Введение к работе
Актуальность проблемы. На протяжении последних лет развитие криоконсервирования крови в нашей стране шло преимущественно по пути использования температуры жидкого азота (Аграненко В.А., 1980; Аграненко В.А., Федорова Л.И., 1983 ). Однако для практических учреждений службы крови более доступно криоконсервирование крови при умеренно низких температурах (Петров М.М.", 1985; Терехов Н.Т., 1973 ). Данный метод особенно выгоден там, где нет жидкого азота, где он дефицитен или требует для доставки длительной транспортировки. Метод криоконсервирования при умеренно низких температурах характеризуется тем, что ограждение эритроцитов производится с по- 1 мощью высоких концентраций глицерина 40 - 50$ масса/объем и который можно реализовать на выпускаемых промышленностью установках, работающих на электроэнергии (рефрижераторов} ( Бурдыга М.А., 1967; Буденная Н.П., 1986; Ме^мео, Н.т, 1977; Safer/CA , 1973 J .
Исследования показали, что хранение клеток в диапазоне температур -30 + -80С возможно от нескольких месяцев до 1 - 2 лет, в зависимости от природы клеток и применяемого криопротектора. При более длительном хранении происходит деструкция клеток, что связы-^ вают с повреждением их плазматических мембран. В работах некоторых авторов ( Pt-i&or 0.8., 1971; Woefaar fi.e.% 1974) подчеркивается, что причиной прогрессирующего гемолиза в размороженно-отмытых эритроцитах является наличие в мембранах скрытых повреждений, которые возникают в процессе замораживания-оттаивания и последующего хранения. Предполагают, что эти повреждения развиваются на молекулярном уровне в результате изменения фазового состояния липидов и бе-лок-липидных.комплексов мембраны (Белоус A.M., Бондаренко Т.П. и соавт., 1978; Гулевский А.К., 1986) . Согласно современным представлениям наиболее существенным следствием структурных изменений скрытого характера является нарушение одной из основных функций биологической мембраны - ее барьерных свойств (Гулевский А.К.,1987;
Valeria.., 1976; /VW т. , 1976) . Несмотря на важное значение нарушения проницаемости для ионов и биомолекул в условиях низкотемпературного воздействия в настоящее время по этому вопросу имеются единичные сообщения, которые не позволяют полностью охарактеризовать структурно-функциональные изменения плазматических мембран клеток при температурах -30 + -80С. Поэтому исследование структурно-функциональных свойств эритроцитов и, особенно, барьерных свойств их мембран для ионов и биомолекул в области умеренно низких температур представляет существенный теоретический и практи-
ческий интерес. Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют данные о развитии латентных повреждений в процессе хранения от применяемых режимов охлаждения. Мы полагали, что решение этих вопросов позволит выяснить некоторые особенности структурных нарушений мембраны эритроцитов, приводящих к изменению ее проницаемости для ионов и биомолекул в процессе хранения в зависимости от применяемых режимов замораживания. Для выяснения механизмов криоповрежде-ний плазматических мембран происходящих при действии низких температур, целесообразно исследование мембран интактных клеток и реконструированных мембранных систем, в частности реставрированных теней эритроцитов, сохраняющих важнейшие структурно-функциональные параметры мембран: барьерную функцию, активный и пассивный перенос ионов, качественный и количественный состав мембранных белков и липидов, что позволяет использовать их в качестве адекватной модели при изучении действия замораживания на плазматические мембраны клеток (Лишко В.К., 1977; іулевский А.К., 1986 ). Использование реставрированных теней эритроцитов в качестве модели исследования позволяет дифференцировать нарушения барьерной функции, происходящие в связи с внутриклеточными изменениями от нарушений этих функций в результате непосредственного действия физико-химических факторов на мембрану. Это и послужило предпосылкой для проведения данного экспериментального исследования.
Цель и задачи работы. Целью работы явилось изучение особенностей структурно-функциональных перестроек мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов при замораживании и хранении в диапазоне температур -30 + -70С и определение оптимальных условий хранения клеток в этом температурном интервале.
Б связи с этим в конкретные задачи исследования входило:
выявить характер изменения проницаемости плазматических мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов для гемоглобина, 14С-сахарозы и ионов К+, подвергнутых замораживанию до температур -30 * -70С в растворах глицерина с последующим хранением в этих температурных условиях в течении 3-х месяцев.
изучить состояние пассивного и активного транспорта для одновалентного катиона R& в эритроцитах и реставрированных теаях эрит роцитов, подвергнутых замораживанию до температуры -30С в растворах глиттерина при хранении в течении 1 месяца.
исследовать структурные перестройки плазматических мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов по данным количествен ного и качественного состава липидов и белков после замораживания
до -30, -50 и -70С в растворах глицерина и последующего хранения в этих температурных условиях в течении 3-х месяцев. - разработать метод определения степени деструкции эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов подвергнутых криоконсервирова-ниго в зоне умеренно низких температур по данным проницаемости.
Шучная новизна. Впервые по данным проницаемости маркерных веществ показано, что хранение эритроцитов в зоне умеренно низких температур -30 + -70С приводит к формированию в их плазматических мембранах трансмембранных дефектов разной величины по типу "сквозной поры".
Определены условия замораживания для изучения механизмов латентных повреждений при хранении эритроцитов в зоне умеренно низких температур,-
Обнаружен факт изменения количественного и качественного состава фосфолипидов мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов под защитой глицерина в концентрациях 10 - 40 при хранении в течении 2-х месяцев при температуре -30С. Показано, что для сохранения состава фосфолипидов на уровне близком к исходному, необходимо использовать 20 - 40 растворы глицерина как в случае эритроцитов так и реставрированных теней эритроцитов.
Выяснено, что модификация мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов включает изменения структурного состояния мембранных белков, прежде всего спектрин-актинового комплекса в направлении их агрегации. Установлено, что наименьшее количество агрегированных мембранных белков образуется при скорости замораживания 10/мин до температур -30, -50 и -70С. Скорости охлаждения образцов 1-2/мин приводят к значительному нарушению связей между белковыми компонентами цитоскелета.
Установлено, что низкотемпературное консервирование при умеренно низких- температурах даже под защитой эффективных концентраций глицерина (20 - 40) приводит к выраженном}' нарушению транспортных свойств их плазматических мембран, что выражается в увеличении пассивной проницаемости для одновалентного катиона Я и.повышения уровня его активного транспорта.
Теоретическая и практическая значимость -работы. Полученные данные обосновывают механизм криоповреждения эритроцитов в зоне умеренно низких температур, как следствия появления в их мембранах трансмемо'ранных дефектов по типу "сквозных пор" .формирующихся в результате модификации липидного бислоя и белков цитоскелета, что является вкладом в развитие теории криоповреждения клеток.
Разработан и применен в экспериментальной работе высокочувствительный метод определения степени деструкции эритроцитов подвергнутых криоконсервированию в зоне умеренно низких температур, основанный на изменениях внутриклеточного содержания и проницаемости ионої который внедрен в практику работы низкотемпературного банка в отделе консервации Харьковской областной станции переливания крови МЗ Украины.
