Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
Патогенез травматических повреждений нервов 12
Актуальность проблемы 12
Краткий обзор устройства периферической нервной системы млекопитающих 13
Патогенез травматических повреждений нервов 16
Факторы, стимулирующие рост и регенерацию нервных волокон 21
Факторы, определяющие успешную регенерацию периферического нерва 41
Существующие подходы к терапии поврежденных нервов 45
Перспективные подходы к терапии поврежденных нервов 47
Мезенхимальные стволовые клетки 53
Характеристика мезенхимальных стволовых клеток 53
Роль МСК в тканях 61
МСК- перспективный материал для клеточной терапии и тканевой инженерии 65
Возможные механизмы, благодаря которым МСК стимулируют регенерацию тканей 68
Материалы и методы исследования 72
Животные 72
Культура мезенхимальных стволовых клеток 72
Выделение тотальной РНК 74
Денатурирующий электрофорез РНК в агарозно-формальдегидном геле 75
Транскриптомный анализ 76
Модель повреждения периферического нерва 76
Методы оценки эффективности регенерации периферического нерва 78
Оценка восстановления функции двигательных нервных волокон 79
Оценка восстановления проводимости нерва (электрофизиологическое исследование) 80
Оценка восстановления структуры поврежденного нерва (иммунногистохимическое исследование) 83
Оценка восстановления структуры поврежденного нерва (гистохимическое окрашивание срезов нерва Судановым черным) 84
Имплантация МСК на поврежденный нерв 85
Получение плазмидной конструкции для экспрессии мозгового фактора роста нервов 87
Выделение плазмидной конструкции pVax1-hBDNF 91
Электрофорез генетической конструкции pVax1-hBDNF в агарозном геле 92
Тестирование полученной плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF 93
Анализ наличия кДНК BDNF в плазмидной конструкции с помощью полимеразной цепной реакции 93
Анализ эффективности экспрессии плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF в эукариотических клетках 94
Иммуноферментный анализ кондиционированной среды 94
Доставка плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF в мышцы 95
Анализ эффективности экспрессии BDNF в мышечных волокнах 99
Статистическая обработка данных 99
Результаты исследования 101
МСК стимулируют функциональное и структурное восстановление поврежденного периферического нерва 101
МСК экспрессируют факторы роста и компоненты матрикса, необходимые для роста аксонов, а также компоненты миелина 108
Блокирующие антитела к факторам роста, продуцируемым МСК, подавляют способность МСК стимулировать восстановление функции и структуры
поврежденного периферического нерва ПО
Оптимальный метод доставки генетических конструкций в мышечные волокна 120
Вектор pVaxl-hBDNF экспрессируется в эукариотических клетках и мышечных эксплантах 124
Генетическая конструкция pVax1-hBDNF содержит кДНК hBDNF 124
Генетическая конструкция pVax1-hBDNF экспрессируется в клетках линии НЕК293Т 125
Максимально эффективная экспрессия hBDNF в мышечных волокнах может быть достигнута инъекцией 200 мкг pVax1-hBDNF 126
Максимально эффективное восстановление структуры и функции поврежденного нерва наблюдается после инъекции 200 мкг pVax1-hBDNF 127
Генетическая конструкция pVax1-BDNF стимулирует восстановление функции и структуры периферического нерва после травмы 132
Обсуждение результатов исследования 136
Выводы 146
Список литературы 148
- Краткий обзор устройства периферической нервной системы млекопитающих
- Методы оценки эффективности регенерации периферического нерва
- Доставка плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF в мышцы
- Оптимальный метод доставки генетических конструкций в мышечные волокна
Введение к работе
Актуальность проблемы. Травматические повреждения нервных стволов и сплетений являются самой частой причиной временной и стойкой утраты трудоспособности населения. Одним из перспективных подходов к лечению повреждений периферической нервной системы является терапевтический нейрогенез, основанный на введении в денервированные ткани генетических конструкций с генами нейротрофических факторов или стволовых/прогениторных клеток. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга или жировой ткани, считаются перспективным инструментом для стимуляции регенерации поврежденной ткани благодаря своей способности стимулировать рост кровеносных сосудов и нервных волокон. Способность МСК стимулировать ангиогенез связывают с их способностью секретировать ангиогенные факторы роста и стабилизировать формирующиеся сосуды. На моделях ишемии конечностей и миокарда у животных показано, что локальное и системное введение МСК способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением и улучшению перфузии тканей кровью (Парфенова ЕВ, 2006; Rehman J, 2004; Nakagami H, 2006; Gimble JM, 2007; Zhang YQ, 2007; Cai L, 2009; Kondo K, 2009). Также было показано, что МСК, трансплантированные под кожу экспериментальным животным, способны стимулировать прорастание нервных волокон из окружающих тканей в имплант матригеля (Lopatina TV, 2011). В то же время способность МСК стимулировать восстановление поврежденных нервных волокон не исследована. Также не изучен и механизм, благодаря которому МСК стимулируют прорастание нервных волокон в имплант. Вероятно, эта способность МСК связана с их способностью секретировать большое количество биологически активных соединений, в том числе обладающих и нейротрофической активностью (Johnson TV, 2010, Lopatina TV, 2011). Однако это требует дополнительного исследования, поскольку изучение свойств МСК и механизмов, благодаря которым они стимулируют восстановление структуры и функции поврежденных тканей и органов, позволит не только усилить их эффективность при использовании в клинике, но и позволит приблизиться к пониманию физиологической роли мезенхимальных стволовых клеток в организме.
Цель работы: Исследовать механизмы влияния мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, на восстановление периферического нерва после травмы.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать влияние мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани (МСК), на восстановление периферического нерва после травмы.
2. Идентифицировать факторы, участвующие в процессах репарации нервной ткани под влиянием МСК.
3. Разработать генетическую конструкцию, кодирующую один из ключевых факторов роста, и оценить ее влияние на восстановление поврежденного нерва.
Научная новизна. Впервые была показана способность мезенхимальных стволовых клеток экспрессировать большое число транскриптов, которые кодируют белки, участвующие в различных этапах процессов нейрогенеза и нейрорегенерации. Благодаря экспрессии таких белков МСК могут воздействовать на различные этапы восстановления структуры и функции поврежденного нерва: от роста аксонов и пролиферации шванновских клеток до процессов миелинизации нервных волокон и восстановления их проводимости. Впервые предпринята попытка выяснения механизма, благодаря которому мезенхимальные стволовые клетки стимулируют восстановление структуры и функции периферического нерва после травмы. Было установлено, что трансплантация антител, нейтрализующих мозговой фактор роста нервов (BDNF), вместе с МСК снижает способность МСК стимулировать восстановление структуры и функции травмированного периферического нерва. Это свидетельствует о важном вкладе мозгового фактора роста нервов в способность МСК стимулировать регенерацию периферического нерва. Это подтверждает и тот факт, что гиперэкспрессия рекомбинантного мозгового фактора роста нервов в мышечных волокнах способствует восстановлению поврежденного нерва. Впервые было показано, что генетическая конструкция pVax1-hBDNF, кодирующая мозговой фактор роста нервов, стимулирует восстановление структуры и функции травмированного нерва. Впервые была подобрана концентрация генетической конструкции pVax1-hBDNF, которая обеспечивает максимально полное восстановление структуры и функции нерва под действием данной генетической конструкции. Впервые было показано, что мезенхимальные стволовые клетки, продуцирующие целый спектр нейротрофических и ангиогенных факторов, стимулируют восстановление структуры и функции поврежденного нерва лучше, чем генетическая конструкция, обеспечивающая гиперэкспрессию одного из ключевых факторов роста.
Результаты данной работы позволяют подтвердить важный вклад паракринной активности МСК в их способность стимулировать процессы репарации поврежденной ткани и помогают приблизиться к пониманию физиологической роли МСК в организме.
Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в научно-исследовательскую и педагогическую деятельность ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова: используются в материалах лекций для студентов по курсу «Молекулярная медицина».
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на совместном заседании научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий и кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова (5 февраля 2013г.), на заседании лаборатории ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ (12 февраля 2013г.), а также на научных конференциях: Международный форум по нанотехнологиям (Москва, 2008), Симпозиум «Высокие медицинские технологии в нейрохирургии» (Москва, 2009), Всероссийская научная школа-конференция «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), Всероссийская научная конференция «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011), III Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2011).
Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов Министерства образования и науки РФ № 16.512.12.2005 от 16.06.2011, №16.512.11.2262 от 14.09.2011, №02.740.11.0872 от 28.06.2010, №16.512.11.2064 от 14.02.2011.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, 5 тезисов докладов, 1 глава в сборнике статей.
Структура работы. Диссертация содержит 169 страниц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 391 источник. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 31 рисунком.
Краткий обзор устройства периферической нервной системы млекопитающих
Для того чтобы сделать описание механизмов повреждения и регенерации периферической нервов более понятным, необходимо вкратце осветить их строение.
Клетки нервной ткани можно разделить на собственно нервные клетки (нейроны) и клетки глии. Особенностью строения нервных клеток является наличие у них длинных отростков: аксона и дендритов. Тела нейронов расположены в центральной нервной системе: головном или спинном мозге, в ганглиях (чувствительные и симпатические нейроны) или в ядрах (моторные нейроны черепных нервов). Их отростки, необходимые для интеграции нервных клеток и функционирования нервной системы, могут достигать колоссальных размеров по сравнению с телом самого нейрона. Длина отростков нервных клеток у взрослого человека может достигать более одного метра. Питание и поддержку функции таких удаленных от тела клетки нервных проводников, осуществляют клетки глии. В периферической нервной системе их роль выполняют шванновские клетки. Дупликатурой своих мембран эти клетки окутывают аксоны и дендриты, изолируют их друг от друга, питают, регулируют концентрации ионов во внеклеточной среде и обеспечивают быстрое, сальтаторное проведение нервного импульса. Контакт клеток-сателлитов с мембраной нервного волокна, опосредуется рядом поверхностных белков этих клеток (например, Nogo-66, MAG, Omgp, рецепторы нейрегулинов erbB2 и erbB3 (Barres BA, 1999)) и мембранными рецепторами нервных волокон (например, рецепторный комплекс NgR-р75 (Kwon BK, 2002) и GPI-заякоренный белок Т-кадгерин (Fredette BJ, 1994), нейрегулины (Barres BA, 1999)). Этот контакт нейронов с сателлитными клетками препятствует росту, ветвлению нервного волокна и способствует поддержанию миелинизирующего фенотипа шванновских клеток.
Комплекс аксона и шванновской клетки покрыт базальной мембраной, состоящей в основном из ламинина (Einheber S, 1995; Chen ZL, 2003). Периферические нервы интесивно кровоснабжаются. Наружная система кровоснабжения нерва формируется вокруг эпиневрия артериями и венами, отходящими от магистральных сосудов. Внутренняя система кровоснабжения представлена артериолами, венулами, прекапиллярами и капиллярами, образующими широкую сеть анастомозов в продольном, поперечном и косом направлении (рис. 2). Пучки нервных волокон отделены от кровеносных сосудов гематоневральным барьером, обеспечивающим их защиту и питание. Рисунок 2. Кровоснабжение периферических нервов. Пояснения в тексте.
В физиологических условиях шванновские клетки и органы-мишени (мышцы, сосуды) синтезируют белковые молекулы- нейротрофины (nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)), которые ретроградным аксональным транспортом по нервным волокнам поступают в тело нейрона. Там они регулируют экспрессию определенных паттернов генов, поддерживая тем самым выживание и функционирование нейрона. В то же время и нейроны осуществляют трофику шванновских клеток и органов-мишеней (рис. 3). Так денервация ткани приводит к ее атрофии, однако механизм трофики тканей периферическими нервами не исследован. Рисунок 3. Реципрокные трофические взаимоотношения нервных волокон ПНС и органов-мишеней. Черными стрелками показано направление движения потенциалов действия, а красными - направление движения трофических сигналов.
Патогенез травматических повреждений нервов Травматические повреждения нервов по тяжести повреждения были разделены Сэддоном (Seddon H, 1943) на:
а) Невротмезис- полное или частичное нарушение анатомической целостности нерва- невротмезис. Для данного типа повреждения характерны валлеровская дегенерация дистального отрезка нерва, фиброз нерва и нарушение гемато-неврального барьера. Процесс восстановления утраченных функций отличается медленным течением регенераторного спрутинга и определяется, прежде всего, уровнем повреждения нерва или сплетения. В функциональном плане характерны выраженный моторный и сенсорный дефицит и неблагоприятный прогноз. Без хирургического сопоставления концов нерва восстановление невозможно.
б) Аксонотмезис- повреждение нервного ствола, сопровождающееся разрывом аксонов при сохранности соединительнотканных оболочек нерва. При данном типе повреждения характерны аксональная атрофия части интактных нервных волокон, валлеровская дегенерация прерванных нервных волокон, нарушение гемато-неврального барьера, фиброз нерва. В функциональном плане характерны моторный и сенсорный дефицит и относительно благоприятный прогноз.
в) Неврапраксия- блокада невральной проводимости при интактности осевых цилиндров. Возникает при травмирующих воздействиях малой интенсивности (компрессия, ишемия). Причиной, по-видимому, является многоочаговая демиелинизация и атрофия аксона дистальнее места компрессии вследствие длительного нарушения аксонального транспорта. Неврапраксии характеризуются обратимыми двигательными, чувствительными и вегетативо-трофическими расстройствами, процессы регенерации протекают быстро и ярко.
При повреждении нервных волокон по типу невротмезиса или аксонотмезиса нервные клетки лишаются основной нейротрофической поддержки, в результате чего часть из них гибнет. Нейроны, пережившие повреждение, запускают экспрессию генов репарации (гены факторов транскрипции, белков цитоскелета, молекулярных «моторов», молекул клеточной адгезии и навигации конуса роста, трофических факторов и их рецепторов) (Goldberg JL, 2003). Изменения наблюдаются не только в поврежденном нейроне, но и в нейроне, являющимся пресинаптическим по отношению к поврежденному.
Шванновские клетки, расположенные дистальнее места повреждения, претерпевают трансформацию из миелинизирующего фенотипа в премиелинизирующий (пролиферирующий). Изменяется паттерн экспрессии их генов: увеличивается экспрессия NGF (фактора роста нервов), рецептора p75, Glia Maturation Factor- (GMF- ), и молекул клеточной адгезии NCAM и L1, а экспрессия белков миелина (миелин-ассоциированный белок (myelin-associated glycoprotein-MAG), основной белок миелина (myelin basic protein-MBP), P0 и PMP22) уменьшается (Bolin LM, 1993). Часть шванновских клеток премиелинизирующего фенотипа подвергается апоптозу (через активацию рецептора p75 (Khursigara G, 2001)). Оставшиеся в живых шванновские клетки разрушают и фагоцитируют деградирующий миелин (чтобы затем использовать его для ремиелинизации (Kidd G, 1996)), пролиферируют и мигрируют в область повреждения (Einheber S, 1995).
Мигрирующие из проксимального конца нерва шванновские клетки выстраиваются по ходу освободившихся эндоневральных каналов дистальной части нерва, формируя в комплексе с поверхностью базальной мембраны ленты Бюнгнера (Taniuchi M, 1988), и начинают активно экспрессировать соответствующие факторы роста, привлекая тем самым в освободившийся соединительнотканный чехол уцелевшие волокна проксимального отрезка поврежденного нерва. Причем спектр секретируемых нейротрофических факторов определяется фенотипом шванновской клетки. Оказалось, что фенотип шванновской клетки определяется типом аксона, с которым она была связана. Поскольку разные типы нейронов нуждаются для выживания в разных нейротрофинах, то и паттерны экспрессии генов шванновских клеток из чувствительного и моторного нервов отличаются. Так в поврежденном чувствительном (кожном) нерве активно экспрессируются мРНК NGF, BDNF, VEGF, HGF (hepatocyte growth factor), IGF-I (insulin-like growth factor-1), а в поврежденном двигательном нерве- плейотрофин (pleiotrophin) и GDNF (Einheber S, 1995; Hke A, 2006).
Совокупность изменений в проксимальном и дистальном отрезках поврежденного нерва: изменение фенотипа шванновских клеток, фрагментация и фагоцитоз погибших аксонов и миелина, дегенерация волокон проксимального отрезка нерва- получила название Уоллеровской или Валлеровской дегенерации (Wallerian degeneration) (Waller A, 1851).
После завершения процесса Валлеровской дегенерации выжившие нейроны начинают восстанавливать свои нервные отростки. В отличие от ЦНС нейроны периферической нервной системы с возрастом не утрачивают способность к регенерации аксонов. Разные типы нейронов регенерируют с врожденной, присущей им скоростью (чувствительные нейриты прорастают к своей мишени со скоростью, не превышающей 0,5-1 мм/сутки).
Для реиннервации органа-мишени важен именно направленный рост нейрита. Ключевую роль в навигации нейрита играет высокоподвижная структура, расположенная на его кончике, названная конусом роста. Эта часть нейрита, выпуская филоподии и ламеллоподии, исследует окружающее пространство, обнаруживая факторы, управляющие навигацией. Как правило, повышенная экспрессия нейротрофических факторов шванновскими клетками в поврежденном нерве сопровождается увеличением уровня экспрессии соответствующих рецепторов на конусе роста регенерирующего волокна. Также конус роста имеет свою собственную систему трансляции, которая необходима для его постоянной ресенситизации к навигационным молекулам и трофическим факторам (Goldberg JL, 2003).
Методы оценки эффективности регенерации периферического нерва
После повреждения нерва и аппликации МСК эффективность восстановления периферического нерва оценивали по функции мышц разгибателей пальцев стопы (через 1, 2, 4 и 7 суток после повреждения); по характеристикам вызванных потенциалов действия, регистрируемых с поверхностной веточки общего малоберцового нерва (через 7 суток после повреждения); а также по количеству нейритов, специфически окрашивающихся на тяжелую субъединицу белка нейрофиламентов NF200, в участке повреждения (через 4 суток после повреждения) (рис. 15). Оценка восстановления функции двигательных нервных волокон На 1, 2, 4 и 7-е сутки от момента повреждения нерва при помощи витальной методики оценивали восстановление функции мышц разгибателей стопы. По функционированию данных мышц судили о степени восстановления иннервирующих их двигательных волокон общего малоберцового нерва.
Восстановление функции мышц-разгибателей стопы анализировали с помощью измерения функционального индекса малоберцового нерва (PFI) согласно ранее опубликованному протоколу (Yuan Y et al, 2009; Kah-Hui Wong et al., 2011). Для этого задние конечности мышей смазывали чернилами и мышей выпускали в туннель 6х50 см, позволяя им свободно бежать. Туннель был выложен изнутри сменными листами бумаги. Отпечатки следов (рис. 12) сканировали, а их ширину и длину измеряли при помощи программы Metamorph 7.1. PFI вычисляли по формуле: где EPL и ETS - это длина и ширина следа, измеренные через 1, 2, 4, 7 дней после повреждения нерва, а NPL и NTS – длина и ширина отпечатка стопы, измеренные до его повреждения.
PFI измеряется в условных единицах и у неповрежденного нерва составляет -13,4 усл.ед. На первый день после повреждения нерва PFI составляет около -140 усл.ед. PFI можно рассматривать как интегральный показатель восстановления нерва, поскольку он характеризует не только восстановление самих нервных волокон, но и формирование концевых пластинок, а также функциональное состояние реиннервированной мышцы. Рисунок 12. Отпечатки задней конечности мыши. А - общий вид, Б- до повреждения и на следующий день после повреждения.
Оценка восстановления проводимости нерва (электрофизиологическое исследование)
Восстановление проводимости нерва оценивали с помощью вызванных потенциалов действия, регистрируемых с поверхностной веточки общего малоберцового нерва. Для этого мышей умерщвляли передозировкой наркоза через 7 суток после повреждения нерва. Животных фиксировали на операционном столике, на прооперированной конечности вскрывали кожу, удаляли мышцы. К проксимальному концу седалищного нерва привязывали нитку для последующих манипуляций с ним. Нерв отсекали еще проксимальней нитки и, придерживая нерв за нитку, при помощи ножниц для микрохирургических операций изолировали его от окружающих тканей вместе с поверхностной веточкой общего малоберцового нерва. В момент выделения нерва его поверхность и поверхность покрывающих его мышц интенсивно орошали раствором Лайли для теплокровных (135,0 мМ NaCl, 4,0 мМ KCl, 2,2 мМ CaCl2, 1,0 мМ MgCl2, 0,9 мМ NaH2PO4, 16,3 мМ NaHCO3, 11,0 мМ D-80 глюкозы). Среднее время выделения нерва составляло около 7 минут. Выделенный нерв помещали в раствор Лайли (pH 7,2-7,4).
Стимуляцию нерва проводили в электрофизиологической камере с раствором Лайли на 7 – 8 мм проксимальнее места повреждения с использованием пары серебряных электродов (дистанция между электродами составляла 1,5мм). Применяли следующие параметры стимуляции: частота импульса 1 Гц, продолжительность импульса 0,05 мс и супрамаксимальная амплитуда 10 В. Промежуток времени от забоя животного до момента регистрации вызванных потенциалов действия был стандартным около 35-45 минут для каждого животного. Суммарные потенциалы действия нерва (СПДН) регистрировали 3 раза для каждого нерва с использованием монополярного аспирирующего электрода, который располагался на 10 мм дистальнее места повреждения (рис. 14). Регистрирующий электрод был связан с усилителем, АЦП Е14-140 (L-card) и персональным компьютером (рис. 13). Регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью программы PowerGraph Professional 3.3.
Полученные данные анализировали следующим образом. Регистрируемый СПДН характеризуется двумя параметрами, позволяющими нам судить о степени восстановления нерва, латентным периодом и амплитудой. Латентный период - это время от момента стимуляции нерва до момента регистрации вызванного потенциала действия, измеряемое в миллисекундах. Латентный период характерирует скорость проведения возбуждения по нерву, причем его величина обратно пропорциональна скорости проведения возбуждения по нерву. Таким образом, увеличение латентного периода после повреждения свидетельствует о снижении скорости проведения вызванных потенциалов по поврежденному нерву. Поскольку скорость проведения вызванных потенциалов действия по нерву определяется качеством миелиновой облочки нервных волокон, то укорочение латентного периода свидетельствует о лучшем ее восстановлении. Амплитуда характеризует количество нервных волокон, участвующих в проведении возбуждения (Fugleholm K, 2000; Vleggeert-Lankamp CLAM, 2007); измеряется в милливольтах (мВ). Чем меньше амплитуда СПДН, тем меньшее количество нервных волокон содержит поврежденный нерв (рис. 14).
Доставка плазмидной конструкции pVaxl-hBDNF в мышцы
С целью достижения эффективной трансфекции мышечных волокон был проведен подбор оптимальных условий для доставки плазмидной конструкции в мышцы. В литературе было обнаружено множество противоречивых данных по параметрам электропорации и практически не встречалось данных о введении генетических конструкций в переднюю большеберцовую мышцу. Было принято решение доставлять генетическую конструкцию в мышечные волокна передней большеберцовой мышцы, поскольку данная мышца располагается достаточно близко к месту повреждения периферического нерва и потому что она иннервируется глубокой веточкой общего малоберцового нерва.
Для отработки оптимальных параметров электропорации мышцы мы использовали генетическую конструкцию pc4W--Gal, любезно предоставленную руководителем лаборатории ангиогенеза ИЭК ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ д.м.н. Е.В.Парфеновой. Данная генетическая конструкция кодирует бактериальный фермент -галактозидазу, определение локализации которой возможно благодаря качественной реакции. В клетках млекопитающих существует митохондриальная -галактозидаза, но pH, необходимый для протекания качественных реакций на нее и бактериальную -галактозидазу, различается. Доставку генетической конструкции в мышечные волокна осуществляли следующим образом. У мыши, анастезированной 400 мкл 2,5% раствора 2,2,2 трибромметанола («Sigma»), очищали голень от шерсти. Мышь фиксировали к операционному столику спиной вниз. Голень дезинфицировали 70% спиртом. Инъекцию генетической конструкции осуществляли инсулиновым шприцем (BD) с толщиной иглы 29G в объеме 60 мкл. Введение иглы в переднюю большеберцовую мышцу осуществляли чрезкожно от нижней трети голени вдоль мышцы к верхней трети голени. Иглу вводили срезом вверх. По ходу продвижения иглы понемногу вводили раствор генетической конструкции. После введения раствора плазмиды шприц с иглой очень быстро извлекали. Концентрация плазмиды в растворе составляла 1 мг/мл (на стерильном физ. растворе). Животных разделили на 3 группы: в 1-ой группе введение генетической конструкции pc4W--Gal не сопровождалось электропорацией, 2 й группе инъекцию сопровождали низковольтовой электропорацией (100 В/см), 3-й группе после инъекции pc4W--Gal осуществляли высоковольтовую электропорацию (175 В/см). В течение 20-30 секунд после инъекции генетической конструкции на кожу по обе стороны от передней большеберцовой мышцы накладывали электроды, смазанные для большей электропроводности Униагелем (Гельтек, Россия). Электропорацию осуществляли в виде 6 импульсов электрического тока с напряжением 100 или 175 В/см, длительностью 20 мкс и частотой 1 Гц. После третьего импульса полярность меняли. Источником тока служил аппарат BTX Harvard Apparatus ECM 830 (BTX, США). Для того чтобы выяснить, какой из способов доставки генетической конструкции в мышечные волокна является оптимальным, мы исследовали уровень экспрессии -Gal в передних большеберцовых мышцах экспериментальных животных. Для этого через 3 суток от момента инъекции генетической конструкции pc4W--Gal животных умерщвляли передозировкой наркоза. Из них выделяли передние большеберцовые мышцы, которые рассекали на проксимальный и дистальный концы и затем замораживали в среде для замораживания Tissueek (Sakura Finetek). Из полученных блоков делали поперечные срезы мышцы толщиной 10 мкм. Полученные срезы высушивали в течение суток при комнатной температуре. Затем срезы, предназначенные для окрашивания, фиксировали в 2% формальдегиде на 10 кратном фосфатносолевом буфере в течение 5 минут. Фиксированные срезы отмывали в однократном фосфатно-солевом буфере (pH 8,0) 3 раза по 5 минут, а затем на срезы наносили окрашивающий раствор (5мМ K3(Fe(CN)6), 5мМ K4(Fe(CN)6), 2мМ MgCl2 и 2,5мМ субстрата X-gal на фосфатносолевом буфере pH 8,0) и инкубировали во влажной камере при 37С в течение 24 часов. Срезы отмывали в однократном фосфатно-солевом буфере (pH 8,0) 3 раза по 5 минут, дегидратировали в спиртах, осветляли ксилоле и заключали в гидрофобную среду для заключения срезов. Затем осуществляли микроскопию, фотографирование полученных срезов мышцы и их анализ при помощи программы ClickCounter2. Подсчитывали мышечные волокна, которые были окрашены в синий цвет различной степени интенсивности. Оценивали процентное соотношение окрашенных мышечных волокон к общему числу живых мышечных волокон.
После подбора оптимального метода доставки, необходимо было подобрать оптимальную дозу плазмидной конструкции pVax1-hBDNF, чтобы достигнуть оптимального уровня ее экспрессии в мышечных волокнах. С этой целью мы исследовали влияние 50 мкг, 100 мкг, 200 мкг или 300 мкг плазмиды pVax1-hBDNF (на экспериментальное животное) на уровень экспрессии белка в мышечных эксплантах и на восстановление структуры и функции поврежденного нерва. Инъекции всех доз генетической конструкции делали в объеме 60 мкл в соответствии с описанным выше протоколом. Инъекцию pVax1-hBDNF сопровождали низковольтовой электропорацией (100 В/см). Животным из группы контроля делали инъекции пустого вектора pVax1 в дозе 100 мкг. Продукцию BDNF мышцами анализировали через 3 суток после инъекции pVax1-hBDNF с помощью ИФА кондиционированной среды эксплантов мышц (см. выше). Через 7 суток после повреждения общего малоберцового нерва и инъекции различных доз pVax1-hBDNF при помощи электрофизиологической методики анализировали проводимость регенерирующего нерва (рис. 18).
Оптимальный метод доставки генетических конструкций в мышечные волокна
У мышей, получивших МСК в сочетании с антителами, блокирующими GDNF, через 7 дней после повреждения амплитуда вызванных потенциалов действия была в 2,64 раза меньше, чем у животных из группы положительного контроля и составляла 0,259 (0,231; 0,291) мВ (n=18, p 0,05). У животных, которым трансплантировали МСК в сочетании с антителами, блокирующими VEGF, через 7 дней после повреждения амплитуда вызванных потенциалов действия была в 2,2 раза меньше, чем у животных из группы положительного контроля и составляла 0,31 (0,272; 0,323) мВ (n=18, p 0,05). Через 7 суток после повреждения нерва и трансплантации МСК у животных из группы положительного контроля амплитуда вызванных потенциалов действия составила 0,685 (0,39; 0,92) мВ (n=18), а у животных, которым апплицировали МСК в сочетании с неспецифическими антителами, амплитуда была 0,459 (0,392; 0,557) мВ (n=18). В группе контроля на носитель амплитуда вызванных потенциалов действия через 7 суток после повреждения составила 0,28 (0,185; 0,38) мВ (n=18). Через 7 суток амплитуда вызваных потенциалов действия у животных, которым на поврежденный нерв наносили GFR MatrigelTM, содержащий блокирующие антитела к BDNF, GDNF и VEGF, достоверно не отличалfсь от таковой у животных из группы контроля на носитель на соответствующие сроки (n=18) (данные не приведены).
Уменьшение амплитуды в экспериментальных группах свидетельствует об уменьшении числа восстановившихся нервных волокон при использовании МСК в сочетании с блокирующими антителами к BDNF, GDNF, VEGF.
Латентный период через 7 суток после повреждения нерва у животных, которым трансплантировали МСК в сочетании с антителами, блокирующими BDNF, был в 1,47 раз длиннее, чем у животных из группы положительного контроля и составлял 1,544 (1,32; 1,955) мс (n=18, p 0,05). У мышей, получивших МСК в сочетании с антителами, блокирующими GDNF, через 7 дней после повреждения латентный период вызванных потенциалов действия был в 2,43 раза длиннее, чем у животных из группы положительного контроля и составлял 2,546 (2,298; 3,06) мс (n=18, p 0,05). У животных, которым трансплантировали МСК в сочетании с антителами, блокирующими VEGF, через 7 дней после повреждения латентный период был в 1,85 раз длиннее, чем у животных из группы положительного контроля и составлял 1,945 (1,83; 3,952) мс (n=18, p 0,05). Через 7 суток после повреждения нерва и трансплантации МСК у животных из группы положительного контроля латентный период вызванных потенциалов действия составил 1,049 (0,989; 1,08) мс (n=18), а у животных, которым апплицировали МСК в сочетании с неспецифическими антителами, латентный период был 1,2 (1,09; 1,23) мс (n=18). В группе контроля на носитель латентный период вызванных потенциалов действия через 7 суток после повреждения составил 1,66 (1,44; 1,77) мс (n=18). Через 7 суток латентный период вызваных потенциалов действия у животных, которым на поврежденный нерв наносили GFR MatrigelTM, содержащий блокирующие антитела к BDNF, GDNF и VEGF, достоверно не отличался от такового у животных из группы контроля на носитель на соответствующие сроки (n=18) (данные не приведены).
Увеличение латентного периода СПДН в экспериментальных группах по сравнению с таковым у мышей из группы положительного контроля свидетельствует о меньшей скорости восстановления миелиновой оболочки миелиновых и толщины безмиелиновых волокон у животных из экспериментальных групп.
По данным электрофизиологического исследования латентный период и амплитуда у мышей, которым апплицировали МСК в сочетании с неспецифическими антителами, достоверно не отличались от аналогичных показателей животных из группы положительного контроля. Таким образом, латентный период и амплитуда, зарегистрированная с нервов животных, которым вместе с МСК на поврежденный нерв трансплантировали антитела, блокирующие факторы роста, не отличается от аналогичных показателей животных из группы контроля на носитель, но 120 достоверно отличается от таковых у животных, которым трансплантировали МСК или МСК в сочетании с неспецифическими антителами (n=84; p 0,05). Полученные нами данные указывают на то, что антитела, блокирующие факторы роста, подавляют стимулирующий эффект МСК на восстановление функции и структуры нерва после травмы. Это свидетельствует о том, что паракринная секреция является основным механизмом, благодаря которому МСК стимулируют восстановление поврежденных нервных волокон. Также было отмечено, что нейтрализация даже одного из протестированных факторов роста (BDNF, GDNF, VEGF) практически полностью подавляет функциональное и структурное восстановление нерва под действием МСК. Оптимальный метод доставки генетических конструкций в мышечные волокна А Итак, нами было показано, что блокирование ключевых для процесса нейрорегенерации факторов (BDNF, GDNF, VEGF) нейтрализует способность МСК стимулировать восстановление поврежденного периферического нерва. Для подтверждения данных этого эксперимента необходимо было гиперэкспрессировать эти факторы роста и исследовать их способность стимулировать восстановление травмированного периферического нерва. Поскольку эта работа была ограничена во времени, было принято решение создать генетическую конструкцию, кодирующую лишь один из этих факторов роста. В качестве такого фактора роста нами был выбран BDNF (мозговой фактор роста нервов), который играет ключевую роль в процессах выживания и регенерации двигательных и чувствительных нейронов после повреждения. Ген, кодирующий BDNF, был встроен в плазмиду pVax1, предназначенную для создания ДНК-вакцин. Инъекцию созданной генетической конструкции было решено делать в переднюю большеберцовую мышцу, иннервируемую общим малоберцовым нервом. Для того, чтобы подобрать оптимальные параметры доставки генетической конструкции в мышечные волокна мы сравнили эффективность трансфекции мышечных волокон маркерной плазмидой pc4W--Gal при инъекции без электропорации, с низковольтовой электропорацией (100 В/см) и с высоковольтовой электропорацией (175 В/см). На 3 сутки мышцы выделяли, их разделяли на проксимальную и дистальную части, чтобы оценить уровень экспрессии маркерной плазмиды в различных отделах мышцы. Из образцов приготовляли криосрезы и окрашивали качественной реакцией на -галактозидазу. Окрасившиеся позитивно мышечные волокна подсчитывали. Оказалось, что количество мышечных волокон, окрашивающихся позитивно на -галактозидазу в группе без электропорации составляет в проксимальной части мышцы 4,8 ± 0,8 %, в дистальной части- 2,2 ± 0,3 %. В группе с низковольтовой электропорацией (100 В/см) количество -галактозидаза-позитивных мышечных волокон составляет в проксимальной части мышцы 10 ± 0,9 %, а в дистальной- 7 ± 1,3 %. В группе с высоковольтовой электропорацией (175 В/см) количество окрашенных мышечных волокон составило в проксимальной части мышцы 14,7 ± 2,3 %, а в дистальной части мышцы- 5,8 ± 1,3 %. Более того оказалось, что в группе с низковольтовой электропорацией количество некротизировавшихся мышечных волокон составляет в проксимальной части мышцы 8 ± 4 %, а в дистальной- 12 ± 4,2 %. В группе с высоковольтовой электропорацией (175 В/см) количество некротизировавшихся мышечных волокон составило в проксимальной части мышцы 38,5 ± 3,8 %, а в дистальной части мышцы- 43 ± 4,7 %. В группе, где электропорацию не проводили, погибших мышечных волокон не наблюдали. Различия по количеству окрашенных или некротизировавшихся мышечных волокон между группами являются достоверными- р 0,05 (рис. 25). Из данного исследования можно сделать вывод, что электропорация повышает количество трансформированных мышечных волокон, однако вызывает и гибель некоторых из них, причем с повышением напряжения электропорации количество погибших мышечных волокон растет. По данным эксперимента оптимальным по соотношению трансформированных (около 10%) и некротизировавшихся (около 8%) мышечных волокон является низковольтовая электропорация.
