Содержание к диссертации
Введение
1. Общие свойства эритроцитов. Деформируемость - важнейшая функциональная характеристика эритроцитов. Параметры эритроцитов, определяющие их деформируемость. Зависимость этих параметров от концентрации внутриклеточного ионизированного кальция 9
2. Основные методы количественной оценки деформируемости эритроцитов и возможность их применения для оценки популяционных характеристик эритроцитов в крови 18
2.1 Ротационная вискозиметрия 18
2.2 Эктацитометрия:БОКСЛ, осмоскан, еоскоп 20
2.3 Фильтрационные методы 23
2.4 Микропипеточный метод 30
2.5 Измерение скорости движения эритроцитов по силиконовым микроканалам 31
3. Гетерогенность популяции эритроцитов в крови. Популяционные характеристики эритроцитов в норме. Корреляционные связи между параметрами эритроцитов 31
4. Физиологическое старение эритроцитов. Изменение основных параметров и реологических свойств эритроцитов при старении in vivo. Роль внутриклеточного ионизированного кальция 37
5. Влияние некоторых факторов на стационарный уровень нутриклеточного ионизированного кальция, на активность Гардос-каналов и деформируемость эритроцитов. 44
5.1 Увеличение проницаемости мембраны эритроцита для кальция од действием сдвигового напряжения 44
5.2 Увеличение проницаемости мембраны эритроцита для кальция и нгибирование кальциевого насоса под действием окислителей. 46
5.3 Факторы, влияющие на стационарный уровень внутриклеточного ионизированного кальция и реологические свойства эритроцитов in vivo 47
6. Изменение реологических свойств и популяционных характеристик ритроцитов в крови при некоторых патологических состояниях и повреждающих воздействиях. 49
6.1. Гемолитические анемии. 50
6.1.1. Наследственный сфероцитоз и эллиптоцитоз. 50
6.1.2. Наследственная еысоко-фосфатидилхолиновая гемолитическая анемия, наследственный ксероцитоз, наследственный стоматоцитоз. 51
6.1.3. Аутоиммунная гемолитическая анемия. 52
6.1.4. Серповидноклеточная анемия. 52
6.2. Гипертензия и мозговые нарушения. 54
6.3. Травмы, инфекции, сепсис и воспаление. 55
6.4 Хроническая почечная недостаточность (ХПН). 56
6.5. Механическая травма эритроцитов. 58
6.6. Консервированныеритроциты. 59
6.7. Заключение. 61
3 Материалы и методы.
1 Приготовление суспензий эритроцитов. 65
2 Модификация эритроцитов с помощью различных воздействий.
2.1. Обработка эритроцитов глутаровым альдегидом. 66
2.2. Загрузка эритроцитов кальцием с помощью ионофора А23187. 66
2.2.1. Загрузка кальцием эритроцитов, ресуспендированных в HEPES-буфере 66
2.2.2. Загрузка кальцием эритроцитов, ресуспендированных в плазме. 66
2.3. Загрузка эритроцитов кальцием с помощью ортованадата. 66
2.4. Загрузка эритроцитов кальцием с помощью истощения
3. Измерение распределения эритроцитов по лотности. 67
4.Оценка везикуляции эритроцитов. 67
5.Фракционирование эритроцитов по плотности. 68
6. Фильтрационные измерения. 69
6.1. Фильтрометр ИДА-01 69
6.2. Кинетический фильтрометр ИДА-03. 71
6.3. Фильтры 75
7. Исследование консервированных и криоконсервированных эритроцитов 77
8. Гематологические показатели. 78
9. Статистическая обработка результатов. 78
4 Результаты
1. Разработка фильтрационно-осмотических методов (ФИОМ). 78
1.1. Зависимость скорости прохождения эритроцита через узкую пору от его геометрических и механических параметров. атематическая модель Ml 78
1.2 Фильтрометр ИДА-01. Индекс фильтруемости; его зависимость от осмотичности среды. 86
1.3 Определение зависимости процентного содержания нефильтрующихся клеток в суспензиях эритроцитов от осмотичности среды (распределение эритроцитов по исг.) с помощью фильтрометра ИДА-01. Метод последовательного отмывания фильтра 90
1.4 Определение зависимости процентного содержания нефильтрующихся клеток в суспензиях эритроцитов от осмотичности среды (распределение эритроцитов по ис„) с помощью фильтрометра ИДА-01. Метод двух гематокритов 93
1.5 Кинетический фильтрометр ИДА-03. Обработка экспериментальных данных. 96
2. Распределение эритроцитов в крови здоровых доноров по плотности и критической осмотичности (по фильтруемости) 101
2. Характер распределения по критической осмотичности в эритроцитах разного возраста. Поддержание постоянного отношения поверхность/объем в процессе старения эритроцитов. 106
3. Распределение эритроцитов по плотности и ритической осмотичности при некоторых воздействиях in itro. 114
4.1. Зависимость распределения нормальных эритроцитов по плотности и критической осмотичности отрН среды. 114
4.2. Зависимость распределения нормальных эритроцитов по плотности и критической осмотичности от температуры. 116
4.3. Изменение распределений эритроцитов по плотности при инкубации с мфотерицином В Определение зависимости процентного содержания нефильтрующихся клеток в суспензиях эритроцитов от осмотичности среды (распределение эритроцитов по исг.) с помощью фильтрометра ИДА-01.. 119
4.4. Уширение распределений эритроцитов по плотности и фильтруемости под действием факторов, повышающих уровень нутриклеточного кальция. 120
4.4.1. Изменение распределений эритроцитов по плотности и фильтруемости при загрузке их кальцием с помощью ионофора А23187. 120
4.4.2. Изменение распределений эритроцитов по плотности и фильтруемости при загрузке их кальцием с помощью ортованадата. 124
4.4.3. Изменение распределений эритроцитов по плотности и фильтруемости при загрузке их кальцием с помощью истощения клеток по АТФ. 127
5. Распределение эритроцитов по плотности и ритической осмотичности при консервировании и криоконсервировании. 129
5.1. Распределение по плотности и критической осмотичности эритроцитов, консервированных при положительных емпературах. 129
5.2. Распределение по плотности и критической осмотичности риоконсервированных эритроцитов. Прогнозирование эффективности трансфузий криоконсервированных эритроцитов 133
6. Распределение эритроцитов по плотности и критической смотичности при некоторых патологических состояниях. 137
6.1. Наследственный сфероцитоз 137
6.2. Аутоиммунная гемолитическая анемия 141
5 Заключение 149
Выводы 160
- Основные методы количественной оценки деформируемости эритроцитов и возможность их применения для оценки популяционных характеристик эритроцитов в крови
- Влияние некоторых факторов на стационарный уровень нутриклеточного ионизированного кальция, на активность Гардос-каналов и деформируемость эритроцитов.
- Модификация эритроцитов с помощью различных воздействий.
- Распределение эритроцитов в крови здоровых доноров по плотности и критической осмотичности (по фильтруемости)
Основные методы количественной оценки деформируемости эритроцитов и возможность их применения для оценки популяционных характеристик эритроцитов в крови
Как известно, кровь является неньютоновской жидкостью, т.е. экспериментально измеряемое значение вязкости крови зависит от величины приложенного сдвигового напряжения [8,15,27] На Рис 1. показаны полученные с помощью ротационного вискозиметра значения вязкости в зависимости от скорости сдвига для эритроцитов в плазме, декстране 40 кД, в котором нет агрегации, и эритроцитов, обработанных глутаровым альдегидом [95J Изменение вязкости крови при разных величинах сдвиговой деформации обусловлено агрегацией эритроцитов при низких и дезагрегацией при высоких скоростях сдвига, а также деформацией эритроцитов в потоке [15,20,22,27]. Видно, что способность эритроцитов к деформации значительно уменьшает вязкость при высоких скоростях сдвига, когда клетки вытягиваются вдоль потока, значительно уменьшая гидродинамическое сопротивление. Поэтому для оценки деформируемости эритроцитов часто используется значение вязкости крови при высоких скоростях сдвига, полученное с помощью ротационных или капиллярных вискозиметров [15,27]. Влияние на вязкость крови приложенного напряжения сдвига зависит от гематокрита. Если гематокрит меньше 12 %, вязкость не зависит от величины сдвигового напряжения. При скорости сдвига большей 200 с вязкость крови меняется слабо и при дальнейшем увеличении выходит на стационарное значение, которое определяется вязкостью плазмы и способностью эритроцитов к деформации [15]. Достоинством метода является его простота. Метод широко применяется в клинических реологических лабораториях. С помощью этого метода показано изменение вязкости крови при различных патологиях. Эктацитометрия: LORCA, осмоскан, реоскоп. Принцип эктацитометрического метода заключается в следующем: суспензию эритроцитов в вязкой среде помещают в узкий зазор между двумя коаксиальными цилиндрами, один из которых вращается с заданной скоростью (устройство, подобное ротационному вискозиметру-Couette viscometer). При этом эритроциты подвергаются действию сдвигового напряжения (shear stress), приводящего к деформации (вытягиванию) клеток. Степень деформации оценивается с помощью лазерной оптической системы, позволяющей определить величину индекса деформируемости, равной соотношению длинной и короткой полуосей эллипсоида, соответствующего деформированному (вытянутому) эритроциту [53,248,386]. Наиболее распространенный коммерческий эктацитометр LORCA (Laser-assisted optical rotational red cell analyzer) позволяет получать кривые зависимости ID от величины приложенного сдвигового напряжения (скорости сдвига и вязкости ресуспендируюшей среды), характеризующие деформируемость исследуемых эритроцитов [102,416]. Подвергаясь действию сдвигового напряжения, большая часть эритроцитов удлиняется и принимает форму вытянутого элипсоида, а часть не удлиняется и вращается в потоке.
Показано, что вытягиваются вдоль потока, главным образом, эритроциты легкой фракции, в то время как основная часть эритроцитов плотной фракции, обладающая пониженной деформируемостью, вращается в потоке Показано, что индекс деформируемости определяется соотношением внеклеточной и внутриклеточной вязкости как для легко деформируемых молодых так и для плохо деформируемых старых клеток. [344,423], Добавление в суспензию обработанных диамидом жестких клеток искажает ламинарное течение вокруг интактных клеток и нарушает их эллиптическую деформацию [237]. При низких значениях сдвигового напряжения наблюдается уменьшение индекса деформируемости клеток, обработанных ГА низкой концентрации. При высоких значениях сдвигового напряжения деформируемость этих клеток равна деформируемости интактных эритроцитов [47]. Более высокой информативностью обладает модификация эктацито метра, получившая название «Осмоскан» («Osmoscan»). Этот прибор позволяет монотонно изменять значения осмотичности среды, в которой ресуспендированы деформируемые эритроциты (осмотическая развертка), и таким образом определять зависимость ID от осмотичности [214]. Поскольку клеточная мембрана обладает высокой проницаемостью для воды и практически непроницаема для растворенных в цитоплазме веществ, при уменьшении осмотичности среды клетка почти мгновенно раздувается, а при увеличении сжимается, уравновешивая осмотическое давление по обе стороны мембраны. Изменяя осмотичность среды в интервале 100-450 мОсм, получают характерные колоколообразные кривые, позволяющие не только количественно оценить деформируемость эритроцитов, но и установить, какие именно свойства клетки изменены по сравнению с нормой [103],. На Рис 3 представлена типичная кривая зависимости ID нормальных эритроцитов от осмотичности среды и указаны основные параметры этой кривой, характеризующие исследуемые клетки. Фильтрационные методы оценки деформируемости эритроцитов применяются, начиная с 60-х гг. Принцип всех фильтрационных методов заключается в измерении соотношения перепада давления на мембранных фильтрах с диаметром пор, близким к минимальному диаметру капилляров микроциркуляции (3-5 мкм), и скорости прохождения эритроцитов через эти фильтры [14,17,18,218,242,294,341,434] Результаты экспериментов свидетельствуют о постепенном забивании пор в процессе фильтрации клетками, для которых времени эксперимента недостаточно для того, чтобы пройти через пору фильтра [181]. К ним относятся нефильтрующиеся или плохо фильтрующиеся субпопуляции эритроцитов и примесь лейкоцитов, а также агрегатов тромбоцитов [413]. На Рис5 показано прохождение эритроцита через пору мембранного фильтра [366]. В большинстве фильтрационных систем используют поликарбонатные мембранные фильтры с калиброванными порами. Такие фильтры получают травлением треков после облучения тяжелыми частицами, разогнанными в циклотроне. Диаметр пор фильтров обычно составляет 3 или 5 мкм. Величину сдвигового напряжения (shear stress), действующего на клетку при прохождении поры, вычисляют по формуле: [360] где Р - перепад давления, г - радиус поры, / - длина поры. При использовании фильтра с порами диаметром 5 мкм, длиной 13 мкм и при перепаде давления на фильтре 300 Па величина сдвигового напряжения составляет 25 Па (250 дин/см2). В капиллярах микроциркуляции того же диаметра величина сдвигового напряжения составляет по разным данным от 5 до 15 Па (50-150 дин/см2). При фильтрации через фильтр с порами диаметром 5 мкм скорость втягивания значительно больше, чем при втягивании в фильтр с диаметром пор 3 мкм.
В работах Reinhart [360] изучали влияние диаметра пор на скорость прохождения эритроцитов при изменении осмотического давления среды. Показано, что сопротивление фильтров с порами диаметром 3 мкм более чувствительно к осмотическому раздуванию, т.е. к уменьшению отношения S/V, а сопротивление фильтров с порами диаметром 5 мкм более чувствительно к осмотическому сжатию, т.е. к увеличению концентрации и вязкости внутриклеточного гемоглобина. Недостатком поликарбонатных мембранных фильтров является гетерогенность пор, различающихся по диаметру и плотности распределения на фильтре. Кроме того, точность количественных оценок, получаемых с помощью мембранных фильтров, снижается из-за значительного количества перекрывающихся пор [360]. В последние годы все более широкое применение находят никелевые (Nickel-Mesh) фильтры с идентичными неперекрывающимися порами, изготавливаемые методом электролитического травления [43,319,343,451]. Одним из ранних фильтрационных методов, получивших широкое распространение, был метод Reid и Dormandy [354], достаточно чувствительный и позволявший получать количественные оценки деформируемости эритроцитов. В 1979 была разработана математическая модель, связывающая стационарную скорость протекания через фильтр однородной суспензии при постоянном давлении над фильтром со скоростью прохождения эритроцита через пору фильтра [60]. Эта модель стала теоретической основой для разработки так называемых «методов начальной скорости», целью которых было оценить скорость протекания суспензии в начальные моменты времени, уменьшив влияние медленно проходящих через фильтр и забивающих фильтр субпопуляций эритроцитов и лейкоцитов [17]. Эти методы представлены гемореометром Хансса и филырометром Сент-Джорджа. В начале 80-х гг была создана фильтрационная система, названная по имени автора гемореометром Хансса [87,136,186,185].
Влияние некоторых факторов на стационарный уровень нутриклеточного ионизированного кальция, на активность Гардос-каналов и деформируемость эритроцитов.
Эритроциты отличаются от остальных клеток тем, что не имеют внутриклеточных органелл, содержащих запасы кальция, и соответствующих рецепторов. Однако благодаря поддержанию исключительно высокого трансмембранного градиента по кальцию (в норме концентрация Са2+ в плазме составляет 1-1.5 мМ), относительно небольшие изменения структуры клеточной мембраны, например, в результате деформации (растяжения), особенно в сочетании с окислительным стрессом, могут приводить к заметным изменениям концентрации внутриклеточного кальция, модулируя активность Гардос-каналов и, соответственно, геометрические и реологические параметры эритроцитов. Кроме того, за последние годы было показано, что подобные изменения могут происходить в результате действия некоторых циркулирующих в крови биологически активных соединений на специфические рецепторы эритроцитов. S.1 Увеличение проницаемости мембраны эритроцита для кальция под действием сдвигового напряжения. С начала 80-х гт появляются данные, свидетельствующие о том, что повышенная скорость входа кальция в эритроцит может быть результатом деформации (растяжения) клеточной мембраны. [255,457]. Нормальные эритроциты под действием сдвигового напряжения обнаруживают повышенную проницаемость как для одновалентных [195,211,212,326] так и для двухвалентных катионов [216,255]. При относительно небольших деформациях этот эффект обратим, и исходная проницаемость восстанавливается после снятия деформации. Показано, что при деформации в отсутствие внеклеточного кальция изменение проницаемости одинаково для ионов калия и натрия, но добавление в среду кальция в концентрации от 0.1 до 1 мМ приводит к преобладающему выходу из клетки калия и соответствующему сжатию эритроцита [216,212]. Зависимость проницаемости от деформации существенно нелинейна. Сдвиговое напряжение создавали в эктацитометре и варьировали от 0 до 1300 дин/см2 Гемолиз начинался при 1500 дин/см2. Удлинение клетки (ID) вначале быстро нарастало до 0.7 при 300 дин/см , а затем увеличивалось медленно При увеличении ID от 0.77 до 0.78 (около 1200 дин/см2) скорости потоков катионов возрастали в 5 раз. Индуцированное тетракаином и хлорпромазином изменение формы не влияло на скорости катионных потоков.. Зависимость потоков от Ю имеет очень крутой подъем между 0.7 и 0.8. Напомним, что максимальное сдвиговое напряжение в физиологических условиях не превышает 400 дин/см2. Очевидно, что увеличение проницаемости мембраны для катионов под действием сдвигового напряжения определяется растяжением клеточной мембраны (membrane tension) [423,442].
Повышение концентрации внутриклеточного кальция под действием механического стресса сопровождается снижением деформируемости эритроцитов [216,332,380] вследствие увеличения вязкости гемоглобина (Гардос-эффект) и/или в результате ужесточения клеточной мембраны [162,161]. Блокаторы входа кальция (nifedipine и felodipine) ингибировали снижение фильтруемости под действием кратковременного механического стресса (около 6600 дин/см2). Снижение деформируемости в этих опытах зависело от уровня ц-АМФ, от активности протеинкиназы С (РКС) в эритроцитах, а также от присутствия в среде вазоконстриктора и активатора активности протеинкиназы С эндотелина-1 (ЕТ-1).[332,380]. В ряде работ было показано, что скорость входа кальция в клетки повышается под действием кратковременного интенсивного размешивания (sweerling) суспензии эритроцитов [396,430]. Втягивание в микропипетку диаметром меньше 1.5 мкм эритроцита, находящегося в среде, содержащей кальций, приводит к уменьшению его объема и позволяет клетке полностью войти в канал микропипетки [228]. Если бы объем эритроцита не уменьшился под действием приложенного сдвигового напряжения, это было бы невозможно, так как MCD (Minimal capillar diameter) нормального эритроцита человека составляет 2.9 мкм [473]. В работе Sutton et al.[424] исследовали эритроциты путем одновременного измерения их объема и скорости прохождения по силиконовым микроканалам диаметром 3,0 3.4 и 4.0 мкм и длиной около 100 мкм под действием давления 9 мм НгО. Приведенные данные свидетельствуют о том, что клетки из одного и того же образца крови при прохождении микроканалов с диаметром 3 мкм имеют меньшие значения объема по сравнению с клетками, проходящими через микроканалы большего диаметра. Зависимость проницаемости эритроцитарной мембраны от растяжения существенно возрастает при окислении и снижается под действием антиоксидантов [26,27,418,241,345,448]. Значительные изменения скорости входа кальция в эритроцит могут быть достигнуты даже при физиологических значениях сдвиговых напряжений, если клетка подвергнута действию окислителей, влияющих на ион-транспортные системы [194,241,433]. Эритроциты, подвергнутые действию окислителей, по многим параметрам напоминают постаревшие клетки [33] В работах Aiken [33,34] показано, что обработка молодых эритроцитов перекисью водорода (815 мкМ) повышает уровень внутриклеточного ионизированного кальция примерно втрое по сравнению с исходным уровнем. (173 и 61 нМ, соответственно). Авторы считают, что эффект связан с образованием метгемоглобина и его взаимодействием с клеточной мембраной. При увеличении концентрации Н2О2 от 1 мМ до 4 мМ, когда начинается гемолиз, наблюдаются возрастающие изменения энергетического метаболизма и перекисного окисления мембранных липидов (образование МДА) Отмечено снижение уровня АТФ и падение общего количества адениновых нуклеотидов, причем уровень ИМФ возрастает в 20 раз при концентрации Н2О2 4 мМ. Метаболический разбаланс эритроцитов при окислительном стрессе вызван увеличением активности АМР-дезаминазы в 2-10 раз по сравнению с контролем. [433]. Изменение микрореологических свойств мембраны эритроцитов наблюдали Hebbel, Leung и Mohandas при обработке клеток феиазинметасульфатом (PMS) , индуцирующим внутриклеточное образование перекисей. С помощью микропипеточного метода показано, что под действием 25-50 мкМ PMS мембрана эритроцита становится такой же жесткой, как мембрана плотных дегидратированных серповидноклеточных эритроцитов.
Кроме того мембрана приобретает пластические свойства, что может быть результатом ее окисления или появлением связаного с мембраной гемоглобина [194,195,196] При гемолитических анемиях, связанных с дефицитм некоторых ферментов, а также под действием различных окислителей (фенилгидразина, Н2О2, трет-бутил-гидропероксида, NEM, диамида) существенно измененялись проницаемость мембран для катионов, деформируемость и другие свойства эритроцитов[54,55,82,290]. Однако даже при значительных повреждениях клеток не наблюдалось нарушения асимметричного распределения фосфолипидов [125,194,213,214]. Кроме того, было показано, что инкубация нормальных эритроцитов человека с трет-бутил-гидропероксидом приводит к ингибированию кальциевого насоса [367], вероятно в результате перекисного окисления липидов мембраны. Снижение активности кальциевого насоса может происходить также в результате его инактивации мю-калпаином, для чего достаточно 500 нм внутриклеточного ионизированного кальция (СаО [301]. 5.3. Факторы, влияющие на стационарный уровень внутриклеточного ионизированного кальция и реологические свойства эритроцитов in vivo. В процессе циркуляции эритроциты непрерывно взаимодействуют как между собой, так и с другими клетками, находящимися в сосудистом русле: в первую очередь, с нейтрофилами, тромбоцитами и клетками сосудистого эндотелия [287] Известно, что при инкубации эритроцитов с активированными нейтрофилами и тромбоцитами или с супернатантами, полученными при осаждении активированных клеток, возрастает выход калия и снижается деформируемость эритроцитов [70,110,336,342]. Авторы полагают, что эти эффекты опосредованы действием цитокинов. Действительно, было показано, что вазоактивные медиаторы (RANTES, PAF, PGE2 и интерлейкины) активируют Гардос-каналы мышиных и человеческих эритроцитов, действуя на специфические рецепторы (364,365). Принимая во внимание, что перечисленные соединения индуцируют увеличение Caj в лейкоцитах, исследовали их влияние на чувствительный к харибдотоксину вход аналога калия Rb в эритроциты мышей линии CD-I, Было показано, что RANTES и IL-10 увеличивают Vmax Гардос-каналов в 1.5-2 раза. Клетки, преинкубированные с 500 нМ эндотелина (ЕТ-1) увеличивали Vmax на 88±9%.
Модификация эритроцитов с помощью различных воздействий.
суспензии (Hct = 20%) отмытых эритроцитов в HEPES-буфере с различными концентрациями экзогенного кальция добавляли кальциевый ионофор А23187 из исходного раствора в DMSO (концентрация 4 мМ) в отношении 1: 1000 (конечная концентрация ионофора 4 мкМ). Клетки инкубировали с ионофором от 15 мин до 1 часа при 37 град. С, после чего загрузку останавливали, смешивая суспензию с равным объемом HEPES-буфера без добавленного кальция, содержащего 6 мМ EGTA. Клетки осаждали и отмывали трижды HEPES-буфером без ионофора и без добавленного кальция. 2.2.2. Загрузка кальцием эритроцитов, ресуспендированных в плазме. Кальциевый ионофор А23187 добавляли к суспензии отмытых эритроцитов в аутологичной гепаринизированной плазме из исходного раствора в DMSO (концентрация 10 мМ) в отношении 1: 1000 (конечная концентрация ионофора 10 мкМ). Клетки инкубировали в течение 30 минут при 37 град. С, после чего загрузку останавливали, добавляя равный объем HEPES-буфера без добавленного кальция, содержащего 6 мМ EGTA. Дальнейшая процедура была такой же, как в разделе 2.2.1. 2.3. Загрузка эритроцитов кальцием с помощью ортованадата. Трис-буфер подкисляли, добавляя НО, до рН=7Л, после чего добавляли исходный водный раствор ортованадата натрия Na3VC 4 (400 мМ) до конечной концентрации 1 мМ. При этом трис-буфер, содержащий ортованадат (ТБ-V), защелачивался до рН-7.4. В тех случаях, когда использовались меньшие концентрации ортованадата, подбирали рН исходного Трис-буфера так, чтобы после добавления раствора Na VCU TBV имел рН=7,4. Все растворы, содержащие ортованадат, готовили в день измерения. Суспензию отмытых эритроцитов, ресуспендированных в Трис-буфере, разбавляли ТБ-V до Hct = 10-15% и инкубировали при комнатной температуре15 минут, после чего добавляли альбумин (конечная концентрация 0.2%) и СаСЬ из исходного раствора 100 мМ. Инкубацию эритроцитов осуществляли в течение 1 часа при комнатной температуре и останавливали, добавляя равный объем Трис-буфера (рН = 7.4), содержащего 6 мМ EGTA. Проинкубированные клетки осаждали и отмывали два раза Трис-буфером (рН = 7.4). 2.4. Загрузка эритроцитов кальцием с помощью истощения клеток по АТФ Истощение эритроцитов по АТФ осуществляли, инкубируя при медленном перемешивании в течение 20 или 40 часов при 37 град. С суспензию отмытых клеток с гематокритом 10-15% в HEPES-буфере (20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 5мМ К.С1, 1 мМ СаСЬ, рН 7.4, содержащем 0.1 мг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пеницнллина)[361]. В этих условиях закисление среды не превышало 0.1 ед. рН. После окончания инкубации эритроциты осаждали. В надосадочной жидкости определяли содержание гемоглобина и ацетилхолинэстеразную активность. Осажденные клетки дважды отмывали HEPES -буфером. 3. Измерение распределения эритроцитов по плотности. Распределение эритроцитов по плотности измеряли с помощью фталатного метода Danon & Marikovsky [120]. Готовили смеси диметил- и дибутил-фталата, имеющие значения удельной плотности в интервале от 1.066 до 1.144 г/мл. В микрогематокритные капилляры набирали по капле (5-7 мм) каждой смеси, после чего заполняли эти капилляры исследуемой суспензией эритроцитов, запаивали и центрифугировали в микрогематокритной центрифуге при 12000 g в течение 6 минут.
Измеряя отношение длины верхней части столбика эритроцитов, разделенного фталатной смесью, к общей длине столбика (%), получали распределения эритроцитов по плотности. 4. Оценка везикуляции эритроцитов. Везикуляцию оценивали по ацетилхолинэстеразной активности методом ЕПтагш а [142]. АКТИВНОСТЬ измеряли в профильтрованной через фильтр Nuclepore с диметром пор 0.45мкм надосадочной жидкости после осаждения эритроцитов (Нсг=15-20%), преинкубированных с ионофором А23187 или ортованадатом при различных концентрациях кальция или после истощения клеток по АТФ. Ацетилхолинэстеразную активность в надосадочной жидкости выражали в % от активности исходной суспензии 5. Фракционирование эритроцитов по плотности. Для фракционирования эритроцитов по плотности использовали метод Linderkamp and Meiselman [264] в нашей модификации. Отмытые эритроциты ресуспендировали в аутологичной плазме при Hct -80 %. Суспензию помещали в пластиковые пробирки длинной 47 мм и диаметром 4 мм и центрифугировали при 5400 g в течение 40 мин. После этого отбирали 40 мкл самых верхних клеток (top cells). Затем дно пробирки срезали и отбирали 40 мкл клеток у самого дна пробирки (bottom cells). Полученные таким способом самые легкие и самые тяжелые клетки ресуспендировали в НЕРЕЭ-буфере-2 с добавлением 10% плазмы. Каждая фракция содержала около 8 % от общего количества клеток. Другой метод фракционирования основан на использовании одноступенчатого градиента плотности перкола (one-step percoll-hypaque density gradient) [285]. Исходный раствор Percoll-hypaque (РПГ) готовили следующим образом: к 9 мл перколла добавляли 2 мл раствора натрий-диатризоата (1 г Na- диатризоата в 2 мл воды), 6 мг пенициллина (1585 ед/мг) и 13 мг стрептомицина, рН - 7.4, Затем этот раствор Percoll-hypaque разбавляли HEPES-буфером-І, получая РПГ с разными значениями плотности. Для получения легкой фракции эритроцитов из отмытых клеток удаляли примесь лейкоцитов и тромбоцитов, пропуская суспензию через колонки с а-целлюлозой или с Imugard cotton и ресуспендируя затем эритроциты в HEPES-буфере-2 при Hct= 10%. На дно тонкостенных пластиковых пробирок длиной 93 мм и внутренним диаметром 5 мм помещали по 200 мкл РПГ со значениями плотности от 1.075 до 1.095 г/мл. Затем в каждую пробирку сверху аккуратно наслаивали по 1.6 мл 10% суспензии эритроцитов и центрифугировали при 1800 g в течение 7 минут. Для выделения плотной фракции эритроцитов на дно тонкостенных пластиковых пробирок помещали по 200 мкл РПГ со значениями плотности от 1.100 до 1.113 г/мл. Сверху добавляли по 1 мл отмытых эритроцитов, ресуспендированных в аутологичной плазме при Hct =80 % и центрифугировали образцы при 1800g в течение 12 минут. После окончания центрифугирования самые легкие и самые плотные эритроциты, отделенные от остальной массы клеток прозрачной полоской РПГ, собирали с помощью 1 мл шприца, прокалывая сбоку стенку пробирки. Все разделенные по плотности фракции содержали не более 0.1 лейкоцита и 5 тромбоцитов на 1000 эритроцитов. 6. Фильтрационные измерения. Для проведения фильтрационных измерений в Лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН были разработаны фильтрометры двух типов. 6.1. Фильтрометр ИДА-01; Одним из наиболее простых и удобных способов оценки фильтруемое эритроцитов является измерение скорости протекания небольшого фиксированного объема разбавленных суспензий через мембранные фильтры с цилиндрическими порами, диаметр которых близок к диаметру капилляров в микроциркуляции (3-5 мкм). Фильтруемость суспензии обычно определяют по отношению tb/ts, где tb и ts представляют собой время протекания через фильтр ресуспендирующей среды (буфера) и исследуемой суспензии, соответственно.
Для оценки фильтруем ости эритроцитов в Лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН был разработан и сконструирован фильтрометр ИДА-01 (Патент РФ № 2052194), являющийся модификацией гемореометра Хансса [185] и отличающийся способом регистрации времени протекания через фильтр фиксированного объема жидкости. Последовательно соединенные части прибора: колонку, измерительную трубку и бак заполняют физиологическим раствором. В горизонтальной трубке находится пузырек воздуха который ее полностью перекрывает. На колонку сверху устанавливается фильтр, который фиксируется с помощью ячейки. Ячейку заполняют суспензией и, открывая кран 7, запускают фильтрацию. Перепад давления на фильтре в процессе фильтрации обеспечивается благодаря разности уровней жидкости в ячейке и в баке и составляет 1.50 ± 0.05 см НгО. Этот перепад не изменяется за время измерения, поскольку уровень жидкости в ячейке и в баке остается практически постоянным. Изменение объема протекшей через фильтр жидкости в зависимости от времени осуществляют методом оптического сканирования положения пузырька в трубке при помощи ПЗС-матрицы с частотой опроса 900 Гц и пространственным разрешением 10 точек/мм. Информация поступает в компьютер, где программно определяется зависимость скорости движения пузырька от времени. Перед фильтрацией суспензии определяют скорость протекания буфера через фильтр. Затем регистрируют зависимость скорости фильтрации суспензии эритроцитов от времени, которую затем нормируют на скорость буфера (скорость суспензии / скорость буфера). После фильтрации одновременным поворотом кранов и 2 пузырек возвращают в исходное положение. Ячейку снимают, удаляют фильтр, заменяют раствор в колонке. После установки фильтра система приводится в исходное состояние.
Распределение эритроцитов в крови здоровых доноров по плотности и критической осмотичности (по фильтруемости)
Эритроциты в крови здоровых доноров имеют близкие к Гауссовым распределения по плотности. Как правило, эти распределения достаточно узки (CV = 0.35-0.45%) и мало различаются от донора к донору. На Рис 27 приведены полученные фталатным методом Данона-Мариковского распределения по плотности эритроцитов 9 здоровых доноров Плотность эритроцита однозначно связана с концентрацией внутриклеточного гемоглобина: НС = 3.78х(8 - 1) [259], поэтому распределение эритроцитов по плотности отражает неоднородность популяции по НС. Характер распределения эритроцитов по плотности дает полезную информацию о свойствах популяции этих клеток в крови и с успехом используется в диагностических и исследовательских целях. Сочетание фильтрационно-осмотических методов (ФИОМ) с исследованием распределения эритроцитов по плотности (РЭПП) позволяет получить достаточно полную оценку популяционных характеристик эритроцитов . Ниже приводятся результаты исследований эритроцитов в крови здоровых доноров с помощью описанных методов. В Таблице 4 приведены усредненные результаты измерения с помощью фильтрометра ИДА-01 зависимости процентного содержания нефильтрующихся клеток Z% и индекса фильтруемости (F) от осмотичности среды для суспензий отмытых эритроцитов десяти здоровых доноров. Величину Z% определяли методом последовательного отмывания фильтра Как видно из таблицы, величина Z в интервале от гипертонических до изотонических значений осмотичности составляет 0.1-.0.3% и резко возрастает в гипотонической области, достигая максимума (100%) вблизи 180 мОсм. При этом величина индекса фильтруемости постепенно снижается от 2.4 до 0. При изменении осмотичности от изотонических до гипертонических значений также наблюдается снижение величины F. Фоновое значение Z, наблюдаемое в изотонической и гипертонической областях значений и, вероятно, обусловлено присутствием остаточных лейкоцитов, агрегатов тромбоцитов и сильно модифицированных эритроцитов. Приведенная в таблице зависимость процентного содержания нефильтрующихся клеток 2% от осмотичности среды и представляет собой по определению интегральное распределение нормальных донорских эритроцитов по ис,. На Рис 28 представлено полученное тем же методом типичное дифференциальное распределение эритроцитов нормального донора по иег: у (uv и UVH) = [Z{uv) - Z(Uv+i)]/( Uvti - Uv}, аппроксимированное Гауссианом, Максимум приведенного распределения соответствует значению осмотичности и = 197 мОсм. Ширина распределения по исг эритроцитов в крови нормальных доноров сравнима с шириной распределения по литической тоничности, получаемого при изучении осмотической резистентности [259]. Аналогичные результаты были получены методом двух гематокритов. На Рис 29 представлены усредненные фильтрационно-осмотические кривые, полученные с помощью фильтрометра ИДА-01 для суспензий эритроцитов 11 здоровых доноров. Из крови каждого донора готовили суспензии отмытых эритроцитов: с гематокритами 0.1 % и 1 %. Экстраполируя измеренные при разных и значения tj/ts к нулю , находили Q(0.1%) и П(1%) - значения осмотичности среды, при которых суспензии с данным гематокритом не проходят через фильтр.
Полученные значения Ї2 использовали для расчета параметров распределения донорских эритроцитов по критическим значениям осмотичности иСг центра распределения М и стандартного отклонения а. На Рис 30 представлены полученные с помощью кинетического фильтрометра ИДА-03 кривые зависимости от осмотичности и относительной скорости wjwb прохождения через поры Nickel-Mesh фильтра эритроцитов основной субпопуляции из крови 4 здоровых доноров. Измерения производили при 25 С и перепаде давления 150 Па. Величину Wc/w/, определяли при разных значениях осмотичности для того чтобы оценить параметры клеток, определяющие фильтруемость донорских эритроцитов в наших экспериментальных условиях,. Непрерывными линиями показаны аппроксимирующие их теоретические кривые. В Таблице 6 приведены соответствующие параметры эритроцитов, рассчитанные в соответствии с выражением (41). Отметим, что абсолютные значения критической осмотичности, измеренные с помощью кинетического фильтрометра, выше, чем чем те же параметры, измеренные на ИДА-01. Это связано с использованием фильтров с разными значениями диаметра пор. Таким образом, с помощью фильтрометра ИДА-01 используя описанные выше варианты фильтрационно-осмотического метода (ФИОМ), были впервые получены характеристики распределений эритроцитов из крови нормальных доноров по реологически значимым параметрам - критическим значениям осмотичности. Использование кинетического фильтрометра ИДА-03, позволило получить наряду с этими характеристиками, значения некоторых параметров, характеризующих свойства основной субпопуляции эритроцитов донорской крови (Таблица 6). 3. Характер распределения по критической осмотичности в эритроцитах разного возраста. Поддержание постоянного отношения поверхность/объем в процессе старения эритроцитов [267]. Как известно, содержащиеся в крови здоровых доноров эритроциты имеют близкие к нормальным распределения по объему (V), площади поверхности (S) и плотности (6), причем более старые клетки обладают меньшим объемом, меньшей площадью поверхности и большей плотностью, чем молодые. Это позволяет с помощью фракционирования по плотности выделять субпопуляции клеток, различающиеся по возрасту и геометрическим параметрам. Вывод Canham о наличии корреляции между объемом и площадью поверхности эритроцитов в крови был многократно подтвержден прямыми измерениями этих параметров для индивидуальных эритроцитов. Однако, как отмечалось в Обзоре, имеются разногласия по поводу характера указанной корреляции. Согласно данным одних авторов, объем эритроцита и площадь его поверхности связаны линейной зависимостью: г =S/V =const[,68,80,264]. В то же время другие авторы считают, что константой, связывающей S и Г является не отношение г, а так называемая сферичность, величина, обратная отношению площади поверхности эритроцита к площади поверхности сферы равного объема: SPH= S /S- 4.84xJ/2/3/S [473,471] Чем меньше сферичность, тем больше "избыточная" поверхность клетки. Поэтому сохранение в популяции постоянной сферичности эритроцитов означало бы, что в процессе старения этот избыток не изменяется..
Напротив, постоянство отношения S/V для каждого эритроцита в популяции означает, что старые клетки, имеющие меньший объем, обладают меньшим избытком поверхности, чем более крупные (молодые). Поскольку отношение площади поверхности к объему является одним из основных факторов, определяющих деформируемость (фильтруемость) эритроцита [68,264], для решения вопроса о характере соотношения этих параметров в различных фракциях эритроцитов мы использовали фильтрационно-осмотический метод. С помощью этого метода исследовали распределение клеток по асг в эритроцитах, фракционированных по плотности. Полученные экспериментальные данные сравнивали с результатами численного анализа в предположении (1) постоянства отношения S/V или (2) постоянства сферичности SPH для эритроцитов, отличающихся по плотности (и объему) (Рис 31). Относительную скорость фильтрации суспензий эритроцитов измеряли с помощью фильтрометра ИДА-01 и кинетического фильтрометра ИДА-03 при различных значениях осмотичности среды и. В первом случае оценку распределения фракционированных по плотности эритроцитов по нег, осуществляли методом двух гематокритов. В Таблице 7 представлены средние значения плотности эритроцитов легкой (Тор) и тяжелой (Bottom) фракций, выделенных из крови 18 здоровых доноров. Таблица 7 Средние значения плотности эритроцитов в легкой (Тор) и тяжелой (Bottom) фракциях эритроцитов из крови 18 здоровых доноров. Легкие эритроциты Тяжелые эртроциты Д % (Top) (Bottom) 1.095± 0.006 г/мл 1.107 ±0.005 г/мл 12.4 ± 04% Из Таблицы 7 видно, что легкая и тяжелая фракции отличаются между собой по плотности в среднем на 10%. Средние значения плотности этих фракций соответствуют внутриклеточным концентрациям гемоглобина 37 и 41 г/дд [259]. Типичный пример распределения по плотности фракций, выделенных с помощью модифицированного метода Linderkamp а (сплошные линии) и метода центрифугирования в одноступенчатом градиенте перкола (one-step percoll-hypaque density gradient) (пунктирные линии) представлен на Рис 32.
