Содержание к диссертации
Введение
І.Обзор литературы 12
1.1 .Терапевтический ангиогенез: основные подходы 12
1 2. Использование МСК жировой ткани для стимуляции ангиогенеза 31
1.3. Старение МСК 50
1 4.Персонализированный подход к клеточной терапии с использованием аутологичных МСК-ЖТ 62
Заключение обзора литературы 65
2.Материалы и методы 65
2.1. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование 65
2.2.Экспериментальные животные 69
2.3.Выделение МСК из жировой ткани 69
2.4.Культивирование МСК-ЖТ 71
2.5.Моделирование гипоксии 71
2.6.Характеристика МСК-ЖТ 72
2.6.1.Анализ экспрессии маркеров МСК на поверхности клеток 72
2.6.2. Оценка способности клеток к остеогенной и адипогенной дифференцировке в индуктивных средах роста 72
2.6.3. Оценка жизнеспособности клеток 73
2.6.4. Оценка пролиферации клеток 74
2.6.5. Определение относительной длины теломер в клетках 75
2.7.Оценка продукции активных форм кислорода в МСК-ЖТ 75
2.8.Выделение РНК из клеток 75
2.9. Количественная ГЩР с обратной транскрипцией в реальном времени 76
2.9.Сравнительная оценка транскриптома МСК-ЖТ человека, культивированных в стандартных и гипоксических условиях 79
2.10. Оценка экспрессии урокиназного рецептора (uPAR) на поверхности МСК-ЖТ человека80
2.11. Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) 80
2.12.0ценка активности металлопротеиназ 2 и 9 типов (ММГТ-2 и ММП-9) в кондиционированной среде методом зимографии 81
2.13.Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле82
2.14.Ангиогенез в подкожном имплантате Матригеля 83
2.15.Статистический анализ 85
3.Результаты 86
3.1. МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сравнимы по морфологии, иммунофенотипу и пролиферативной активности, но различаются по накоплению маркеров старения 86
3.2.Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ человека 92
3.2.1. Образование капилляроподобных структур эндотелиалъными клетками на Матригеле в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ пациентов разного возраста 92
3.2.2. Содержание ангиогенных факторов роста в кондиционированной среде от МСК-ЖТ пациентов разного возраста 95
3.2.3. Содержание мРНКгенов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста 100
З.З.Влияние возраста на экспрессию и активность протеаз в МСК-ЖТ 102
3.3.1. Содержание мРНКурокиназы, урокиназного рецептора, ингибитора активатора плазминогена 1 типа и металлопротеиназ 2 и 9 типов в МСК-ЖТ 102
3.3.2. Экспрессия урокиназного рецептора на мембранной поверхности МСК-ЖТ 103
3.3.3.Активность ММП-2 иММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ. 105
3.4. Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мышей 106
3.4.1.С возрастом пролиферация МСК-ЖТ мышей снижается, а доля апототических клеток в популяции увеличивается 106
3.4.2.С возрастом продукция активных форм кислорода в МСК-ЖТ мышей и способность клеток к остеогенной дифферещировке усиливается 108
3.4.3. Способность МСК-ЖТ мышей стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo снижается с возрастом 110
3.4.4.При старении в МСК-ЖТ мышей изменяется профуиль экспрессии генов факторов, регулирующих ангиогенез 113
3.5.Влияние кратковременной гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ при старении.. 115
3.5.1. Гипоксия вызывает изменения профиля экспрессии генов в МСК-ЖТ человека 116
3.5.2. Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ молодых мышей стимулировать рост кровеносных сосудов на модели подкожной имплантации Матригеля 120
3.5.3. При старении ответ МСК-ЖТ на гипоксию изменяется 125
4.Обсуждение результатов 126
Заключение 144
Выводы 147
Список литературы 149
- Использование МСК жировой ткани для стимуляции ангиогенеза
- Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование
- МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сравнимы по морфологии, иммунофенотипу и пролиферативной активности, но различаются по накоплению маркеров старения
- Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ молодых мышей стимулировать рост кровеносных сосудов на модели подкожной имплантации Матригеля
Использование МСК жировой ткани для стимуляции ангиогенеза
Мезенхимальные стволовые (стромальные) клетки человека на сегодняшний день считаются одними из самых многообещающих клеток для клеточной терапии и тканевой инженерии. МСК впервые были выделены из костного мозга [Friedenstein, 1976], однако к настоящему времени показано, что они могут быть получены из любых тканей взрослого человека, эмбриона и новорожденного и характеризуются рядом общих свойств, среди которых высокая способность к пролиферации и адгезии, фибробластоподобная морфология и образование колоний в культуре, легко индуцируемая дифференцировка в остео-, хондро-, мио- и адипогенном, а также в некоторых других направлениях [Augello, 2010; Nombela-Arrieta, 2011]. Показано, что во всех тканях МСК располагаются периваскулярно [Amos, 2008; Crisan, 2008; Traktuev, 2008; Zannettino, 2008, Kovacic, 2009; Lin, 2010; Nombella-Arietta, 2011]. Однозначного мнения по вопросу, каким должен быть иммунофенотип МСК не существует, не описаны и уникальные маркёры МСК, а список существующих маркеров все время изменяется и модернизируется. Однако, большинство исследователей описывает эти клетки как позитивные по маркерам SH-2, SH-3, SH-4, STRO-1, Sca-1, CD44, CD29, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124 и негативные по CD34 и CD45 маркерам. Согласно Положению Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy Statement), МСК человека должны экспресировать в большом количестве (более 95%) CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессировать или экспрессировать в малом количестве (менее 1 -2%) маркеры CD14, CD19, CD34, CD45, CD79 и HLA-DR [Dominici, 2006].
Одним из сравнительно новых и перспективных источников МСК является жировая ткань.
В литературе существует несколько названий для смешаннной популяции клеток, выделяемых из стромы жировой ткани, такие как клетки липоаспирата (processed lipoaspirate cells), стволовые клетки из жировой ткани, стволовые клетки жировой ткани, преадипоциты, клетки стромально-сосудистой фракции жира, стромально-сосудистая фракция [Gimble, 2007]. Клетки липоаспирата и стромально-сосудистая фракция представляют собой клетки, полученные непосредственно после обработки ткани коллагеназой, без культивации на пластике. Термин «мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани» (МСК-ЖТ), для которого альтернативным считается термин «мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани» (согласно принятому в 2006 году решению Международной Федерации изучения жировой ткани (IFATS)), относится к адгезировавшей на пластик популяции, включающей в себя сосудистые и адипоцитарные прогениторные клетки и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки [Bailey, 2010]. Термин «стволовые клетки жировой ткани» относится к популяции прогениторных/стволовых клеток (МСК и эндотелиальные прогениторньте клетки) и тем самым входит в термин МСК-ЖТ [Gimble, 2007; Fraser, 2008]. Таким образом, в настоящей работе для описания изучаемой популяции клеток жировой ткани мы использовали термин МСК-ЖТ.
Фенотипические особенности
МСК-ЖТ, как и МСК костного мозга (МСК-КМ), и эмбриональные стволовые клетки, экспрессируют многие маркеры стволовых клеток, такие как Oct4, Pou5fl, Nodal и UTF-1 [Peroni, 2008]. Park и соавт. показали, что экспрессия многих генов плюриопотентности в МСК-ЖТ (Oct-4, Nanog, Rex-1) может быть. выявлена только на ранних сроках пассирования [Park, 2010]. Кроме того, МСК-ЖТ и МСК-КМ постоянно экспрессируют гены, кодирующие факторы, ответственные за ангиогенез, ремоделирование внеклеточного матрикса, пролиферацию и различные пути дифференцировки, включая VEGF, bFGF, PDGF, SDF-1, ММП-2 и -9, TIMPs. К другим генам, ответственным за перестройку матрикса, воспаление, изменение и восстановление тканей и высоко транскрипцируемым в МСК-ЖТ, относятся FGFR3, фибронектин, нейрофилин-1, остеонектин, а также а5, а11 и (31-интегрины [Katz, 2005; Peroni, 2008].
В среде, поддерживающей рост недифференцированных клеток, культивированные МСК-ЖТ и МСК-КМ образуют гомогенные популяции со схожими по размеру и клеточным маркерам клетками [De Ugarte, 2003]. На 2-4 пассаже оба типа клеток экспрессируют CD13, CD29 (рі-интегрин), CD44, CD58, CD90, CD105 и CD166, а также CD73 [Bailey, 2010; Gimble, 2011]. Различия между МСК жировой ткани и костного мозга заключаются в экспрессии молекул адгезии, регулирующих хоуминг и мобилизацию стволовых клеток. Например, МСК-ЖТ экспрессируют CD48d (а4-интегрин, звено для связывания с VCAM-1) в отличие от МСК-КМ. Также у этих двух типов клеток различается паттерн экспрессии CD106 (VCAM-1): МСК-ЖТ экспрессируют CD49d/VLA-4, но не CD106/VCAM-1, а МСК-КМ наоборот. Эти отличия являются очень важными, поскольку именно эти молекулы адгезии и их лиганды регулируют хоуминг стволовых клеток и их мобилизацию [Sudhoff, 2002].
В нескольких работах было также показано, что МСК-ЖТ экспрессируют маркеры перицитов, такие как CD140b (PDGFRB) и NG2 [Amos, 2008; Traktuev, 2008; Kondo, 2009, Lin, 2010], что позволяет некоторым исследователям причислять их к перицитам. Коэкспрессия мезенхимальных, перицитарных и гладкомышечньтх маркеров в МСК-ЖТ превосходит 90% [Traktuev, 2008]. Была обнаружена смена экспрессии различных маркеров при культивировании МСК-ЖТ [Mitchell, 2006; Bailey, 2010]. Так, экспрессия CD34, сравнительно высокая наї свежевыделенных клетках, существенно снижается с пассированием МСК-ЖТ, как и на МСК-КМ [Парфенова, 2006; Suga, 2009].
Таким образом, на сегодня не существует однозначных маркеров МСК-ЖТ, позволяющих как изучать МСК в жировой ткани in situ, так и характеризовать популяцию клеток, выделенных из стромы жировой ткани, in vitro. Наряду с описанным ранее фенотипом, принятым для МСК человека [Dominici, 2006], обсуждается возможность применения новых маркеров, специфичных именно для МСК-ЖТ, однако соглашение по этому вопросу еще не достигнуто [Lin, 2010; Gimble, 2011].
Мультипотентность
В многочисленных работах показано, что МСК-ЖТ, помимо способности к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке, являющейся одним из атрибутивных признаков МСК, могут дифференцироваться в миогенном [Васои, 2004; Di Rocco, 2006], нейрональном [Safford, 2004] направлениях, а также в эндотелиальные, гладкомышечные клетки и даже кардиомиоциты [Rangappa, 2003; Miranville, 2004; Planat-Benard, 2004; Miyahara, 2006; Song, 2007; Jeon, 2008; Kim, 2009; Madonna, 2009; Schenke-Layland, 2009].
Способность к спонтанной мезенхимальной дифференцировке у МСК-ЖТ и МСК-КМ сравнительно одинакова. Разница между двумя типами клеток появляется при использовании специальных индукционных сред. Так, в среде для остеогенной дифференцировки, активность щелочной фосфатазы (ALP) значительно выше у МСК-ЖТ, а минерализация — у МСК-КМ. Оба типа клеток экспрессируют мРНК коллагена типа I, остеокальцина, остеонектина, остеопонтина, ВМР-1, рецептора паратиреоидных гормонов, витамина D, рецептора ретиноевой кислоты и другие факторы, регулирующие остеогенные гены [Zuk, 2001]. In vitro хондрогенез с помощью МСК-ЖТ и МСК-КМ происходит похожим образом: микромассы обоих типов клеток продуцируют протеогликаны, коллаген II типа, хондроитин-4-сульфат и кератин сульфат, и образуют коллагеновый, а не гиалиновый хрящ [Zuk, 2001; Huang, 2002].
Было показано, что МСК-ЖТ обладают потенциалом к дифференцировке в кардиомиоциты in vitro [Rangappa, 2003; Planat-Benard, 2004]. Rangappa и соавт. первые описали появление спонтанно бьющихся клеток спустя неделю после добавления к МСК-ЖТ 5-азацитидина [Rangappa, 2003]. На второй неделе дифференцировки 30% клеток формировали шароподобные структуры, которые спустя неделю начинали биться спонтанно. По данным иммуногистохимии данные структуры окрашивались на тяжелые цепи миозина, тропонина I и а-саркомерного актинина.
В последующем была описана кардиомиоцитарная дифференцировка этих клеток и без добавления каких-либо веществ [Planat-Benard, 2004]. В другом исследовании при высаживании стромально-васкулярной фракции жира на метилцеллюлозу через 6 дней обнаруживали у клеток контрактильную активность, а позже у некоторых и пейсмекерную. Эти данные подтверждают наличие миогенных стволовых клеток в строме жира.
Было также показано, что МСК-ЖТ способны к дифференцировке в функционально активные гепатоцит-подобные клетки, продуцирующие HGF и FGF-1 и 4. Дифференцированные клетки синтезировали мочевину, поддерживали запас гликогена и встраивались в микроархитектонику печени in vivo [Banas, 2007]. Добавление к МСК-ЖТ никотинамида, активина-А, эндотелина-4, HGF и петагастрина приводило к их дифференцировке в клетки поджелулочной железы, секретирующие инсулин, глюкагон и соматостатин[Тітрег, 2006].
Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование
В исследование были включены 62 пациента, у которых были выделены образцы подкожной жировой ткани в ходе хирургических операций. В первую группу (п=31) вошли пациенты, у которых жировая ткань была выделена в ходе операции по поводу эндопротезирования бедренного или коленного сустава (ГКБ №31), общей хирургической (аппендицит, паховая грыжа) или гинекологической (миома матки) патологии (ГКБ №29), травмы верхней или нижней конечности (Центральный институт травматологии и ортопедии им. И.О. Приорова).
Вторую группу (п=31) составили пациенты с ишемической болезнью сердца, стенозирующим коронарным атеросклерозом по данным коронароангиографии, стабильной стенокардией II-IV функционального класса (по классификации Канадского общества по изучению сердечно-сосудистых заболеваний), которым проводилось аортокоронарное шунтирование в Отделе сердечно-сосудистой хирургии Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК МЗСР РФ (рук. академик РАМН Р.С. Акчурин).
Все исследования, связанные с образцами ткани, выполнялись на основании разрешения Этического комитета ФГУ РКНПК МЗСР РФ.
Критериями исключения, общими для обеих групп пациентов, считали: наличие аутоиммунных патологий; наличие злокачественных новообразований, в том числе в анамнезе; наличие острых или хронических воспалительных заболеваний; декомпенсированного сахарного диабета (СД); длительную гормональную или антибиотикотерапию; анемию (гемоглобин 10 г/дл) и гематологические заболевания; острые нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговые травмы в предшествующие 12 месяцев.
Специальными критериями исключения для первой группы больных считали наличие сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта миокарда (ИМ) или миокардита в анамнезе, клиники стенокардии, клинических признаков сердечной недостаточности, нарушений ритма сердца, таких как пароксизмальная или постоянная форма мерцательной аритмии, частая желудочковая экстрасистолия, пароксизмальная желудочковая тахикардия, блокада левой ножки пучка Гиса, выраженных гиперлипидемий.
Разделение пациентов по возрастным группам было основано на классификации возраста ВОЗ (1963). В первой группе пациентов, условно обозначенной нами как пациенты без HBQ выделяли детей 2-12 лет (подгруппа I, средний возраст 7,3±5,4 лет, п=4), пациентов 35-55 лет (подгруппа II, средний возраст 42,3±7,1 лет, п=14) и пациентов старше 60 лет (подгруппа III, средний возраст 66,2±6,8 лет, п=13), а во второй группе пациентов с ИБС — больных в возрасте 44-48 лет (подгруппа А, средний возраст 46,0±1,7 лет, п=6), 52-58 лет (подгруппа Б, средний возраст 55,4±1,9 лет, п=10) и старше 60 лет (подгруппа В, средний возраст 68,9±4,2 лет, п=15). Для того чтобы интервал между возрастными подгруппами составлял не менее 5 лет, в группе кардиологических больных статистическую значимость различий оценивали только между подгруппами А (44-48 лет) и В (старше 60 лет), а в группе больных без ИБС — между всеми подгруппами.
Основные клинические характеристики групп пациентов отражены в таблицах 2 и 3. По основным клинико-анамнестическим показателям подгруппы разных по возрасту пациентов были сопоставимы между собой как для больных ИБС, так и для пациентов без ИБС.
В группе больных ИБС до проведения операции коронарного шунтирования пациенты, получали стандартную терапию: бета-блокаторьт, антиагреганты, статины, а также при наличии показаний назначались ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), блокаторы кальциевых каналов, нитраты, диуретики. Существенных различий в приеме препаратов между возрастными подгруппами не наблюдалось (Табл. 3).
Следует отметить, что группы пациентов с ИБС и без ИБС различались по полу (р 0,001): в группе пациентов без ИБС было 77,4% женщин, а в группе больных ИБС почти все пациенты были мужского пола (87,1%). Учитывая, что пол пациента может оказывать существенное влияние на свойства МСК-ЖТ, в частности, было показано, что МСК-ЖТ мужчин обладают большим остеогенным потенциалом, чем МСК-ЖТ женщин [Aksu, 2008], мы не сравнивали между собой группы пациентов с ИБС и без ИБС. Все сравнения касались только разных возрастных подгрупп внутри двух основных групп пациентов.
МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сравнимы по морфологии, иммунофенотипу и пролиферативной активности, но различаются по накоплению маркеров старения
Клетки, выделяемые из жировой ткани с помощью обработки ферментами, представляют собой смешанную популяцию различных клеточных типов, включающих в себя эндотелиальные клетки, лейкоциты, фибробласты и МСК. При культивировании в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток, ко 2 пассажу в культуре остаются клетки, имеющие фибробластоподобную морфологию и иммунофенотипические характеристики МСК.
На рис. 2 продемонстрирована морфология клеток стромально-васкулярной фракции, выделенных из подкожной жировой ткани пациентов разного возраста и культивированных на пластике в течение 3 дней, и тех же клеток, культивированных до 2 пассажа. Заметных отличий по морфологии клеток между группами пациентов, различающимися по возрасту, выявлено не было. Ко 2-3 пассажу клеточная популяция приобретает более гомогенный вид, что находит отражение в иммунофенотипе клеток.
Анализ иммунофенотипа культивированных до 2-ого пассажа МСК-ЖТ с помощью метода проточной цитофлуориметрии показал, что эти клетки несут мезенхимальные маркеры CD73 ( 85%), CD90 ( 95%) и CD 105 ( 99%), но не экспрессируют или экспрессируют в малом количестве CD 14 ( 10%), CD 19 ( 10%), CD34( 5%), CD45 ( 2%), CD79 ( 10%). Такой профиль экспрессии является типичным для МСК, согласно определению Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy Statement) [Dominici, 2006]. МСК-ЖТ также экспрессируют маркеры, характерные для перицитов, такие как NG2 ( 99%) и PDGFRB ( 80%), что свидетельствует в пользу принадлежности этих клеток к периваскулярным прогениторным клеткам (Рис. 3). Доля клеток, несущих мезенхимальные маркеры, была одинаковой в разных возрастных группах (Табл. 6).
Одной из определяющих характеристик МСК является их мультипотентность, т.е. способность к направленной дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях [Zuk, 2001; Gimble, 2007; Dominici, 2006]. Для подтверждения возможности МСК-ЖТ от пациентов разного возраста дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях мы культивировали выборочные образцы клеток в соответствующих индукционных средах роста. На рис. 4 продемонстрировано, что МСК-ЖТ как молодой, так и пожилой пациенток способны к дифференцировке в обоих направлениях.
Для того чтобы оценить пролиферацию МСК-ЖТ, мы окрашивали клетки флуоресцентным красителем CFSE перед вторым пассированием, а затем культивировали их в обычных условиях в течение 5 дней. С каждым клеточным делением количество красителя в клетке уменьшалось вдвое. Анализируя клеточную популяцию на проточном цитофлуориметре, можно определить, какое количество клеток поделилось определенное число раз (Рис. 5).
Анализ кривых распределения клеток в популяции по количеству делений не выявил статистически значимой зависимости пролиферации МСК-ЖТ от возраста. Однако мы обнаружили, что доля активно делящихся клеток (прошедших более 10 делений за 5 дней) в популяции МСК-ЖТ, выделенных от пациентов группы II (35-55 лет), в среднем в 3,6 раз больше, чем в группе III (старше 60 лет): 5 (3; 6)% vs. 1,4 (0; 5,1)%, соответственно (р=0,07).
Важным маркером старения клеток, напрямую связанным с их пролиферативной активностью, является длина теломерных участков хромосом. Мы оценивали относительную длину теломер в МСК-ЖТ методом ПНР в реальном времени [Cawtoon, 2002] и показали наличие статистически значимой обратной связи между длиной теломер в клетках и возрастом как пациентов без ИБС (rsp=-0,47, р=0,03), так и пациентов с ИБС (г = -0,6, р=0,006). На рис. 6 представлены зависимости длин теломер в МСК-ЖТ и возраста пациентов.
Интересно отметить, что в подгруппах пациентов старше 60 лет средняя длина теломер в МСК-ЖТ больных ИБС была значительно снижена по сравнению со средней длиной теломер в клетках пациентов без ИБС той же возрастной группы (р = 0,01). По-видимому, МСК-ЖТ больных ИБС старели быстрее, не пропорционально возрасту организма. Это может свидетельствовать об активном участии МСК в патогенезе хронических ишемических заболеваний, что приводит к ускоренному клеточному старению и снижению их пролиферативного потенциала.
Ожидаемым результатом оказалось выявление сильной положительной корреляционной связи между длиной теломер в МСК-ЖТ и уровнем пролиферативной активности клеток (г=0,8, р=0,006, п=49).
Косвенным показателем старения МСК считается увеличение экспрессии регулятора клеточного цикла р16 [Sethe, 2006]. Мы не обнаружили значимой связи между содержанием мРНК ріб в клетках и возрастом пациентов, однако в группе больных ИБС отметили тенденцию к увеличению этого показателя в группе В пожилых больных (старше 60 лет) по сравнению с группой А (44-48 лет):2Д8 (1,67; 2,50) vs. 1,09 (0,95; 2,25) отн.ед. (р=0,09).
Таким образом, МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сходны по морфологии и иммунофенотипу, характерному для МСК, обладают способностью дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях, значимо не различаются по пролиферативной активности, однако доля активно делящихся клеток и средняя длина теломер в МСК-ЖТ снижаются с возрастом пациентов.
Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ молодых мышей стимулировать рост кровеносных сосудов на модели подкожной имплантации Матригеля
Ранее нами было показано, что инкубация МСК-ЖТ мыши в условиях гипоксии (1% кислорода, 48 часов) вызывает повышение содержание белка HIF-1а в этих клетках [Ефименко, 2010]. Влияние гипоксии на способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов in vivo мы оценивали на модели ангиогенеза в подкожном имплантате Матригеля.
С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля было установлено, что МСК-ЖТ, культивированные в условиях гипоксии, сильнее стимулировали васкуляризацию подкожных имплантатов Матригеля, чем клетки, культивированные в стандартных условиях (плотность сосудов 150,8 (143,6; 169,5) и 80,1 (75,9; 82,0), соответственно, р=0,06). Различия в эффекте МСК-ЖТ, культивированных в гипоксических или стандартных условиях, наблюдались для капилляров, то есть CD31-положительных образований без просвета или длиной менее 20 мкм (средняя плотность сосудов 143,3 (136,1; 160,0) и 72,3 (67,5; 78,8), соответственно, р=0,05), сосудов среднего калибра, то есть CD31 -положительных образований диаметром или длиной 20-50 мкм (средняя плотность сосудов 5,3 (5,1; 5,6) и 3,0 (2,9; 3,5), соответственно, р=0,002), и зрелых сосудов, диаметром более 50 мкм и окрашенных антителами как против CD31, так и против маркерного антигена перицитов NG2 (средняя плотность сосудов 2,3 (2,1; 2,4) и 0,8 (0,6; 1,0), соответственно, р=0,026) (Рис. 17, 18).
Для того чтобы выявить механизмы усиления способности МСК-ЖТ, культивированных в условиях гипоксии, стимулировать рост кровеносных сосудов, мы оценили экспрессию генов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ, культивированных в гипоксических и стандартных условиях. С помощью ПЦР в реальном времени было обнаружено, что культивирование МСК-ЖТ в условиях гипоксии вызывает повышение содержания мРНК проангиогенньгх факторов, включая VEGF, P1GF, HGF, bFGF, PDGFBB и TGF-(31, а также снижение содержания антиангиогенных факторов (TBS1, эндостатина и PAI-1) (Табл. 14).
