Содержание к диссертации
Введение
4 Метаболизм нейролипинов в организме животных 13
4.1 Введение...' 13
4.2 Биосинтез нейролипинов 16
4.2.1 N-ацилэтаноламиды [20] 16
4.2.2 Первичные амиды жирных кислот 24
4.2.3 N-ациламинокислоты [40] 27
4.2.4 2-ацилглицерины [19, 47] 29
4.2.5 N-ацилдофамины 32
4.2.6 Альтерантивные пути биосинтеза 33
4.3 Катаболизм нейролипинов 38
4.3.1 Гидролазный путь [38, 67, 68] 39
4.3.2 Оксигеназный метаболизм нейролипинов [47, 68] 43
4.3.3 Другие пути катаболизма 51
4.4 Заключение 53
5 Материалы и методы 57
5.1 Приборы 57
5.2 Растворы 58
5.3 Конечные концентрации веществ при инкубации 64
5.4 Определение концентрации белка по методу Лоури [90] 65
5.5 Определение концентрации белка по методу Лоури: микрометод.. 66
5.6 Экстракция липидов из инкубационной смеси 67
5.7 Твердофазная экстракция липидов 67
5.8 Экстракция суммарной фракции липидов из пресноводной гидры 68
5.9 Исследование продуктов экстракции методом вэТСХ ...68
5.10 Исследование продуктов экстракции методом ВЭЖХ 69
5.11 Авторадиография вэТСХ экстрактов, содержавших тритий-меченые вещества 70
5.12 Получение фракционированного гомогената из тканей крысы...71
5.12.1 Выделение фракции цитоплазматических мембран из гомогенатов органов крысы 72
5.12.2 Выделение митохондриальной фракции органов крысы 73
5.12.3 Выделение шероховатого эндоплазматического ретикулума 74
5.13 Очистка и контроль чистоты тритий-меченых липидов ...74
5.14 Синтез N-арахидоноил О-сульфодофамина 75
5.15 Синтез N-арахидоноил-л-этиламино-о-бензохинона 76
5.16 Изучение биосинтетических процессов в гомогенате тканей крысы и пресноводных гидр 76
5.17 Исследование биосинтеза N-ацилдофаминов в культурах клеток глиомы С6 и феохромацитомы РС12 77
5.18 Изучение гидролиза N-ацилдофаминов в осветлённом гомогенате пресноводных гидр 78
5.19 Окисление предшественников нейролипинов тирозиназой 79
5.20 Химическое окисление N-ацилдофаминов и их предшественников 79
5.21 Изучение метилирования нейролипинов 80
5.22 Изучение специфической активности арил сульфотрансферазы..81
5.23 Определение кинетических параметров для реакции сульфатирования 82
5.24 Изучение окисления нейролипинов в митохондриях и плазмалемме 82
5.25 Изучение влияния нейролипинов на NADH оксидоредуктазу плазмалеммы 83
5.26 Изучение взаимодействия AA-DAQ с белками 83
6 Результаты и их обсуждение 86
6.1 Биосинтез нейролипинов 89
6.1.1 Биосинтез нейролипинов в гомогенатах органов крысы 89
6.1.2 Окисление предшественников нейролипинов тирозиназои 101
6.1.3 Биосинтез в культуре клеток глиомы С6 и феохромацитомы РС12 103
6.1.4 Биосинтез в гомогенатах пресноводных гидр 105
6.2 Биохимические превращения N-ацилдофаминов 109
6.2.1 Гидролиз NADA и их предшественников 110
6.2.2 Метилирование N-ацилдофаминов 112
6.2.3 Сульфатирование 120
6.2.4 Окисление 128
7 Заключение 144
8 Выводы 147
9 Список литературы 148
Приложение А 165
Приложение В 173
Приложение С 175
- N-ацилэтаноламиды [20]
- Альтерантивные пути биосинтеза
- Определение концентрации белка по методу Лоури: микрометод..
- Биосинтез нейролипинов в гомогенатах органов крысы
Введение к работе
N-ацилдофамины (NADА) — это сравнительно новая группа сигнальных липидов широкого спектра действия. Они представляют собой амиды дофамина и жирных кислот и относятся к семейству нейролипинов1 — обнаруженных в нервной системе производных жирных кислот по карбоксильной группе, способных взаимодействовать с белками каннабиноидно-ванилоидной системы. На сегодняшний день NADA в виде дофаминамидов арахидоновой, пальмитиновой, олеиновой и стеариновой кислот были идентифицированы в головном и спинном мозге млекопитающих.
Нейролипины рассматриваемой группы одновременно являются ли-гандами и ванилоидного рецептора VR1, и каннабиноидного рецептора СВ1. Активация данных мишеней N-ацилдофаминами вызывает сокращение бронхов и мочевого пузыря, является одним из механизмов синаптической пластичности гиппокампа, повышает чувствительность животных к повышению температуры (гиперальгезия), стимулирует выброс субстанции Р и пептида, родственного кальцитониновому пептиду (CGRP). Последние три явления представляют особый интерес, поскольку они характерны для передачи болевых импульсов. Кроме того, N-ацилдофамины обладают каннабимимети-ческим и вазодилатирующим действием и взаимодействуют с рядом внутриклеточных мишеней: ингибируют каскад арахидоновой кислоты, вследствие чего происходит угнетение активации тромбоцитов, влияют на активность некоторых фосфатаз, что приводит к подавлению транскрипции генома некоторых вирусов, и оказывают иммуносупрессирующее действие.
Учитывая множественность эффектов NADA в живом организме, детальное понимание механизмов их биосинтеза и метаболизма представляет
Нейролипины — это амидные и эфирные производные ненасыщенных жирных кислот, взаимодействующие с белками каннабиноидно-ванилоидной системы значительный интерес, поскольку может дать контроль над одной из защитных сигнальных систем организма. Например, контролируемое человеком повышение содержания N-арахидоноилдофамина в клетках, зараженных вирусом HTV-1, могло бы эффективно подавлять экспрессию его генов, управление ванилоидной системой ноцицепторов — способ облегчения острых и лечения хронических болей.
Кроме того, по своей структуре NADA находятся на стыке двух огромных сигнальных потоков — нейротрансмиттерного, опирающегося на дофамин, и липидного, в основе которого лежит арахидоновая кислота и её метаболиты. N-ацилдофамины вполне могут обеспечивать взаимодействие данных систем на уровне сигнальных молекул и, следовательно, выполнять интернирующую функцию. Однако уверенно рассуждать об этом без знания путей метаболизма N-ацилдофаминов весьма проблематично.
Как было уже сказано выше, к моменту начала данной работы литературные источники изобиловали данными о различных эффектах, оказываемых N-ацилдофаминами в организмах млекопитающих [1-5]. Группой Di Marzo были получены данные о наличии данных веществ в нервной системе крыс и свиней [4, 6], но сведений о том, как эти сигнальные молекулы образуются и инактивируются, не говоря уже о регуляции их метаболизма, практически отсутствовали. Такая ситуация значительно затрудняла понимание места ванилоидной системы в общей структуре информационных потоков организма и, соответственно, приводила к ограничению возможных терапевтических воздействий на неё.
Для того, чтобы заполнить существующий пробел в знаниях о принципах работы каннабиноидно-ванилоидной системы, было принято решение исследовать механизмы метаболизма её сигнальных молекул ванилоидного ряда. Соответственно, была поставлена цель работы: установить пути биосинтеза и катаболизма N-ацилдофаминов в организме животных разных видов. На первой стадии был проведён теоретический анализ возможных пре 9 вращений в рамках метаболического пути N-арахидоноилдофамина и построена теоретическая метаболическая карта (Приложение С). Понимание возможных направлений исследования позволило сформулировать в рамках поставленной цели следующие задачи:
1. Изучить биосинтез N-ацилдофаминов в печени и органах нервной системы крысы, культурах клеток млекопитающих, а также в гомогенатах пресноводной гидры.
2. Исследовать окислительные этапы биосинтеза N-ацилдофаминов в модельной системе.
3. Исследовать метилирование N-ацилдофаминов в печени и нервной системе крысы, а также в пресноводных гидрах.
4. Исследовать сульфатирование N-ацилдофаминов в печени и нервной системе крысы, а также в гомогенате пресноводных гидр.
5. Исследовать окислительный метаболизм катехольного ядра N-ацилдофаминов в тканях крысы и модельных системах.
Уточнив таким образом стратегию работы, мы приступили к экспериментальной проверке существования метаболических путей и установлению их базовых биохимических свойств (специфическая активность).
При выборе субстратов для наших экспериментов мы руководствовались критериями биогенности и высокой биологической активности. Ниже приведены жирные кислоты, чьи производные были использованы в работе, и причины, по которым они привлекли наше внимание:
• арахидоновая кислота — производные обнаружены in vivo, являются агонистами VR1, СВ1 и модулируют активность транскрипционных факторов,
• олеиновая кислота — производные обнаружены in vivo и являются наиболее активными ванилоидами)
• стеариновая кислота — производные обнаружены in vivo, являются представителями класса насыщенных малоактивных молекул,
• докозагексаеновая кислота - производные не обнаружены in vivo, но высокоактивны в модельных экспериментах, а сама кислота является незаменимой и выступает в роли предшественника оксигеназных высокоактивных продуктов.
При выборе объектов исследования мы ориентировались на литературные данные об общем уровне ферментативной активности и о тканевом распределении NADA и остановились на препаратах следующих тканей:
• печень — ткань с наиболее богатым набором ферментов, обеспечивающая выведение и детоксификацию инородных и своих молекул;
• головной мозг — отдел нервной системы, где действие эндованилоидов весьма выражено;
• спинной мозг с дорсальными корешками — важная часть нервной системы, где зафиксирован наибольший после головного мозга уровень N-арахидоноилдофамина.
Кроме того, для анализа биохимических процессов в живых системах были использованы клеточные линии феохромацитомы PC 12 и глиомы Сб. Первая обладает хорошо выраженными системами биосинтеза и метаболизма катехоламинов, а вторая имеет глиальное происхождение, хорошо откликается на действие эндованилоидов и в определённой степени моделирует нервную систему. Поскольку одним из наиболее примитивных организмов, где зафиксировано выраженное действие ацилдофаминов, является пресноводная гидра [7, 8], были проведены работы и на полных гомогенатах двух её видов: Н. attenuata и Н. magnipapillata.
В результате проведённой работы автором было впервые показано, что процесс биосинтеза N-ацилдофаминов протекает в организме крысы без участия кофермента А и стимулируется АТФ, причём наиболее эффективными предшественником данных веществ является комбинация свободной жирной кислоты с тирозином, а при биосинтезе с промежуточным образованием N-ацилтирозина стадия декарбоксилирования должна предшествовать стадии окисления. Несомненным приоритетом данного исследования является идентификация N-докозагексаеноилдофамина в тканях пресноводных гидр Н. attenuata и И. magnipapillata и обнаружение биосинтеза N-ацилдофаминов в полном гомогенате этих организмов.
Автором были значительно уточнены имевшиеся ранее данные о метилировании N-ацилдофаминов в цитозольной фракции органов крысы. Впервые была исследована возможность метилирования N-ацилдофаминов в мик-росомальной фракции органов крысы и в полном гомогенате пресноводных гидр Н. attenuata и Н. magnipapillata.
В результате проведённого исследования впервые было продемонстрировано сульфатирование дофаминамидов арахидоновой, докозагексаеновой, олеиновой и стеариновой кислот, причём для превращения N-докозагексаеноилдофамина в головном мозге определены кинетические параметры процесса. Впервые было зафиксировано сульфатирование N-ацилдофаминов в полном гомогенате пресноводных гидр Н. attenuata и Н. magnipapillata.
Приоритетными являются данные о взаимодействии N-ацилдофаминов с окислительными системами митохондрий и плазмалеммы печени и органов нервной системы крысы. Впервые продемонстрирована способность ацили-рованных длинноцепочечными полиненасыщенными жирными кислотами гс-этиламино-о-бензохинонов вступать в реакцию с SH-содержащими агентами с образованием ковалентных аддуктов, в том числе с белками, что приводит к олигомеризации последних. Эти данные могут быть использованы для диагностики нейродегенеративных заболеваний и, возможно, для создания новых терапевтических подходов при лечении этих заболеваний.
Настоящая работа призвана заполнить существующий пробел в области знаний о метаболизме эндованилоидов дофаминового ряда. В результате проведённых исследований становятся ясны основные пути превращений, которые претерпевают N-ацилдофамины, а также основные принципы их биосинтеза. Основываясь на полученных данных, возможно проведение дальнейших работ, направленных на установление регуляторов системы метаболизма этих веществ и точного позиционирования их в сигнальной сети целого организма.
Кроме того, полученные знания о метаболизме NADA могут в будущем послужить основой для создания лекарственных препаратов, направленных на коррекцию работы каннабиноидно-ванилоидной системы.
N-ацилэтаноламиды [20]
N-арахидоноилэтаноламин, впервые выделенный из живого организма в 1992 году [12], стал первым веществом, официально названным эндогенным лигандом каннабиноидного рецептора. Правда, по мере накопления данных, это утверждение становится всё менее однозначным. В самом деле, в норме в головном мозге его весьма мало. Эффективных путей биосинтеза данного вещества, способных производить большие его количества, нет: обращение действия гидролазы происходит в весьма нефизиологических условиях, а содержание основного предшественника, N-арахидоноилфосфатидил-этаноламина, в тканях весьма мало. Кроме того, анандамид выступает в качестве только лишь частичного агониста собственного рецептора СВ1 (а равно и СВ2), что достаточно необычно. Вполне может быть, что для данного вещества существуют другие рецепторы, или же его функция в организме отличается от предполагаемой [19].
N-пальмитоил- и N-стеароилэтаноламид — насыщенные аналоги анандамида — были обнаружены гораздо раньше, чем он сам. В 1965 году они были выделены из головного мозга (35,7 мкг/г), печени (5,75) и мышц (1,2) крысы и морской свинки (количества приведены для тканей крысы). В легких, сердце, селезенке, кишечнике, почках и в крови эти вещества не детектировались (предел чувствительности применённого в данной работе метода составил 0,005 мкг/г сырого веса). Другие N-ацилэтаноламиды также не были обнаружены [21]. Примерно в это же время был продемонстрирован биосинтез этих веществ в микросомальной фракции печени [10]. Однако использо ванные в данной работе концентрации исходных веществ указывают на то, что, скорее всего, авторы наблюдали не результат активности истинных систем биосинтеза, а обращение действия гидролазы амидов жирных кислот.
Биосинтез собственно анандамида впервые был показан группой Di Marzo в 1995 году [22]. Процесс был кальций-зависимым и блокировался ингибиторами фосфолипазы D. В этой же работе было обнаружено аналогичное образование производных пальмитиновой, олеиновой, стеариновой, линоле-вой и у-линоленовой кислот.
Считается, что основная часть анандамида в живом организме формируется по трансацилазно-фосфодиэстеразному пути (Рис. 2). Сначала из sn-1 положения глицерофосфолипида на аминогруппу фосфатидилэтаноламина переносится остаток жирной кислоты кальций-зависимым ферментом N-ацилтрансферазой. Затем полученный предшественник гидролизуется специальной фосфолипазой D.
Считается, что при биосинтезе N-ацилэтаноламидов скорость образования конечного продукта определяется ферментом N-ацилтрансферазой, осуществляющей, как было уже указано выше, межмолекулярный перенос остатка жирной кислоты с образованием промежуточного продукта N-ацил-фосфатидилэтаноламина. Данный фермент был охарактеризован в препаратах головного мозга и семенников крыс, а также сердца собак. Донорами остатка жирной кислоты в катализируемой ею реакции могут выступать кар-диолипин [24], фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, фосфатидилэтано-ламин (данный субстрат, правда, был неэффективен в работе [23]), но не свободная жирная кислота или её СоА-эфир. Фосфатидилсерин и фосфатидили-нозит в качестве доноров не тестировались [25]. В качестве акцептора тран-сацилаза может использовать и фосфатидилэтаноламин (РЕ), и лизо-РЕ [26]. Остаток жирной кислоты переносится исключительно из sn-І положения субстрата. Фермент не принимает во внимание жирные кислоты во втором положении донора и жирнокислотный состав акцептора. В ходе исследования N-ацилтрансферазной активности при использовании меченого фосфати-дилхолина (PC) в качестве донора в инкубационной среде помимо ожидаемых N-ацилфосфатидилэтаноламинов, меченых по остатку жирной кислоты, присоединённой через азот, было зафиксировано также накопление меченных по первому положению РЕ и N-ацил-РЕ, и потому представляется весьма вероятным и внутримолекулярный перенос N-ацильного остатка. Выделения жирной кислоты в окружающую среду при переносе обнаружено не было. В ряде экспериментов была зафиксирована О-трансацилазная активность, ассоциированная с рассматриваемым процессом, однако, чистый фермент пока ещё не выделен, и потому нельзя однозначно приписать ему данное действие. N-ацилтрансфераза является мембранным ферментом; больше всего её в микросомах, за ними следуют синаптосомы и митохондрии. Оптимальный рН реакции 7—10, АТР и другие источники энергии не нужны, Са существенно стимулирует активность, хотя не ясно, напрямую или косвенно. В организме крысы наивысшая активность данного фермента зафиксирована в головном мозге, семенниках и мышцах. В головном мозге фермент наиболее активен в стволе мозга. Любопытной особенностью является тот факт, что у взрослых активность данного фермента в головном мозге ниже, чем у детей [27].
Недавно по гомологии с лецитин: ретинол N-ацилтрансферазой была клонирована ещё одна N-ацилтрансфераза, способная участвовать в биосинтезе N-ацилэтаноламинов [28]. Она расположена в цитоплазме, не стимулируется кальцием и не различает sn-1 и sn-2 положения донора. Свободная жирная кислота и её СоА-эфир донорами N-ацильной группы для рассматриваемого фермента не являются. рН оптимум оказался равным 9,0, что на единицу больше такового для мембранной N-ацилтрансферазы. Одним из продуктов инкубации меченого пальмитоилфосфатидилхолина с немеченым фосфатидилэтаноламином в присутствии этой N-ацилтрансферазы был
N-пальмитоиллизофосфатидилэтаноламин, что может говорить в пользу внутримолекулярного переноса остатка. Механизм действия кальций-независимой N-ацилтрансферазы заключается в образовании промежуточного продукта в виде остатка жирной кислоты, ковалентно связанного с SH-группой цистеина фермента на первой стадии. После этого происходит перенос остатка на воду, кислород или азот, что является причиной разнообразия альтернативных активностей фермента (ацилирование лизофосфолипидов и РЕ, работа в роли фосфолипаз А] и А2) [27]. В этом контексте стоит отметить, что один из эндоканнабиноидов, для которых механизм биосинтеза абсолютно не известен, это сложный эфир арахидоновой кислоты и этаноламина ви-родамин. Весьма заманчиво предположить, что именно рассматриваемый фермент мог бы обеспечивать образование виродамина, однако, проверка этой гипотезы пока не проводилась.
Наивысшая активность рассматриваемого белка (20 пмоль/минхмг) была зафиксирована в семенниках крысы, за ними следовали желудок, подвздошная, слепая и прямая кишки. Кроме того, некоторая активность детектировалась также в головном мозге, тимусе, сердце, лёгких, печени, селезёнке, в скелетных мышцах она была крайне мала, а в почках вообще не обнаруживалась. Следует отметить, что исходный фермент, по гомологии с которым искали белки, выделенные в данной работе, РЕ не трансацилирует.
После синтеза предшественника образование N-ацилэтаноламида становится in vivo практически неизбежным, поскольку для гидролиза N-ацил-фосфатидилэтаноламина задействуется несколько альтернативных путей: фосфолипаза D, гидролизующая N-ацилфосфатидилэтаноламин, некоторые фосфолипазы Ai и А2 совместно с а/(3-гидролазой Abh4 и глицерофосфодиэ-стеразой GDE1, фосфолипаза С с последующим действием фосфатаз PTPN22 или SHIP 1.
Основной фермент, синтезирующий анандамид из его предшественника, это фосфолипаза D, гидролизующая N-ацилфосфатидилэтаноламин. Не давно она была клонирована и оказалась белком массой 46 кДа, состоящим из 396 аминокислотных остатков. Фермент относится к семейству металло-(3-лактамаз. Кристаллической структуры этой фосфолипазы пока нет, но результаты молекулярного моделирования указывают на наличие двух атомов цинка в её молекуле, а также нескольких остатков гистидина и аспарагино-вой кислоты, необходимых для катализа [27]. Активность фермента ингиби-руется SH-модифицирующими агентами.
Альтерантивные пути биосинтеза
Один из первых открытых путей образования всех нейролипинов, обнаруженный ещё на заре их исследования, заключается в прямом энергонезависимом соединении жирной кислоты и соответствующей аминной части.
В работе Fukui [51] было показано, что фенилаланин, триптофан, лейцин, а также (в меньшей степени) глицин, валин, лизин и аланин могут встраиваться в липиды в цитоплазматической и в микросомальной фракциях печени крысы. В качестве липидного субстрата обезжиренных ферментативных систем могли выступать моноолеин, монопальмитин и лецитин, в то время, как триолеин и трипальмитин — нет. Неожиданно для авторов работы выяснилось, что свободная олеиновая и пальмитиновая кислоты также являются отличными субстратами. Насыщения системы липидами и аминокислотами не наблюдалось. Оптимальное значение рН реакции составило 9,0, хотя активность сохранялась в диапазоне от 7,4 до 11. Было установлено, что в результате реакции образуется амид жирной кислоты и аминокислоты. Авторы предположили, что обнаруженная ими активность может быть обращением действия гидролитического фермента, поскольку длительная инкубация пальмитоилфенилаланина привела к его практически полному гидролизу. Однако, такое неоптимистичное заявление не остановило других исследователей, и в 1963 году группа Bachur [10] показала, что микросомальная фракция печени крысы синтезирует амиды жирных кислот с чётным числом атомов углерода. Инкубационная смесь неизвестного объёма содержала 60 мкмоль этаноламина и 1 мкмоль кислоты при рН 9,0. Производительность реакции можно было повысить на 30% добавлением АТР в сочетании с Со А, но не каждым из этих веществ в отдельности. В качестве субстратов были изучены и дали положительный ответ кислоты с длиной углеродной цепи от С12 до С24, как насыщенные, так и ненасыщенные; холин и аминокислоты (серии, фенилаланин, аланин, треонин, глицин) не были активны, зато амины (фенилэтиламин, (3-гидроксифенилэтиламин, 1-амино,2-пропанол, этанола-мин) хорошо N-ацилировались. Существенным отличием данной работы был тот факт, что синтез протекал быстрее гидролиза в 15 раз, а внесение микромолярных количеств готового пальмитоилэтаноламида его не ингибировало. Дальнейшее развитие этих исследований [52] показало, что описанный биосинтетический процесс наблюдается не только в печени, но и в почках, селезенке, мышцах и головном мозге; разнообразные источники энергии (креатин фосфат, GTP, CDP, NADH, NADPH, CDP-диглицерид) по-прежнему не оказывали стимулирующего эффекта. Ряд аминных субстратов пополнился гис-тамином, тирамином и триптамином, причём последний, и только он один, ингибировал N-ацилирование этаноламина. Весьма любопытным представляется наблюдение авторов, что вновьобразованный амид встраивается в мембрану и оказывается защищенным от гидролиза, по крайней мере, на час. Рассуждая о механизме наблюдаемой реакции, исследователи упоминают, что искусственные субстраты гидроксиламин и гидразин тоже N-ацилируют-ся в их системе, следовательно, должна каким-то образом активироваться жирная кислота, а не амин. Существенно продвинуться в объяснении данного процесса им не удалось, однако, в более поздней работе [53] был обнаружен обмен 180 между жирными кислотами и водой, катализируемый липазой кар-боксилэфиров поджелудочной железы (ЕС 1.1.1.13). Лимитирующей стадией реакции было N-ацилирование фермента. Теоретически, можно предположить, что подобный активированный конъюгат может быть атакован не только водой, но и аминами, которые при щелочных значениях рН являются хорошими нуклеофилами.
Основным недостатком вышеупомянутых пионерских работ была крайне высокая, нефизиологическая концентрация аминов в инкубационной среде (60—120 мМ при концентрации этаноламина в головном мозге 3,14 мкмоль/г ткани, а в печени — 0,1—0,4 мкмоль/г ткани [25]. Именно поэтому большинство современных исследователей подвергают сомнению возможность такого пути in vivo и склонно трактовать эти результаты в пользу первых данных об обращении активности гидролазы амидов жирных кислот [54-56].
Несмотря на то, что при больших концентрациях аминов упомянутый фермент действительно проявляет синтетическую активность, вопрос о существовании прямого N-ацилирования аминов в живых организмах нельзя считать решённым. Ситуация осложняется данными из области биохимии, изучающей метаболизм ксенобиотиков. В живом организме инородные соединения могут быть детоксифицированы двумя путями: во-первых, их растворимость может быть повышена за счёт конъюгации с глюкуроновой кислотой и аминокислотами, и тогда они будут выведены из организма. Во-вторых, возможно N-ацилирование этих веществ жирными кислотами с последующей, не всегда безопасной, изоляцией в жировой ткани [57]. Для таких веществ, как этанол и его полигалоидзамещённые аналоги, лекарствен ные препараты (кодеин и 11-гидрокси А -тетрагидроканнабинол), инсектициды (ДДТ), анилин [58] показано образование эфиров и амидов с насыщенными жирными кислотами с длиной цепи от 10 до 16 атомов углерода, а также с линолевой, олеиновой и С18:3 кислотами. В организме человека эти вещества образуются в печени, поджелудочной железе, сердце, головном мозге, жировой ткани, аорте и скелетных мышцах (а у крысы ещё и в легких и плаценте); поджелудочная железа обеспечивает основную часть синтеза. При этом для наиболее изученных эфиров этанола наблюдается линейная корреляция между количеством образованного эфира и концентрацией исходного спирта в крови.
Основной фермент, обеспечивающий конъюгацию жирных кислот и ксенобиотиков, это синтаза эфиров жирных кислот и этанола (FAEES, fatty acid ethyl ester synthase), выделенная из печени и поджелудочной железы. Распределение данного фермента в тканях таково: максимальная активность наблюдается в поджелудочной железе, затем идут печень, семенники, тонкий кишечник и сердце. Большая часть активности ассоциирована с микросо-мальной фракцией [59, 60]. В печени этот белок представляет собой тример с массой мономера 60 кДа и специфической активностью порядка 2000 нмоль/часхмг; он относится к группе карбоксиэстераз. Аналогичный фермент из поджелудочной железы несколько иной: он является димером и принадлежит к холестерин эстеразам. Исследования рассматриваемых белков проводили при рН 7,2—7,5. Важно отметить, что для этого же фермента продемонстрирован синтез N-ацилэтаноламидов олеиновой, пальмитиновой, стеариновой, линолевой, линоленовой и арахидоновой кислот (16,3, 6,7, 6,2, 8,1, 8,3, и 7,6 нмоль/часхмг, соответственно) [61], вновь при весьма значительной концентрации этаноламина 25 мМ. Значение обнаруженного феномена для нейролипинов центральной нервной системы выглядит весьма спорным, однако, в периферических тканях он может играть важную биосин тетическую роль, по крайней мере, для N-ацилдофаминов или N-ацилирован-ных аминокислот.
Определение концентрации белка по методу Лоури: микрометод..
Рабочие растворы (реактив С и раствор реактива Фолина) готовили в день исследования. Для анализа отбирали аликвоту изучаемого раствора объёмом 100 мкл. Исследуемый раствор последовательно разводили буфером, в котором был белок, в 2 и 3 раза. Для анализа отбирали 30 мкл каждого разведения, добавляли 120 мкл воды и 150 мкл 2N NaOH для денатурации белка. В качестве контроля использовали 150 мкл соответствующего буфера. В каждую пробу вносили 3 мл реактива С, перемешивали и инкубировали 15 мин. на столе. Затем добавляли 300 мкл реактива Фолина и помещали пробы на 40 мин. в темноту. После этого измеряли оптическую плотность образцов пли длине волны 500 нм, и определяли концентрацию белка по калибровочной кривой, построенной по стандартным растворам бычьего сывороточного альбумина.
В том случае, если исходно белок был растворен в буфере HEPES, проводили предварительное осаждение белка равным объемом 7,5% трихлорук-сусной кислоты в течение 15 мин. при комнатной температуре, затем пробы центрифугировали 5 мин. с ускорением 18 000 g и отбрасывали надосадоч-ную жидкость. Осадки промывали 50 мкл этанола и перерастворяли в 200 мкл IN NaOH. Для приготовления разведений отбирали 20, 40 и 60 мкл данного раствора и доводили объем до 300 мкл IN NaOH. Дальнейшие действия не отличались от описанных выше. После определения три концентрации белка, рассчитанные с учетом разведений, усредняли. Определение концентрации белка по методу Лоури: микрометод
Рабочие растворы (реактив С и раствор реактива Фолина) готовили в день исследования. Для анализа отбирали аликвоту исследуемого раствора объёмом 100 мкл. Исследуемый раствор последовательно разводили буфером, в котором был белок, в 2 и 3 раза. Для анализа отбирали 15 мкл каждого разведения и добавляли 15 мкл 2N NaOH для денатурации белка. В качестве контроля использовали 15 мкл соответствующего буфера. В каждую пробу вносили 0,3 мл реактива С, перемешивали и инкубировали 10 мин. на столе. Затем добавляли 30 мкл реактива Фолина, немедленно перемешивали образцы на вортек-се и инкубировали на столе 25 мин. После этого отбирали из каждого образца 150 мкл в пластиковый 96-луночный планшет с плоским дном лунок и измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 620 нм (не закрывая планшет крышкой). Концентрацию белка определяли по калибровочной кривой, построенной по стандартным растворам бычьего сывороточного альбумина.
В том случае, если исходно белок был растворен в буфере HEPES или Tris-HCl, проводили предварительное осаждение белка равным объемом 7,5% трихлоруксусной кислоты в течение 15 мин. при температуре -20С, затем пробы центрифугировали 5 мин. с ускорением 18000 g и отбрасывали надо-садочную жидкость. Осадки промывали 50 мкл этанола и перерастворяли в 100 мкл IN NaOH. Для приготовления разведений отбирали 30, 15 и 7,5 мкл данного раствора и при необходимости доводили объем до 30 мкл IN NaOH. Далее действовали, как описано выше, начиная с шага добавления реактива С.
После определения три концентрации белка, рассчитанные с учетом разведений, усредняли. Экстракция липидов из инкубационной смеси Продукты инкубации экстрагировали из инкубационной смеси по модифицированному методу Фолча [91]. Для улучшения экстракции перед каждым добавлением органической фазы образцы подкисляли, добавляя 1,25% исходного объема пробы CF3COOHKOHU. К исследуемому образцу добавляли утроенный объём смеси хлороформ : метанол 2:1, тщательно перемешивали в течение 1 мин. и центрифугировали 5 мин. при 2000 g. Органическую (нижнюю) фазу отбирали в другую ёмкость. Полученные образцы упаривали досуха и перерастворяли в нужном объёме метанола (для ВЭЖХ) или хлороформа (для вэТСХ). Эффективность экстракции из инкубационной смеси составляла 85% для N-арахидоноилтирозина и 50% для N-арахидоноилдофамина. Твердофазная экстракция липидов Для твердофазной экстракции липидов использовали микроколонки С8 фирмы Alltech. Предварительно колонку медленно промывали 10 мл метанола. Последующие операции проводили в режиме фильтрации под вакуумом с использованием водоструйного насоса. Перед нанесением образца колонку последовательно промывали 3 мл метанола, 3 мл ацетонитрила, 3 мл 50% метанола, 3 мл воды. На время нанесения образца установку отключали от вакуума и поднимали давление в приёмном сосуде до атмосферного. После на-ненесения образец промывали 2 мл воды. Исследуемые вещества элюировали 2 мл 80% метанола. С помощью одной колонки экстрагировали не более 10 образцов, каждый раз проводя полный цикл регенерации, как описано выше. Полученные образцы упаривали досуха и перерастворяли в перерастворяли в нужном объёме метанола (для ВЭЖХ) или хлороформа (для вэТСХ). 5.8 Экстракция суммарной фракции липидов из пресноводной гидры Экстракцию общих липидов из тканей гидры проводили по модифицированному методу Фолча [91] при температуре 4С. Перед экстракцией к образцу добавляли 50 мкл концентрированой уксусной кислоты. Образцы тканей гидры гомогенизировали в 10 мл смеси хлороформ : метанол 2:1, добавляли 3 мл деионизованной воды и центрифугировали 10 мин. с ускорением 1000 g. Нижнюю (хлороформенную) фазу отбирали, а остаток дважды реэкс-трагировали указаной смесью хлороформ : метанол. Экстракт упаривали на роторном испарителе досуха и перерастворяли в 500 мкл метанола. Аликвоту финального экстракта объёмом 2 мкл последовательно хро-матографировали в системах хлороформ : метанол : уксусная кислота 4:1: 0.1% (до половины пластинки) и бензол : этил ацетат : уксусная кислота 4:1: 0.45% (до конца пластинки) на пластинке Merck 5554. Дорожку со стандартом обнаруживали опрыскиванием 10% раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле с последующим нагреванием при 120С. Зону от N-арахидоноилдофамина до N-арахидоноил-З-О-метилдофа-мина включительно тщательно соскабливали и элюировали 2 мл смеси хлороформ : метанол 1:1. Полученый экстракт упаривали досуха с помощью аппарата Savant SpeedVac Concentrator без нагревания и перерастворяли в 100 мкл метанола. 5.9 Исследование продуктов экстракции методом вэТСХ Основные работы по разделению продуктов, экстрагированных из инкубационной среды, проводили путём тонкослойной хроматографии на пластинках Merck 5554. Хроматографию проводили в предварительно насыщенной камере. После нанесения экспериментальных образцов (объём 15 мкл) в каждую точку вносили стандартную смесь немеченых веществ. Каждая пластинка содержала отдельную дорожку со смесью стандартов. В экспериментах по изучению биосинтеза, окисления и метилирования экстракты инкубационных смесей последовательно хроматографировали в системах хлороформ : метанол : уксусная кислота 4:1: 0,2 (v : v : %) до половины пластинки и бензол : этилацетат : уксусная кислота 4:1: 0,4 (v : v : %) до конца пластинки. Между двумя хроматографиями пластинку высушивали под тягой при комнатной температуре. Вещества обнаруживали опрыскиванием 10% раствором фосфорномо-либденовой кислоты в этаноле с последующим нагреванием при 120С. При использовании аналогов веществ, меченных тритием, зоны, соответствовавшие исследуемым веществам, тщательно соскабливали во флакон со сцинтиллятором, и определяли их радиоактивность. При этом окрашивание радиоактивной зоны пластинки не проводили.
Биосинтез нейролипинов в гомогенатах органов крысы
К началу наших работ по литературным данным образование N-арахи-доноилдофамина было зафиксировано при добавлении арахидоновой кислоты в сочетании с дофамином или тирозином к гомогенату печени [16]. В связи с этим, после подготовительного этапа работ мы проверили принципиальную возможность биосинтеза этого вещества в полных гомогенатах печени, спинного и головного мозга крысы. Для этого арахидоновую кислоту инкубировали с тирозином или дофамином с добавлением кофакторов основного фермента биосинтеза катехоламинов тирозин гидроксилазы и без них. В качестве отдельного предшественника использовали N-арахидоноилтирозин, который может выступать в качестве промежуточного продукта при биосинтезе AA-DA из жирной кислоты и тирозина или фенилаланина. Продукты реакции анализировали с помощью офВЭЖХ, специально подобранные условия которой позволили нам детектировать все основные компоненты метаболического пути AA-DA на одной хроматограмме (Рис. 7). Для каждой ткани в качестве одного из контролей проводилось хроматографическое исследование экстрактов липидов из пустого гомогената (Приложение В), при этом пики, соответствующие изучаемым веществам, обнаружены не были.
Для подтверждения результатов предыдущего метода и выявления низкоэффективных метаболических процессов в реакцию вводили аналоги жирной кислоты, меченные тритием, и использовали ВЭЖХ с детектированием радиоактивности. Хроматограмма стандартной смеси веществ. ВЭЖХ с фотометрическим детектированием; изократическая элюция. Детектирование при длинах волн UV - 220 нм, FLU - 280 нм.
Литературные данные о биосинтезе N-арахидоноилдофамина свидетельствуют в пользу крайне низкой скорости данного процесса — на уровне 10—15 нмоль/час на 1 г сырого веса ткани. С этим вполне согласуется тот факт, что в опытах с немечеными предшественниками нам не удалось зафиксировать заметного образование данного вещества ни в одной ткани, и лишь введение в реакцию тритиймеченых веществ позволило обнаружить его биосинтез.
Мы зафиксировали образование AA-DA или его ближайшего метаболита N-арахидоноил-З-О-метилдофамина во всех изученных тканях — в печени, головном и спинном мозге, однако, условия продуктивных реакций обладали определенной вариабельностью (Табл. 3). Табл. З — Исследование метаболизма N-арахидоноилдофамина с ис-пользованием [ Н]-АА, [ H]-AAyr, [ HJ-AA-DA. Анализ проводили оф-ВЭЖХ с детектированием радиоактивности. Условные обозначения: АА-3MeDA — N-арахидоноил-З-О-метил-дофамин; AA — арахидоновая кислота, SAM — S-аденозилметионин; NADPH — никотинамиддинуклеотидфосфат, восстановленная форма; ТНР — тетрагидробиоптерин; нд — не тестировали. Количество внесённого радиоактивного субстрата (AA, AAyr, AA-DA) — 46,7 пмоль, объём инкубации 200 мкл, 2 мг/мл белка.
Во всех трёх тканях наибольшая эффективность биосинтеза была зафиксирована для комбинации арахидоновой кислоты и тирозина в качестве субстрата. При этом добавление кофакторов тирозин гидроксилазы, ключевого фермента биосинтеза катехоламинов, в печени и спинном мозге приводило к снижению количества AA-DA в экстракте, хотя в первом гомогенате это происходило на фоне некоторого возрастания количества AA-3MDA. В головном мозге ситуация была обратной — в экстракте инкубационной смеси, содержавшей кофакторы, было больше AA-DA, но меньше AA-3MDA. Подобное явление согласуется с данными о распределении тирозин гидроксилазы в организме с минимумом в печени и большой концентрацией в головном мозге [107, 108]. В такой ситуации в печени введение доноров восстановительных эквивалентов должно усиливать неспецифическое окисление в растворе, результатом которого будет, с одной стороны, ускорение деградации субстрата и N-арахидоноилдофамина, а с другой стороны, увеличение его доступности для растворимой формы катехол О-метилтрансферазы. В головном мозге, напротив, доступность кофактора присутствующей там специфической оксидазы должна конкурентно снижать скорость неспецифических процессов. При этом особенности локализации фермента могут приводить, например, к встраиванию вновьсинтезированного AA-DA в мембрану и к его недоступности для систем метилирования.
Использование в качестве исходных веществ арахидоновой кислоты и дофамина было результативным только в спинном и головном мозге, причём в последнем случае в экстракте детектировался не свободный N-ацилдофа-мин, а его метилированная форма. N-арахидоноилтирозин проявил себя в качестве предшественника неоднозначно. С одной стороны, в печени и головном мозге эффективность образования AA-DA и AA-3MDA была минимальной по сравнению с другими исследованными субстратами. Одна из возможных причин этого явления — окислительная деградация вещества в результате рассогласованной работы оксидаз и декарбоксилаз (см. раздел 6.1.2). С другой стороны, в спинном мозге при добавлении АА-Туг вместе с кофакторами тирозин гидроксилазы было зафиксировано накопление значительного количества N-арахидоноил-З-О-метилдофамина, причём оно на порядок превышало содержание в экстракте AA-DA и AA-3MDA для других субстратов. По-видимому, этот факт является следствием вероятной низкой активности ацилирующих ферментов спинного мозга (затруднение синтеза N-ацилдофаминов de novo) на фоне малого содержания окислительных систем (снижение окислительной деградации субстрата).
Важно отметить, что при инкубации арахидоновой кислоты с тирозином как в присутствии кофакторов, так и без них, появление ожидаемого пика N-арахидоноилтирозина не наблюдалось. Мы предположили, что наблюдаемый факт свидетельствует о том, что данное вещество чрезвычайно эффективно превращается в другие продукты. Поскольку мы обнаружили значительное влияние различных кофакторов на эффективность биосинтеза, была проведена отдельная серия экспериментов по детальному изучению их влияния (Табл. 4, Табл. 5, Рис. 8).
В качестве субстратов использовали тритий-меченые арахидоновую кислоту в сочетании с тирозином и N-арахидоноилтирозин, продукты реакции анализировали методом высокоэффективной ТСХ (вэТСХ) со сцинтил-ляционным счётом. Каждый эксперимент повторяли три раза. Поскольку выборка из трёх повторов слишком мала для статистической обработки, фильтрацию выпадающих значений проводили вручную, при этом анализировали и исходный, и «очищенный» наборы данных [109]. Общая картина влияния кофакторов после указанной статистической обработки не изменялась, однако разброс данных значительно сокращался. Табл. 4 — Влияние кофакторов на накопление радиоактивности в пятне N-арахидоноилдофамина. Нд — не исследовали.
В гомогенате печени влияние кофакторов на биосинтетические процессы было весьма выраженным. Добавление тетрагидробиоптерина и пиридоксальфосфата последовательно усиливало биосинтез N-арахидоноилдофамина, а 3-иодотирозин, блокатор тирозин гидроксилазы, несколько ингиби-ровал данный процесс. Эти данные согласуются с гипотезой о деградации данного субстрата вследствие неспецифического окисления. Соотвестствен-но, роль пиридоксальфосфата заключается в стимулировании декарбоксили-рования молекулы (с её стабилизацией — см. раздел 6.1.2), а тетрагидробио 95 птерин без железа может несколько стимулировать специфическое, контролируемое окисление. Добавление кофакторов к гомогенату спинного мозга несколько инги-бировало образование AA-DA. Вероятно, это является следствием усиления неспецифического окисления в случае тетрагидробиоптерина и стимулирования неизвестных ферментов пиридоксальфосфатом. Добавление 3-иодотирозина снимало данный эффект, подавляя окисление и тем самым давая больше времени системам декарбоксилирования.
