. При ультразвуковом облучении суспензий фосфатидилхолина и сфингомиелина с холестерином были получены монобислойные липосомы с холесте-рин-фосфолипидным индексом, равным 3. А инкубация эритроцитов с такими липосомами приводила к увеличению этого соотношения в мембране эритроцитов С 0,9 ДО 2,7 (Cooper et al., 1978).
Природа межмопекулярных взаимодействий холестерина с фос-фолипидами исследована очень подробно. Результаты ЯМР-спектро-скопии говорят о существовании ван-дер-ваальсовых взаимодействий в комплексе холестерин-фосфолипиды, возникающих между молекулой холестерина и первыми 8-Ю метиленовими группами углеводородных цепей фосфолипидов ( Darke et al., 1972). На фосфатную и холиновую части полярной головки фосфатадилхолинов действие стерина не распространяется ( Cuius et al., I976; Мс-Intoch, 1978; Van Dijck et al., 1976).
Физическое состояние липидного бислоя в значительной мере зависит от температуры. При достаточно низких температурах липи дные бислои находятся в состоянии твердого геля. При определенной температуре ( Tt ) происходит фазовый переход фосфолипидов из L- j -кристаллической в L- -жидкокристаллическую фазу. При этом происходит плавление жирнокислотных цепей, в результате чего вращение и скручивание молекул происходит легче, ЧЄМ При НИЗКИХ температурах ( Melohior, Steim, 1976). Tt зависит от природы полярной головки, длины и степени ненасыщен-ности углеводородных цепей фосфолипида. При наличии одной и той же полярной группы Tt будет тем ниже, чем короче углеводородные цепи, чем больше степень их ненасыщенности и чем больше двойных связей будут иметь цис-, а не транс-конформацию ( Old- field, Chapman, 1972). В биологических мембранах значительная часть фосфолипидов содержит ненасыщенные цепи, поэтому температура плавления липидного бислоя ниже температуры тела и, следовательно, основная масса липидов биологических мембран находятся в жидкокристаллическом состоянии.
Одним из первых эффектов холестерина на фосфолипидный би-слой, обнаруженных в экспериментах с монослоями, был так называемый "конденсирующий эффект", заключающийся в уменьшении размеров области, занимаемой одной молекулой фосфолипида в смеси фосфолипид-холестерин ( De Bernard, 1958). Однако эксперименты, проведенные с другими фосфолипидами, установили более СЛОЕНЫЙ характер влияния холестерина на фосфолипидные слои. Холестерин оказывает конденсирующий эффект на слои насыщенных фосфатиди лхолинов, содержащих остатки жирных кислот с числом атомов углерода от 10 до 14, а также на слои ненасыщенных фосфатидил-холинов, содержащих одну молекулу ненасыщенной жирной кислоты С ЧИСЛОМ ДВОЙНЫХ СВЯЗвЙ Нв бОЛвв 4- ( Demel et al.,I972bj Chost є.є 1973). Конденсирующий эффект холестерина показан также для фосфатиди лэтаноламинов, сфингомиелинов, фосфатидилглицерина и др. ( Shah, Schulman, І967). Разжижающий эффект холестерин оказывает на насыщенные фос-фолипиды, имеющие в своем составе жирные кислоты с длинной углеродной цепью, такие как дипальмитоилфосфатидилхолин (-Стс.п), дистеарилфосфатидилхолин (-CJQ.Q), находящиеся в кристаллическом состоянии. Разжижающий эффект холестерина демонстрируется методом дифференциальной сканирующей колориметрии (ДСК) и заключается в снижении сил межмолекулярного взаимодействия и облегчении перехода липидов из кристаллического в жидко-кристалЛИЧЄСКОЄ СОСТОЯНИв (Demel et а1.,1972Ъ; Chost et al.,1973). Насыщенные фосфолипиды с короткими жирнокислотными остатками (Cq, С8) и ненасыщенные фосфолипиды, содержащие один остаток ненасыщенной жирной кислоты с 6 двойными связями, или два остатка полиненасыщенных жирных кислот не взаимодействуют с холестерином (Demel et а1.,1972Ъ; Demel, De Knuyff, 1976). Таким образом благодаря двоякому эффекту на фосфолипидный бислой, холестерин может играть роль своеобразного биологического регулятора, обеспечивающего надлежащее физическое состояние липидной части мембраны, необходимое для ее нормального функционирования (Бергельсон, 1982). Важное значение для понимания холестерин-фосфолипидного взаимодействия в биологических мембранах могут иметь данные о Сродстве холестерина К раЗЛИЧНЫМ фоСфОЛИПИДам ( De Kruyff et al., 1973; Demel et al., 1977; Nakagawa et al., 1979). При исследовании с помощью ДСК смесей фосфатидилхолина и сфингомиелина, в которых фазовый переход каждого фосфолипида осуществляется независимо от других компонентов смеси, было показано, что добавление холестерина вызывает исчезновение фазового перехода в первую очередь у сфингомиелина, что говорит о большем сродстве холестерина к сфингомиелину, чем к фосфатидилхолину. В подобных опытах было продемонстрировано большее сродство холестерина к сфингомиелину и фосфатидилхолину, чем к фосфатидилэтаноламину. Сродство холестерина к фосфолипидам уменьшается в следующей последовательности: сфингомиелин фосфатидилхолин фосфатиди ЛЭТаНОЛаМИВ фОСфатИДИЛИНОЗИТОЛ ( Demel et al., 1977; Van Dijck, 1976).
Холестерин плазматических мембран опухолевых клеток
Данные о содержании холестерина в плазматических мембранах опухолевых клеток весьма противоречивы. Наиболее хорошо в этом аспекте изучены лейкемические клетки. Показано значительное уменьшение молярного отношения холестерин/фосфолипиды в клет - 28 ках лимфомы мыши, индуцированной вирусом Молони по сравнению с нормальными лимфоцитами (Shinitzky, inbar, 1974,1976), а также и в плазматических мембранах некоторых лейкемических клеток (Koizumi et ai., 1980). Наряду с этим выявлено и значительное понижение микровязкости фосфолипидного бислоя мембран лим-фоидных клеток, что, по мнению авторов, связано с более низким
Содержанием холестерина В опухолевых клетках (lobar, Ben-Bas sat, 1976). В клетках опухоли, развивающейся в селезенке после инъекции вируса Рауса, было также найдено снижение молярного ОТНОШвВИЯ ХОЛбСТерин/фОСфОЛИПИДЫ (Moontfoort et al., 1976). Имеются данные о снижении относительного содержания холестерина В мембране ЛИМфОЦИТОВ При ЛеЙКОЗе у человека (Heiniger et al., 1976а; Maxigue, 1973;Inbar, 1980) С одновременным уменьшением МИКрОВЯЗКОСТИ ЛИПИДНОГО бИСЛОЯ ИХ мембран ( Inbar et al., 1977; Larniol et al., 1980). Практическое значение имеет тот факт, что снижение содержания холестерина в лимфоцитарной мембране у больных лейкозом сопровождалось резким снижением содержания холестерина в плазме крови. В этом аспекте представляют интерес исследования, показавшие, что инкубация лейкемических клеток человека с ЛНП сыворотки крови здоровых людей сопровождалась увеличением микровязкости мембран клеток, вследствие повышения в них относительного содержания холестерина (Petitou et al., 1978). С другой стороны, при инкубации нормальных лимфоцитов с сывороткой крови больных лейкемией наблюдается снижение микровязкости фосфолипидного бислоя клеточных мембран и уменьшение холестерин/фосфолипидного индекса. На основании полученных результатов авторы сделали заключение о том, что снижение молярного отношения холестерин/фосфолипиды в лейкозных клетках может быть следствием уменьшения содержания ЛНП в плазме крови больных лейкозом по сравнению с контролвмдр0,ш:юениго отдельных авторов, связано с плохой всасываемостью пищи у таких бОЛЬНЫХ ( Heinger et al. і 1976a).
В то же время в литературе имеются и другие данные. Обнаружено повышение молярного отношения холестерин/фосфолипиды в лимфоидных клетках морской свинки и при L2c лейкемии (Schmidt-Ullrich et al., 1976; Philippot et al., 1977). Имеются указания, что понижение микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов человека при активации их лектином не сопровождалось уменьшением относительного содержания холестерина { Тоу-oshima, Osawa, 1976). По мнению авторов, отмеченное изменение физических свойств мембраны может быть обусловлено связыванием митогена с рецепторами. Однако это предположение не подтверждается какими-либо специальными исследованиями.
Противоречивые мнения существуют в отношении перевиваемых опухолевых клеток, обогащенных холестерином. Одни авторы ( lobar, Shinitzky, 1974а; Alderson, Creen, 1975) показали замедление скорости роста опухоли при перевивке обогащенных холестерином клеток асцитной карциномы Эрлиха и лимфомы, индуцированной вирусом Молони, другие ( Lavietes et ai.,I976) при обогащении холестерином 6СЗНЕД лимфоцдных клеток, наоборот, наблюдали увеличение скорости роста и злокачественности лимфомы. Эти противоречия, возможно, связаны с тем, что указанные новообразования различны по своей структуре и интенсивности роста: 6СЗНЕД - лимфома - это мягкая солидная опухоль, а лимфома, индуцированная вирусом Молони, так же как и карцинома Эрлиха -асцитные опухоли.
В исследованиях одних авторов приводятся данные о снижении содержания холестерина и микровязкости мембраны злокачественных
КЛвТОК ( Gotteried, 1971; Allan Crumpton, 1972; Marique, Hlldebrand, 1973; Vlodavsky, Sachs, 1974; lobar, 1976). В противоположность этому в некоторых работах было выявлено либо увеличение, либо отсутствие каких-либо изменений содержания холестерина в мембранах трансформированных клеток ( Fuohs, at al.,I975j Shinltzky,Inbar, 1976; Philippot et al., 1977).
В настоящее время неясны различия в относительном содержании холестерина в плазматической мембране опухолевых клеток разного происхождения. Возможно, что плазматическая мембрана сво-боднорастущих опухолевых клеток отличается от мембраны клеток солидных опухолей по соотношению холестерин/фосфолипиды. Результаты, полученные при исследовании гепатом, подтверждают эту точку зрения. Показано, что содержание холестерина в гепатоме 27 значительно больше, чем в нормальной печени (Э.В.Дятловиц-кая и соавт., 1975). Аналогичные данные получены на гепатомах 484 и 484А ( Dod, Gray, 1968), а также на гепатоме 147042 ( Dittmer,Lester, 1964). При определении липидного состава плазматических мембран двух гепатом крысы и мыши показано повышение содержания холестерина в расчете на мг белка в мембранах клеток ВСЄХ ГвПатОМ ПО Сравнению С ГвПатОЦИТаМИ ( Hoeven et al., 1972; Fo Feo et al., 1975). Молярное отношение холестерин/фосфолипиды в мембранах гепатом крысы и мыши на 37$ и 30$ выше контрольных величин. Эти результаты, к сожалению, не подкреплены сведениями об изменении микровязкости мембран. Возможно, что с увеличением содержания холестерина микровязкость может не по - ЗІ вышаться, вследствие изменений жирнокислотного и фосфолипидвого состава мембран.
При исследовании липидного состава мембран гепатом были выявлены некоторые особенности по сравнению с мембранами печени. Так было установлено, что у основного липидного компонента мембран гепатом - фосфатидилхолина г нарушено характерное для фосфатиди лхолина печени и других нормальных тканей млекопитающих расположение ненасыщенной и насыщенной вирных кислот: насыщенная жирная кислота у 1-го углеродного атома, ненасыщенная - у 2-го углеродного атома (Bergeison et аі.,І970). По мнению авторов, такой дефект структуры опухолевого фосфатидилхолина оказывает значительное влияние на способности связывать холестерин. Ряд особенностей злокачественных клеток связан с уменьшением вязкости мембран, главным образом, вследствие свижевия содержания холестерина (Inbax, 1980; Lane et al., 1980). В подтверждение этому получены данные о значительном снижении молярного отношения холестерин/фосфолипиды и микровязкости плазматических мембран гепатомы Морриса 7777 по сравнению с нормальвыми гепато-цитами (Cheng, Levy, 1979). Эти же авторы показали, что резекция 70$ печеви приводит к клеточной пролиферации оставшейся паренхимы, максимум которой соответствует пролиферирующей активности злокачественных клеток. На основании проведенных исследований авторы пришли к заключению, что более жидкий липидный мат-рикс мембран клеток необходим для быстрой клеточной пролиферации.
Изменение липидного состава опухолевых и нормальных клеток при встраивании и выведении холестерина из плазматических мембран
В настоящей диссертационной работе получены результаты, свидетельствующие о значительном снижении молярного отношения холестерин/фосфолипиды в клетках опухолей по сравнению с нормальными клетками. Так Х/ФЛ индекс в клетках гепатомы Зайделя оказался вдвое ниже Х/ФЛ индекса в гепатоцитах (0,20 против 0,40, р 0,001). В клетках лимфобластозного лейкоза LI2I0 молярное соотношение холестерин/фосфолипиды оказалось равным 0,31, тогда как в лимфоцитах Х/ФЛ индекс - 0,46 (таблица 4). При сравнительном анализе липидов в клетках не было обнаруЕвно существенных различий в содержании холестерина и фосфолипидов в расчете на миллиграмм белка и 10 опухолевых и нормальных клеток.
Таким образом, нами установлено снижение молярного отношения холестерин/фосфолипиды в асцитных опухолях - гепатоме Зайделя, лимфобластозном лейкозе Ы2Ю, опухоли яичников -по сравнению с нормальными гепатоцитами и лимфоцитами. Ранее было показано снижение относительного содержания холестерина
Встраивание и выведение из плазматической мембраны опухолевых и нормальных клеток осуществляли при помощи инкубации клеток с фосфатидилхолиновыми липосомами, содержащими и несо-держащими холестерин при 37С (глава 2). Преимущество выбранной методики заключалось в обогащении холестерином плазматиче - 81 ских мембран клеток за сравнительно короткое время (4 часа). При инкубации опухолевых и нормальных клеток с ХФХЛ наблюдалось увеличение содержания холестерина. Содержание же фосфолипидов существенно не изменялось (таблицы 2, 3). Молярное отношение холестерин/фосфолипиды значительно увеличивалось как в опухолевых, так и в нормальных клетках. Заметим, что встраивание холестерина в опухолевые клетки протекало более эффективно, чем в нормальные. Для всех трех типов опухолевых клеток к концу 4-часового периода инкубации с ХФХЛ наблюдалось практически двукратное увеличение Х/ФЛ индекса, тогда как в нормальных клетках отношение холестерин/фосфолипиды повышалось к этому времени не более чем в 1,5 раза (таблица 4). Для выведения холестерина из плазматических мембран клеток использовали фосфатидилхолиновые липосомы, не содержащие холестерин. В опухолевых клетках не наблюдалось удаления холестерина при инкубации их с ФХЛ. В нормальных же клетках извлечение холестерина сопровождалось соответственно уменьшением молярного отношения холестерин/фосфолипиды .
Различия в экстракции холестерина из плазматических мембран нормальных и опухолевых клеток могут быть связаны либо с низким содержанием холестерина в плазматической мембране опухолевых клеток, либо с особенностями локализации холестерина в них. Для проверки этих предположений холестерин экстрагировали из предварительно обогащенной им мембраны опухолевых и нормальных клеток при их инкубации с ФХЛ. Показано одинаково эффективное извлечение холестерина из предварительно обогащенной плазматической мембраны опухолевых и нормальных клеток.
Из этих данных можно сделать заключение, что не имеется существенных различий в локализации холестерина в плазматической мембране опухолевых и нормальных клеток. Таким образом, более эффективное встраивание холестерина в опухолевые клетки и отсутствие его выведения из их плазматической мембраны обусловлены исходно сниженным молярным отношением холестерин/фосфолипиды в опухолевых клетках. Изменение содержания холестерина в опухолевых и нормальных клетках отражается на физических свойствах липидного бислоя их мембран, в частности - на микровязкости. При встраивании холестерина в опухолевые и в нормальные клетки выявлено увеличение микровязкости фосфолипидного бислоя их мембран, оцененное при помощи флюоресцентного и спинового зонда (таблица 5, рис. 5, 6). Молярное отношение холестерин/фосфолипиды является, как правило, характеристикой, определяющей микровязкость биомембран (Ю.А.Владимиров, Г.Е.Добрецов, 1980). При выведении холестерина из обогащенных им мембран степень эксимеризации флюоресцентного зонда пирена увеличивалась, а параметр упорядоченности кирнокислотного спинового зонда уменьшался (таблица 5). Полученные результаты позволяют заключить, что встраивание холестерина ведет к увеличению микровязкости, а его выведение -к уменьшению микровязкости фосфолипидного бислоя мембран как опухолевых, так и нормальных клеток. Следствием увеличения микровязкости липидного бислоя мембран опухолевых и нормальных клеток могут быть самые разнообразные нарушения функциональной активности клеточной поверхности. В связи с этим определенный интерес представляют данные, свидетельствующие об уменьшении активности Na, К-АТФазы и 5 -нукле - 83 отидазы в опухолевых и нормальных клетках при увеличении микровязкости мембран, обогащенных холестерином. Известно, что активность Na, К-АТФазы существенно зависит от липидного окружения фермента в мембране (А.А.Болдырев, В.А.Твердислов, 1978; De Poet et al., 1978). Изменение микровязкости липидов мембраны, независимо от причины, является общим механизмом регуляции активности Na, К-АТФазы ( Bioj et al., 1973).
Активность Иа, К-АТФазы и 5-нуклеотидазы при изменении отношения холестерин/фосфолипиды в опухолевых и нормальных клетках
Снижение активности мембравосвязанных ферментов, в частности, - активности 5 -нуклеотидазы было обнаружено в лимфоцитах, стимулированных митогеном. При этом было выявлено уменьшение молярного отношения холестерин/фосфолипиды и микровязкости мембран клеток ( Coiiord et ai.,I977). Исследования, выполненные на клетках регенерирующей печени и стимулированных фибробластах, также свидетельствуют об уменьшении микровязкости, Х/ФЛ индекса и активности этого фермента. Имея ввиду эти данные и сопоставляя их с результатами собственных исследований, можно утверждать, что активность фермента в клетке регулируется многими факторами, а не только микровязкостью липидного бислоя.
В заключительной части работы исследовали влияние встраивания холестерина на перевиваемость опухолевых клеток. В качестве контролей использовали интактные опухолевые клетки, а также клетки, обработанные ФХЛ, и клетки, преинкубированные в растворе Хенкса. Результаты опытов свидетельствуют о значительном увеличении продолжительности ЕИЗНИ животных, которым вводили клетки гепатомы Зайделя, проинкубированные с ФХЛ. Некоторое защитное действие наблюдалось и в случае лимфобластного лейкоза Ы2Ю (рис.10, 12). Цигостатический эффект инкубации опухолевых клеток с фосфатидилхолиновыми липосомами, по-видимому, обусловлен токсическим действием фосфолипидных перекисей, образующихся в процессе приготовления липосом и их инкубации при 37С на опухолевые клетки {Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972).
Введение животным опухолевых клеток, обогащенных холестерином, сопровождалось значительным увеличением продолжительности жизни животных в случав всех исследованных опухолевых клеток: гепатомы Зайделя, опухоли яичников, лимфобластного лейкоза Ы2Ю. Эти данные свидетельствуют о прямом цитостатиче-ском действии встроенного холестерина на клетки.
Увеличение выживаемости экспериментальных животных при перевивке им опухолевых клеток с повышенным молярным отношением холестерив/фосфолипиды является следствием замедления скорости клеточной пролиферации. Это подтверждается уменьшением числа опухолевых клеток в асцитической жидкости в процессе роста опухолей у животных подопытной группы по сравнению с контрольными (таблица 8). Необходимо отметить, что продукты окисления холестерина, в частности, 25-оксихолестерин, 20-оксихолестерин и др. также могут оказывать выраженное цитостатическое действие на клетки (Kandutsch, Chen, 1977). В связи с этим цитостати-ческое действие холестерина может быть обусловлено влиянием его окисленных производных. В пользу такого механизма действия холестерина свидетельствует цитостатический эффект фосфатидилхолиновых липосом, обнаруженный в опытах с гепатомой Зайделя, где также возможно образование окисленных продуктов ненасыщенных жирных кислот.
Другим возможным механизмом цитостатического действия холестерина на опухолевые клетки может быть влияние увеличения микровязкости их плазматических мембран на митотическую активность.
Такие свойства как латеральная диффузия белковых рецепторов ( Frye, Edidin, 1970), специфическая механическая деформация клеточной поверхности (Katakoka, Koprowki.,1975; Hope et al., 1977), проницаемость мембраны для различных веществ (sabine, 1977; Kutchai et al., 1980), ионный транспорт и другие, в значительной мере определяются микровязкостью ее липидного би-слоя мембран. Обусловленные увеличением микровязкости мембраны, изменения этих свойств могут повлечь за собой нарушение функционирования клетки. Так,уменьшение активности Иа,К-АТФазы при возрастании микровязкости мембраны сопровождается изменением отношения ионов Na+ и К+ в клетке. Последнее приводит к инги-бированию синтеза белка и других внутриклеточных ферментных систем (Ю.М.Лопухин И СОавт., 1983; Zs.-Nagy, 1979; Lubin,l967).
Увеличение микровязкости плазматической мембраны клеток может влиять на активность аденилатциклазы (Sinensky et ai.,1979). Ингибирование активности этого фермента сопровождается изменением содержания ц-АМФ в клетке, который, как известно, является существенным фактором регуляции клеточного роста (Н.А.Федоров, 1979; Robison et al.,l97Ij Burger, Borabik, 1972).
Таким образом, встраивание холестерина в плазматическую мембрану опухолевой клетки, связанное с увеличением микровязкости липидного бислоя мембраны, МОЕЄТ существенным образом влиять на митотическую активность клеток.
Увеличение микровязкости липидной фазы мембран и уменьшение активности мембраносвязанных ферментов характерно для процесса старения организма и влечет за собой снижение многих жизненно важных процессов, в том числе скорости клеточной пролиферации (В.Н.Дильман, С.Ю.Ревской, 1981; В.С.Ли и соавт., 1982; Ю.М.Лопухин и соавт., 1983; Rivany et ai., 1979). Следовательно, встраивание холестерина в мембраны опухолевых клеток можно рассматривать как моделирование процесса их старения.
Таким образом, обобщая результаты исследований, можно считать установленным факт снижения молярного отношения холесте-рин/фосфолипиды в клетках трех асцитных опухолей - гепатомы Зайде ля, лимфобластного лейкоза Ы2Ю и опухоли яичвиков - по сравнению с нормальными лимфоцитами и гепатоцитами. Полученные данные свидетельствуют о снижении активности ферментов плазматической мембраны - Ыа,К-АТФазы и 5 -нуклеотидазы в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. В связи с этими данными результаты диссертации могут иметь важное практическое значение для разработки новых диагностических подходов в онкологии. Кроме того, результаты настоящего исследования свидетельствуют о регуляторной роли холестерина для этих ферментов.
Положение о регуляторной роли холестерина нашло подтверждение в опытах по перевивке опухолевых клеток, в которые было встроено дополнительное количество холестерина. Обогащенные холестерином опухолевые клетки оказались менее инвазивными по сравнению с исходными. В этой части работы продемонстрирован цитостатическое действие холестерина на клетки некоторых асцит-ных опухолей. Эти результаты могут быть использованы для разработки новых методов противоопухолевой терапии.
