Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Деление клетки 12
1.2 Структура микротрубочки и экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочкой 14
1.3 Динамика микротрубочек и хромосом 17
1.4 Кинетохор: структура и взаимодействие с микротрубочкой 23
1.4.1 Структура и функционирование кинетохора 23
1.4.2 Сила, развиваемая микротрубочкой при взаимодействии с кинетохором27
1.4.3 Роль молекулярных моторов во взаимодействии между микротрубочкой и кинетохором 34
1.4.4 Daml-комплекс и его роль в митозе 36
1.5 Экспериментальные исследования клеточной культуры PtKi 42
1.5.1 Приготовление срезов, микроскопия и трехмерная реконструкция 42
1.5.2 Получение изображений концов микротрубочек 43
1.5.3 Качественное описание структуры концов микротрубочек 44
1.5.4 Подход к исследованию подвижности, вызванной деполимеризацией микротрубочек in vitro 45
1.6 Постановка задачи 45
ГЛАВА 2. Методы обработки данных 46
2.1 Описание программы расчета локальных кривизн 46
2.1.1 Особенности интерфейса программы расчета локальных кривизн и формат исходных данных 46
2.1.2 Изменение масштабов отображения протофиламентов и их кривизн в программе расчета локальных кривизн 51
2.1.3 Алгоритмы вычисления кривизн отдельных протофиламентов 51
2.1.4 Определение усредненных кривизн и форм протофиламентов 53
2.1.5 Автоматический расчет наклона протофиламентов вблизи стенки микротрубочки и группировка выбранных пользователем протофиламентов. 56
2.2 Сохранение результатов расчетов, произведенных с помощью программы расчета локальных кривизн 57
2.3 Математическое моделирование кинетохорных структур, взаимодействующих с микротрубочками 58
2.3.1 Описание модели 58
2.3.2 Энергетические соотношения 60
2.3.3 Выбор параметров модели 60
2.3.4 Результаты модели 61
ГЛАВА 3. Результаты 64
3.1 Детальное рассмотрение форм протофиламентов из кинетохорных микротрубочек 64
3.1.1 Разнообразие форм протофиламентов на плюс-концах различных микротрубочек 64
3.1.2 Отличие форм протофиламентов из микротрубочек in vivo и in vitro 68
3.1.3 Детальный анализ формы протофиламентов как способ изучения динамического состояния микротрубочек 69
3.2 Различия между формами протофиламентов in vivo и in vitro 72
3.2.1 Роль адгезии протофиламентов 72
3.2.2 Факторы, влияющие на форму протофиламентов из кинетохорных микротрубочек 73
3.2.3 Изменение формы протофиламентов в различных фазах митоза 74
3.3 Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных
микротрубочек 75
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 78
4.1 Новый способ взаимодействия микротрубочек с хромосомой 78
4.1.1 Связывание протофиламентов с кинетохорными фибриллами и аспекты физиологии митотического веретена 78
4.1.2 Химия взаимодействия кинетохорных фибрилл и протофиламентов 79
4.1.3 Сравнение с опубликованными сведениями о структуре взаимодействия кинетохоров с микротрубочками 80
4.2 Связь форм протофиламентов средней кривизны с взаимодействием кинетохорными фибриллами 83
4.3 Способность изогнутых протофиламентов поддерживать процессивное движение хромосомы 84
4.4 Роль фибриллярного кинетохорного комплекса Ndc80 84
Глава 5. Выводы 87
Список литературы 88
Список сокращений и обозначений
- Структура микротрубочки и экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочкой
- Изменение масштабов отображения протофиламентов и их кривизн в программе расчета локальных кривизн
- Разнообразие форм протофиламентов на плюс-концах различных микротрубочек
- Связывание протофиламентов с кинетохорными фибриллами и аспекты физиологии митотического веретена
Введение к работе
Одним из наиболее общих законов в биологическом мире является принцип обязательной репродукции биологических систем. В этом заключается условие существования этих систем на протяжении длительных периодов времени.
Репродукция биологических систем может быть сведена к репродукции клеток. Субклеточные организмы, например вирусы, не могут поддерживать свое существование в течение неопределенно долгого времени без параллельной репродукции тех клеток, внутри которых они обитают.
Клетки многоклеточного организма чрезвычайно разнообразны по выполняемым функциям. В соответствии со специализацией клетки имеют разную продолжительность жизни. Например, нервные и мышечные клетки после завершения эмбрионального периода развития перестают делиться и функционируют на протяжении всей жизни организма. Клетки же других тканей — костного мозга, эпидермиса, эпителия тонкого кишечника — в процессе выполнения своей функции быстро погибают и замещаются новыми в результате непрерывного клеточного размножения.
Таким образом, жизненный цикл клеток обновляющихся тканей включает функционально активную деятельность и период деления. Деление клеток лежит в основе развития и роста организмов, их размножения, а также обеспечивает самообновление тканей на протяжении жизни организма и восстановление их целостности после повреждения. Процессы, сопровождающие и лежащие в основы клеточного деления, исследуются уже более ста лет.
Митоз - часть клеточного цикла, в ходе которой происходит деление биологической клетки и осуществляется корректное распределение генетической информации по дочерним клеткам. В ходе митоза в нуклеоплазме работает молекулярная машина, называемая митотическим веретеном. Задача митотического веретена - распределение сестринских хроматид по дочерним ядрам будущих клеток. Митотическое веретено включает в себя полюса деления, микротрубочки (МТ), молекулярные моторы, регуляторные белки и кинетохоры хромосом. МТ состоят из полимеризованного белка тубулина, имеющего конформацию трубки длиной в несколько микрон и диаметром около 25
нанометров. Кинетохоры — массивные белковые комплексы, локализующиеся на хромосомах, включающие в себя десятки различных белков и способные взаимодействовать с МТ.
В составе митоза были выделены пять фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Удвоение хромосом и центриолей (в клетках животных) происходит еще в ходе интерфазы (фазы роста в клеточном цикле). В результате этого в митоз хромосомы вступают уже удвоенными, напоминающими букву X (идентичные копии материнской хромосомы соединены друг с другом в области кинетохора). В профазе происходит конденсация хромосом и начинается формирование митотического веретена. В клетках животных начинается расхождение пары полюсов. Прометафаза начинается с разрушения ядерной оболочки. Хромосомы начинают двигаться, и их кинетохоры вступают в контакт с МТ митотического веретена, а полюса продолжают расхождение друг от друга. К концу прометафазы формирование митотического веретена завершается. В метафазе движение хромосом почти полностью останавливается, и кинетохоры хромосом располагаются на «экваторе» (на равном расстоянии от полюсов деления) в одной плоскости, образуя метафазную пластинку. Хромосомы остаются в таком положении в течение довольно длительного времени. В это время в клетке происходят существенные перестройки, которые обеспечивают последующее расхождение хромосом. В анафазе хромосомы делятся (соединение в районе кинетохора разрушается) и расходятся к полюсам деления. Параллельно полюса веретена также расходятся друг от друга. В телофазе происходит разрушение митотического веретена и образование ядерной оболочки вокруг двух групп хромосом, которые деконденсируются, после чего образуются дочерние ядра.
Исследование функционирования митотического веретена — одна из важных задач современной науки. Данная работа посвящена детальному исследованию одного из ключевых взаимодействий в митотической системе — взаимодействию кинетохоров хромосом с МТ.
Механизм взаимодействия между кинетохором и прикрепленными к нему МТ способен генерировать силы, вызывающие движение хромосом (Rieder and Salmon, 1998). Устройство данного механизма таково, что оно также позволяет
осуществлять полимеризацию деполимеризацию МТ в процессе движения хромосом. Более того, кинетохоры способны детектировать неправильное прикрепление сестринских хромосом к МТ веретена и задерживать начало анафазы, так что строение всего этого механизма играет ключевую роль в организации нормального протекания митоза (Rieder and Salmon, 1998). Идентификация белков, входящих в данный комплекс, сейчас успешно осуществляется в исследованиях на почкующихся дрожжах (Westermann et al., 2007) и высших эукариотах (Cheeseman and Desai, 2008; Liu et al., 2006).
Деполимеризация МТ может генерировать силы за счет гидролиза ГТФ, происходящего в димерах тубулина в МТ. ГТФ, связанная с тубулином, быстро гидролизуется после закрепления димера в стенке МТ (полимеризации), так что подавляющее большинство молекул тубулина в составе стенки МТ несет в себе ГДФ. Однако тубулин с уже гидролизованной ГТФ не имеет возможности встраиваться в стенку полимеризующейся МТ, возможно, потому что его равновесная форма не вписывается в структуру МТ (Wang and Nogales, 2005). Таким образом, ГДФ-тубулин в составе стенки МТ оказывается в напряженном состоянии и удерживается в ней связями с соседними тубулинами. Это напряжение высвобождается, когда в процессе деполимеризации конца МТ нити тубулиновых димеров, называемые протофиламентами (ПФ), принимают равновесную конформацию, закручиваясь в колечки (Mandelkow et al., 1991). Предположительно, такая форма ПФ соответствует энергетическому минимуму конфигурации ГДФ-тубулина, в то время как ГТФ-тубулиновые ПФ являются сравнительно прямыми (Chretien et al., 1995; Muller-Reichert et al., 1998). Таким образом, морфология конца МТ отражает динамическое состояние МТ.
Изгиб ПФ в процессе укорачивания МТ может стать источником силы, производящей механическую работу (Koshland et al., 1988). В самом деле, в ряде экспериментов было продемонстрировано процессивное движение микроскопических шариков, связанных с деполимеризующимися МТ (Lombillo et al., 1995). Даже статические связи между шариками и МТ (например, биотин-стрептавединовая связь) позволяют наблюдать силовой импульс при разборке МТ (Grishchuk et al., 2005). Если бы кинетохоры были прикреплены к МТ с помощью
некоторого механизма, то энергия, освобождаемая при деполимеризации МТ, могла быть источником силы в движении хромосомы к полюсу (Efremov et al., 2007; Hill, 1985; Molodtsov et al., 2005). Таким образом, деполимеризация МТ сама по себе является мотором, так что возникает вопрос о том, какова же должна быть структура кинетохора для того, чтобы позволять работать такой машине.
Существуют гипотезы о том, как структура элементов кинетохор-МТ взаимодействия может играть ключевую роль в митозе. Такая структура может быть представлена в форме кольца (Davis and Wordeman, 2007). Белковый комплекс Daml/DASH, формирующий кольца вокруг МТ in vitro (Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2006), необходим для правильной сегрегации хромосом у почкующихся дрожжей (Cheeseman et al., 2002). Можно также рассмотреть и другие кинетохорные белки, такие как Birl/SH15 (Sandall et al., 2006), CENP-F (Feng et al., 2006) и Ndc80/Hecl (Wigge and Kilmartin, 2001). При этом комплекс Ndc80 является как универсальным, так и неотъемлемым белком в механизме кинетохор-МТ взаимодействия у многих организмов (DeLuca et al., 2006; McAinsh et al., 2006). Один конец этого фибриллярного, собранного из 4 полипептидов комплекса связывается с МТ, а другой конец - с внутренней областью кинетохора (Cheeseman et al., 2006; DeLuca et al., 2006; Wei et al., 2007). Несмотря на то, что такие фибриллярные белки исключительно важны для кинетохор-МТ взаимодействия, механизмы такого взаимодействия пока не известны.
Электронная микроскопия хромосом позвоночных показала, что МТ, взаимодействующие с кинетохорами (КМТ), проникают глубоко во внешнюю элетронно-плотную область кинетохора (Rieder and Salmon, 1998), что интерпретировалось как визуализация принципов присоединения МТ к хромосоме.
Среди современных методов исследования микроскопических структур биологических объектов можно отметить электронную томографию (ЭТ). ЭТ -метод исследования, позволяющий получать трехмерные структуры макромолекулярных объектов (Downing et al., 2007). Метод основан на прохождении пучка электронов через образец под различными углами относительно центра исследуемого объекта. Каждое такое прохождение пучка фиксируется с помощью электронного микроскопа и дает представление о
расположении и электронной плотности объектов в пределах данной плоскости. Характерные пределы разрешения у современных систем составляют 1-10 нм, что позволяют отчетливо наблюдать макроглобулярные белковые структуры.
ЭТ хорошо сохранившихся кинетохоров в клетках PtKi показала, что внешняя электронно-плотная область кинетохора сформирована фибриллярными белками, связывающими МТ и хроматин (Dong et al., 2007). Во многих КМТ можно явно различить ПФ, распускающиеся от оси МТ и касающиеся хроматина (VandenBeldt et al., 2006). Количество КМТ с такими распущенными ПФ возрастает при переходе от метафазы к анафазе, что может быть дополнительным подтверждением доминирующей деполимеризации МТ в течение анафазы. Однако наблюдения показали, что около 70% всех метафазных КМТ находятся так же в состоянии с распущенными ПФ. В связи с этим обращает на себя внимание постоянство длины деполимеризующихся КМТ, что вызывает вопрос о факторах, влияющих на форму ПФ на концах КМТ.
Чтобы найти ответ на этот вопрос о строении механизма взаимодействия МТ и кинетохора, было проведено исследование методами ЭТ, позволившее изучить трехмерную структуру индивидуальных ПФ на плюс-концах МТ (концах МТ, на которых происходит интенсивная полимеризация и деполимеризация тубулина и осуществляется закрепление МТ к кинетохору) в митотических клетках PtKi (Grishchuk et al., 2008). Данные методы получения и обработки данных позволили впервые получить детальную информацию о кривизнах ПФ в различных типах МТ. Около половины ПФ на плюс-концах КМТ имели кривизны, существенно отличающиеся от кривизн ПФ в полимеризующихся и деполимеризующихся МТ in vitro. Проведенные исследования показывают, что такие необычные формы ПФ возникают не за счет динамики МТ, а по причине наличия фибриллярных кинетохорных структур, взаимодействующих с концами КМТ.
Цель работы: Исследование механизма взаимодействия кинетохоров и микротрубочек в клетках высших эукариот (PtKi). Задачи исследования:
Разработать программный комплекс, позволяющий изучить детальную форму и кривизну протофиламентов из различных микротрубочек.
Провести анализ форм протофиламентов из экспериментальных данных и сравнить их с теоретическими данными, полученными в ходе моделирования взаимодействия микротрубочек с кинетохорами с помощью различных механизмов.
Сформулировать представления о механизме закрепления протофиламентов на кинетохорах в клетках высших эукариот.
Научная новизна:
Для детального анализа форм и кривизн ПФ, полученных в экспериментах (Grishchuk et al., 2008), была написана специальная программа, которая позволила не только оценивать усредненные кривизны и формы больших групп ПФ, но и производить автоматическую сортировку ПФ по углам наклона, что дало очень интересный результат. Оказалось, что наборы ПФ по степени наклона и детальной кривизне существенно отличаются друг от друга для различных типов МТ, которым принадлежат данные ПФ. Программа позволили провести группировку ПФ, принадлежащих КМТ, и выявить среди них доминирующую по форме группу. Детальный анализ экспериментальных изображений данных ПФ позволил отчетливо наблюдать фибриллярную структуру, что явилось четким подтверждением новой гипотезы о механизме взаимодействия кинетохоров и МТ.
Работа была проведена в тесном сотрудничестве экспериментальной и теоретической групп, что для современных исследований является необходимым качеством. Дело в том, что объект данного исследования (ПФ и МТ) имеет размеры единиц и десятков нанометров, и наблюдение его в динамике через световой микроскоп оказывается невозможным. Исследования методами ЭТ позволяют получать относительно четкие и даже трехмерные изображения, но не позволяют наблюдать объект в динамике и далеко не всегда дают возможность получить четкое не зашумленное изображение. В связи с этим важным оказывается
постоянное использование средств ЭВМ по моделированию свойств этих микроскопических объектов, обработке экспериментальных изображений, проведения статистического анализа и оценке геометрических свойств данных объектов.
Данная работа включает в себя один из важных компонентов любого современного биофизического исследования — изучение биологических объектов физико-математическими методами.
Научно-практическое значение:
Исследование механизмов деления клеток имеет большое значение для исследования развития раковых заболеваний. Дело в том, что большинство препаратов, которые применятся в современности для остановки неконтролируемого роста клеток, стабилизирует длину всех МТ в организме. Это позволяет остановить процесс митоза в клетках, но оказывает токсическое действие на здоровые клетки организма. Если бы препараты могли действовать более избирательно, например, только на специфические компоненты митотической системы, которые наиболее интенсивно работают в раковых клетках, то токсический эффект от таких препаратов должен быть малым. Понимание процессов, протекающих во время митоза, и, в частности, механизма взаимодействия МТ и кинетохора, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения.
Положения, выносимые на защиту:
Создана специальная программа, позволяющая анализировать кривизны сотен протофиламентов из микротрубочек одновременно, автоматически оценивать их наклон, сортировать протофиламенты по типам и проводить статистический анализ.
Сравнение форм экспериментальных и теоретических протофиламентов в сочетании с детальным рассмотрением результатов экспериментов позволило предложить новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот. Основным рабочим элементом в новом механизме является не кольцо, а
множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.
Структура микротрубочки и экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочкой
МТ — это полимеры, состоящие из молекул тубулина, димеров состоящих из а- и р-мономеров (Рис. 2А). Плюс-конец, заканчивается субъединицами /?, а зафиксированный на полюсе деления минус-конец - а -субъединицами тубулина (Hirose et al., 1995; Mitchison, 1993). Каждый мономер тубулина связан с молекулой ГТФ. Во время полимеризации МТ ГТФ, связанная с /?-субъединицей, гидролизуется, фосфат уходит, а ГДФ остается связанной с мономером. Таким образом, большая часть МТ состоит из так называемого ГДФ-тубулина, или просто Д-тубулина. Во время полимеризации ГТФ тубулин, связанный с а -субъединицей, не гидролизуется.
Внутри полимера димеры тубулина организованы в линейные ПФ. Несколько ПФ, взаимодействуя латерально, образуют цилиндрическую стенку МТ диаметром 25 нм. Когда тубулин полимеризуется в МТ in vitro, число ПФ может колебаться от 10 до 18-ти (Chretien et аі., 1998; Meurer-Grob et al., 2001). In vivo и когда МТ нуклеированы на центросомах или аксонемах, число ПФ равно 13-ти. Это обеспечивается наличием в этих структурах специальной формы тубулина - у -тубулина, который инициирует нуклеацию МТ, образуя кольца, служащие как шаблон для дальнейшего удлинения МТ.
В работе (Koshland et al., 1988) было показано экспериментально, что концы МТ могут оставаться прикрепленными к кинетохорам изолированных хромосом во время деполимеризации при наличии АТФ и в его отсутствии, что было исследовано более детально в работе (Coue et al., 1991). В данной работе впервые использовались сегменты тетрахимены (инфузории рода Tetrahymena) как иммобилизованные на покровном стекле центры нуклеации МТ. После этого изолированные хромосомы добавлялись в камеру и зацеплялись за концы МТ. Далее деполимеризация МТ инициировалась вмыванием буфера, бедного ГТФ тубулином. В ходе деполимеризации МТ, хромосомы следовали за концами деполимеризующихся МТ со скоростью, близкой к скорости деполимеризации свободного конца. При этом движение происходило навстречу потоку буфера, оказывающего силу вязкого сопротивления на хромосомы. При этом оценка силы сопротивления, против которой МТ тянули хромосомы, составила порядка 10 пН.
В таких экспериментах сложность биохимического состава перемещаемых объектов делает практически невозможной идентификацию белков, ответственных за перемещение. Эти эксперименты были усовершенствованы и в работе (Lombillo et al., 1995), в которой хромосомы были заменены на покрытые белками пластиковые шарики микронного размера. Авторы показали, что в буфере без нуклеотидтрифосфатов направление движения молекул кинезина начинает определяться динамикой МТ. Шарики с прикрепленными молекулами кинезина следовали за концами деполимеризующихся МТ против тока буфера в направлении, противоположном направлению обычного движения плюс-направленного кинезина, - вместо плюс-конца МТ, к минус-концу. При этом различные виды кинезинов перемещались за концами деполимеризующихся МТ с различными скоростями, для некоторых видов кинезинов большими, чем скорость деполимеризации свободного конца. Это означает, что существует некий механизм - сопрягающее устройство - благодаря которому взаимодействие между мотором и МТ может замедлять или ускорять скорость деполимеризации тубулина. Интересное наблюдение состояло в том, что в присутствии АТФ и при некоторых дополнительных условиях, шарик с кинезинами перемещался к плюс-концу МТ, как ему и положено, до тех пор, пока не достигал того места, где МТ укорачивается. После этого шарик обращал свое направление и начинал следовать за разбирающимся концом в сторону минус-конца МТ.
Первым количественным экспериментом в этой области были эксперименты (Nicklas, 1983), в которых была измерена сила, с которой веретено из нескольких МТ тянуло хромосому во время анафазы. Для этой цели были использованы калиброванные стеклянные иглы. При увеличении силы до 100 пН скорость хромосом оставалась практически неизменной, а затем падала довольно быстро. При увеличении до 700 пН скорость хромосомы обращалась в ноль. Среднее количество МТ на кинетохор в использованном виде клеток составляет 43. К сожалению, невозможно точно рассчитать силу, с которой тянет одна МТ, т.к. не было известно точно, сколько из МТ доходило до полюса, и развивали ли они силу синхронно.
Изменение масштабов отображения протофиламентов и их кривизн в программе расчета локальных кривизн
Кривизны ПФ вычисляются с помощью МНК. Все точки, образующие рассматриваемый ПФ, разбиваются на интервалы, каждый из которых содержит некоторое количество последовательных точек в составе ПФ (это количество можно менять, редактируя поле «Num of Dots in minimz. interval»). Эти интервалы располагаются друг относительно друга с наложением. Например, все ПФ из экспериментальных и теоретических исследований разбивались на интервалы по 10 точек со смещением друг относительно друга на 1 точку (это смещение можно задать, изменяя параметр «Minimiz. Step»). То есть при таком разбиении в последовательные интервалы попадают точки с номерами 1-10, 2-11, 3-12, 4-14 и так далее. Внутри каждого интервала программа производит поиск наиболее подходящей дуги окружности, проходящей через эти точки по алгоритму метода главных осей (Рис. 23, Приложение ПЗ).
После успешной процедуры минимизации в качестве кривизны каждого интервала ПФ выбиралась величина, обратная радиусу подобранной к интервалу окружности. В качестве абсциссы вычисленной таким образом кривизны выбиралась усредненная абсцисса всех точек интервала. Программа ССР включает в себя также инструментарий, позволяющий наблюдать положение и размеры окружностей, подбираемых ко всем интервалам разбиения каждого выбранного ПФ.
Первоначально при реализации метода минимизации для набора точек интервала рассматривалась именно окружность, на минимальном удалении от которой расположены все точки интервала. То есть производилась минимизация функционала: u = tkxj -xtf+iz, -z0)2 R20]2 (і)
В ходе расчетов оказалось, что если интервалы разбиения ПФ на точки малы (около 4-5 точек в одном интервале), то при определенном расположении точек минимизатор находил окружность так, что она имела совсем небольшой радиус и располагалась в пределах самого интервала. В таких случаях полученная (2) (3) (4) (5) окружность не могла дать представлений о кривизне ПФ в области данного интервала точек. В связи с этим, алгоритм пришлось модифицировать, реализовав метод минимизации в виде поиска оптимальной дуги окружности, проходящей через выбранный интервал точек. То есть, в обновленном подходе проводился поиск наиболее оптимальных положений четырех полуокружностей (двух горизонтальных и двух вертикальных) относительно набора точек ПФ в интервале: 7=1 L ui =T,lzJ-[zo +№-(XJ -xnl 2=Fy+F0+J 2-(jr,- 0): 7=1 L 7=1 I. 3=ZK -Fo +Ж -VJ -zo)2l XJ + Xo+ J o -(Zj-Z0) 7=1
После минимизации четырех функционалов U, окружность выбиралась с параметрами, соответствующими минимальной величине /,. Такой подход оказался наиболее продуктивен, так как позволял найти оптимальную окружность для любого расположения точек рассматриваемого интервала ПФ на плоскости XY.
Для усреднения форм и кривизн ПФ программа ССР собирает все полученные величины кривизн и их абсцисс (расстояний по оси X, на которых располагаются центры сегментов ПФ, для которых определяются локальные кривизны) в единый пул точек (то же самое программа делает и с набором точек, характеризующих форму ПФ). Полученные пулы точек ССР вышеописанным способом разбивает на интервалы вдоль оси X, смещенные друг относительно друга. Количество точек в каждом интервале задается параметром «Num. Of Dots in avrg.-out interval». Величину смещения можно задать через параметр «Avrg.-out s Step». Стандартные величины интервалов и смещения соответствуют 50 точкам. Эти параметры усреднения применяются одновременно в алгоритмах усреднения кривизны и формы ПФ. Для каждого интервала ССР производит расчет точки, координаты которой соответствуют средним значениям координат соответствующих точек в интервале: і м XavrgN = Т7 ZJ XjN ( ) М 7=1 і М ZavrgN - AuZ]N С7) Погрешности определения усредненных координат рассчитываются исходя из формул стандартной ошибки среднего значения: JM У . \-XjN - -avrgN) — (8) М (М-\) и / . \ZjN ZavrgN) deltaZ„ = л М=! (9) mrgN М (М-1)
В расчете средней формы ПФ есть один аспект, который требует некоторой переработки алгоритма усреднения. Большинство из анализируемых ПФ имеют протяженные вертикальные участки в тех местах, где ПФ еще слабо отклоняются от стенки МТ. В таком случае получается, что для этих участков ПФ сортировка точек при усреднении формы вдоль оси X не даст результата. Для таких участков в ходе усреднения получится массив точек с практически одинаковыми абсциссами и немонотонно расположенными ординатами, рассчитанными с большими погрешностями. Для решения этой проблемы алгоритм усреднения был доработан (Рис. 24). Вся плоскость XZ, в которой располагаются ПФ, была разделена на 2 области относительно некоторой вертикальной оси (положение этой оси задается параметром «Xcri»)
Разнообразие форм протофиламентов на плюс-концах различных микротрубочек
Для описания ПФ из МТ, находящихся в известном динамическом состоянии, был использован вышеупомянутый подход применительно к литературным данным по МТ, выращенным из чистого тубулина in vitro. Большинство ПФ из полимеризующихся МТ (П-МТ) in vitro не ветвились и не изгибались, так что концы МТ были прямыми (Mandelkow et al., 1991). Небольшое количество растущих ПФ оказалось большей длины, чем их соседи, причем эта разница в длинах была различной в зависимости от условий (Chretien et al., 1995; Muller-Reichert et al., 1998), так что разнообразие таких отклонений может довольно свободно интерпретироваться. Среднее значение кривизн этих ПФ составило 3.6+4.2 град/димер. ПФ из Д-МТ (деполимеризующиеся за счет отсоединения тубулина или перепадов температуры МТ) демонстрировали меньший разброс в показателях (Chretien et al., 1995; Mandelkow et al., 1991) и имели длину 36 + 16 нм и кривизну 22+7 град/димер (Рис. 27Б).
Предыдущие исследования формы концов КМТ in vivo показали результаты, аналогичные данным in vitro (VandenBeldt et al., 2006), но наши качественные методики показали, что в то время как длины ПФ в прометафазе и метафазе были похожи на данные по Д-МТ, средняя кривизна ПФ из КМТ и неКМТ не совпадала ни с данными по П-МТ, ни с данными по Д-МТ in vitro (Рис. 27Б). Это, конечно, могло быть результатом только того, что популяции МТ in vivo составлены совокупностью растущих и деполимеризующихся МТ, так что для сравнения с МТ in vivo были объединены данные по П-МТ и Д-МТ in vitro. Гистограммы распределений кривизн для МТ in vitro показала 2 пика, но аналогичная гистограмма, составленная для МТ in vivo (например, для неКМТ) продемонстрировала широкое распределения с одним пиком (Рис. 27В). Таким образом, формы концов МТ в клетках in vivo отличались от форм концов МТ in vitro, и изменения в величине средней кривизны в процессе митоза не могло быть вызвано лишь различиями в динамическом состоянии МТ. Поскольку уникальные свойства митотических МТ могли проявиться в их роли в сегрегации хромосом, было решено провести детальный анализ форм ПФ с целью выяснения, почему имеют место такие отличия в кривизнах ПФ in vivo и in vitro.
Были разработаны процедуры для визуализации и программное обеспечение для детального анализа формы ПФ вдоль их длин (Рис. 28, Рис. П5). Форма каждого ПФ задавалась массивом координат X и Y, причем плоскость XY располагалась в соответствии с плоскостью, в которой лежал весь ПФ, после чего все описанные таким образом ПФ отображались в единой системе отсчета на одной плоскости. На Рис. 28А изображено сравнение форм ПФ из МТ in vitro (данные Mandelkow et al., 1991) с неКМТ и КМТ из клеток PtKi в метафазе. Большинство ПФ из МТ in vivo имеют формы, которые напоминают нечто среднее между формами ПФ из Д-МТ и П-МТ. Полученные средние локальные кривизны для ПФ из МТ in vivo оказались расположенными между кривизнами ПФ из П-МТ и Д-МТ вдоль их длин, подтверждая различие в формах между ПФ из МТ in vivo и in vitro (Рис. 28В). проченные формы ПФ из концов разных типов МТ: полимеризующийся (П-МТ, зеленый) и деполимеризующийся (Д-МТ, синий) типы МТ формировались из очищенного тубулина in vitro (Mandelkow et ai, 1991). ПФ из неКМТ (красный) принадлежат плюс-концам МТ, располагающимся близко к полюсом метафазных клеток PtKi. ПФ из КМТ (черный) составляют до 25% всех ПФ, выбранных наугад. Для П-МТ был выбран масштаб в 2 раза меньше, чем для ПФ из других типов МТ. ПФ из Д-МТ показаны в обоих масштабах для большего удобства при сравнении. Б - определение локальной кривизны ПФ. Для определения локальной кривизны ПФ производится поиск окружности, наиболее точно проходящей через каждые 10 последовательно расположенных точек рассматриваемого ПФ. Таким образом, кривизна всего ПФ определяется методом скользящего среднего. На графике показана зависимость локальной кривизны ПФ от расстояние до стенки МТ, цвета соответствуют А. В качестве ошибок показаны среднеквадратичные отклонения среднего. В - оценка ориентации ПФ. В квадрате показан метод измерения ориентации ПФ на любом расстоянии от стенки МТ. На графике показаны нормализованные распределения ориентации ПФ на расстоянии от 6 до 12 нм от стенки МТ в четырех наборах данных (цвета соответствуют А). В качестве ошибок показаны среднеквадратичные отклонения среднего для всех ПФ данного типа МТ. Большинство П-ПФ являются почти прямыми, так что процент таких ПФ для П-МТ составляет около 90%. Г - ПФ были рассортированы на 4 группы, основываясь на их углах ориентации. N — число ПФ в каждом наборе данных. Д - средняя локальная кривизна как функция расстояния от стенки МТ. ПФ из Д-МТ in vitro распадаются на 2 группы, как показано на ЗА. Различия в нарастании локальной кривизны в зависимости от расстояния находятся в соответствии с моделью, согласно которой ПФ могут слипаться, как минимум, вблизи стенки МТ и демонстрировать меньшую локальную кривизну (группа 2). Е - средняя локальная кривизна как фунщия расстояния от стенки МТ для средней группы ПФ из метафазных неКМТ и прометафазных, метафазных и анафазных КМТ. Те же данные, показанные для неКМТ на Д и Е для более удобного сравнения.
Получив такое разнообразие в локальных формах ПФ, необходимо было найти величины, позволяющие найти статистически значимые различия между ПФ из разных групп МТ. В качестве ключевого параметра группировки ПФ по типам был выбран угол между перпендикуляром к оси МТ и направлением сегмента ПФ, расположенного на расстоянии 6-12 нм от оси МТ (Рис. 28В). Данный сегмент был ближайшей к оси МТ областью ПФ, которая демонстрировала заметное отличие наклона ПФ из П-МТ и Д-МТ. Такой подход к описанию ПФ показал для ПФ из Д-МТ в диаграмме распределения ПФ по углам один пик на относительно малых углах (26—34), как и ожидалось для сильно искривленных ПФ (Рис. 28В). ПФ из П-МТ были преимущественно прямыми, так что вышеописанный угол для них составил около 90.
Связывание протофиламентов с кинетохорными фибриллами и аспекты физиологии митотического веретена
А - зависимости силы от скорости для укорачивающихся ПФ, находящихся во взаимодействии с двумя типами механизмов. Для кольцевого механизма данные взяты из (Efremov et al, 2007). Б - сравнение индивидуальных МТ из группы средних по кривизне ПФ из одного метафазного кинетохора (оранжевый, аналогичный набор, что и на Рис. 29Б) с набором теоретических ПФ (серый), находящихся под средней нагрузкой в 3,1 пН на один ПФ. Модель описывает согласование форм ПФ вблизи стенки МТ вполне хорошо, но широкое распределение кривизн экспериментальных ПФ на удалении от стенки МТ показывает присутствие неких дополнительных влияющих на форму ПФ факторов, которые пока еще не выявлены. В - усредненные формы ПФ из П-МТ (45 ПФ) или Д-МТ (65 ПФ) в сравнении с усредненной формой средних по кривизне ПФ (505 ПФ). Кривые в градациях серого цвета показывают теоретические формы ПФ, находящиеся под разной нагрузкой случайно распределенных КФ. Показаны также и стандартные ошибки среднего. Показана МТ, окруженная кольцом, подобным Daml, под нагрузкой 30 пН, что соответствует максимальной силе, которую кольцо может передать МТ, так как большие силы, приложенные со стороны кольца, вызывают его отрыв от МТ (Efremov et al, 2007).
Предыдущие структурные исследования кинетохоров позвоночных выявили электронно-плотную внешнюю пластинку кинетохора, которая окружает КМТ и прикрепляется к хроматину нитями неизвестного состава (Dong et al., 2007, в обзоре Rieder and Salmon, 1998). Полученные томографические срезы быстро замороженных, заморожено-замещенных, митотических PtK) клеток продемонстрировали элементы такой пластинки (Рис. 26, Рис. П2), но ее видимость зависела от стадии митоза и толщины томографического среза. Внешние пластинки не наблюдались в исследованиях митоза в высших растениях (Jensen and Bajer, 1973), почкующихся дрожжах (O Toole et al., 1999) и нематодах (O Toole et al., 2003), так что можно утверждать, что такая пластинка вряд ли отражает универсальный механизм взаимодействия кинетохора и МТ. Возможно, белки пластинки формируют регуляторные связи между соседними КМТ, которые обеспечивают синхронность динамики КМТ в процессе движения хромосомы к полюсу.
Мы использовали форму ПФ в качестве критерия оценки типа механизма взаимодействия МТ и кинетохора. Свойства кинетохорного комплекса Daml/DASH в почкующихся дрожжах были исследованы в ряде теоретических работ (Efremov et al., 2007; Liu and Onuchic, 2006; Molodtsov et al., 2005), так что удалось проанализировать, является ли кольцевой механизм ответственным за наблюдаемые вариации формы ПФ. Оказалось, что не является (Рис. 30А), поскольку кольцо, достаточно сильно связанное с МТ для обеспечения процессивного движения вдоль МТ, взаимодействует с МТ в области, распложенной ближе к стенке МТ, чем область заметного искривления ПФ (Efremov et al., 2007). Таким образом, можно поддержать предположение о том, что фибриллярные механизмы являются принципиальными для связывания МТ с кинетохором и обеспечивают полярное движение хромосом в клетках PtKi. Возможно, кольцевой механизм имеет ценность, когда на одни кинетохор приходится лишь одна МТ, как в почкующихся дрожжах, но КФ позволяют создать гибкий и эффективный механизм, когда правильная сегрегация хромосом происходит с участием многих МТ.
Наблюдаемые формы ПФ средней кривизны могут быть связаны с взаимодействием с КФ, но не с кольцевыми структурами. Идея того, что КФ могут влиять на форму ПФ из КМТ, подсказывает, что механизм, ответственный за движение хромосом, отличается по своему строению от кольцевых структур. Чтобы определить степень соответствия данных ЭТ тому или иному механизму, была использована молекулярно-механическая модель конформации концов МТ (Molodtsov et al., 2005), дополненная эластичными элементами (КФ), соединяющими ветвящиеся ПФ и кинетохор. Полученные формы ПФ для свободно деполимеризующихся МТ были сравнены с формами ПФ, находящимися под нагрузкой случайно присоединяющихся КФ, и при повышении нагрузки форма ПФ выравнивалась (Рис. 30А). Средняя форма ПФ в модели под нагрузкой в 3-4 пН на один ПФ хорошо соответствовала форме ПФ из КМТ. Эти теоретические и экспериментальные наборы ПФ имели почти одинаковые небольшие кривизны в области, близкой к стенке МТ, и на удалении от стенки МТ кривизны становились более вариабельными (Рис. ЗОБ). Экспериментальные ПФ демонстрировали больший разброс в формах ПФ, чем теоретические, что, возможно, связано с примененными методами фиксации и получения изображений.
Интересен факт, что когда та же самая модель была использована, чтобы оценить форму ПФ МТ, взаимодействующих с кольцевыми структурами (такими как Daml комплекс), было получено малое соответствие рассчитанной формы ПФ и экспериментальных данных по ПФ из КМТ (Рис. 30А). Такие кольцевые структуры взаимодействуют со стенкой МТ в самом начале области изгиба ПФ (то есть, очень близко к стенке МТ), таким образом, напряжение, передаваемое через такую связь, оказывает малое влияние на форму ПФ, даже если напряжение равно максимально возможному для такой кольцевой структуры (пока кольцо держится на стенке МТ). Это показывает, что какие-либо кольцевые структуры не могут быть ответственны за форму наблюдаемых ПФ в КМТ и, таким образом, вряд ли участвуют в связывании ПФ из КМТ с кинетохорами в клетках PtKi.
