Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из актуальных проблем современной генетики является изучение механизмов, контролирующих процессы репликации, экспрессии и репрессии генов. В последние годы, благодаря расшифровке геномов эукариот и разработке новых экспериментальных подходов, исследования этой проблемы вышли на уровень генома. В частности, активно ведутся работы по изучению времени репликации большого количества генов, а также их транскрипционной активности на разных стадиях развития, в разных тканях и под влиянием различных факторов. Регулярно появляются новые данные по картированию с высокой точностью участков локализации специфических белков и модификаций гистонов в хромосомах клеток разных типов.
Особый интерес представляет исследование гетерохроматина, отличающегося высоким уровнем компактизации ДНК, конденсированным состоянием на протяжении всего клеточного цикла, низким уровнем транскрипционной активности, ассоциацией с ядерной мембраной, поздним временем репликации в S-фазе клеточного цикла, а .также наличием специфических негистоновых белков и особых модификаций гистонов (см. обзор Craig, 2005). Такое репрессированное состояние хроматина устанавливается на ранних этапах развития организма и в дальнейшем наследуется на протяжении многочисленных клеточных делений. (так называемое «эпигенетическое наследование»). У Drosophila melanogaster -одного из модельных объектов для генетических исследований - около 30% генома формирует гетерохроматин, который локализован в прицентромерных областях хромосом (прицентромерный гетерохроматин), в районах теломер (теломерный гетерохроматин), а также в многочисленных сайтах, рассеянных вдоль эухроматиновых плеч хромосом (интеркалярный гетерохроматин). Прицентромерный гетерохроматин содержит относительно мало генов и представлен средне- и высокоповторёнными последовательностями ДНК (см. обзор Wallace and Orr-Weaver, 2005), а районы интеркалярного гетерохроматина соответствуют кластерам уникальных неактивных генов (Belyakin et al., 2005).
Молекулярную основу эпигенетически наследуемого репрессированного состояния гетерохроматина составляет прежде всего особый набор модификаций коровых гистонов, с которыми связываются специфические негистоновые белки-репрессоры.
Отличительной особенностью гетерохроматиновых районов у дрозофилы является недорепликация (недопредставленность) ДНК в политенных хромосомах слюнных желёз. Единственным известным фактором, специфически влияющим на недорепликацию ДНК гетерохроматиновых районов, является ген Suppressor of UnderReplication (SuUR) (Belyaeva et al., 1998). Мутация данного гена приводит к полному подавлению недорепликации ДНК в интеркалярном гетерохроматине и частичному подавлению недорепликации в прицентромерном гетерохроматине, а дополнительные трансгенные копии нормального аллеля гена SuUR, напротив, вызывают усиление недорепликации ДНК (см. обзор Zhimulev and Belyaeva, 2003). Методом флуоресцентного иммуноокрашивания
политенных хромосом белок SUUR был обнаружен в районах прицентромерного, интеркалярного и теломерного гетерохроматина, а также в ядрышке. Однако, механизм его воздействия на процесс политенизации ДНК гетерохроматиновых районов пока не известен.
Цель и задачи
Целью данной работы является построение и последующее изучение профиля связывания белка SUUR с хромосомами культуры клеток эмбрионов Drosophila melanogaster, а также поиск белков, взаимодействующих с белком SUUR. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Выполнить картирование участков локализации белка SUUR на хромосомах культуры клеток эмбрионов дрозофилы посредством процедуры DamID (Dam Identification) в сочетании с технологией кДНК-микрочипов. Построить профиль связывания белка SUUR с хромосомами. Провести сравнительный анализ локализации белка SUUR в хромосомах и определить состояние транскрипционной активности его генов-мишеней с использованием ранее опубликованных данных.
-
Исследовать наличие взаимодействий между белком SUUR и основными негистоновыми белками гетерохроматина (НР1, PC и др.) с помощью метода дрожжевой двугибридной системы.
Научная новизна
В настоящей работе впервые осуществлено картирование участков локализации белка SUUR на хромосомах диплоидных клеток Drosophila melanogaster. Впервые участки локализации этого белка на хромосомах были выявлены в геномном масштабе с высокой степенью точности (порядка 2-5 т.п.н.). Установлена положительная корреляция между распределением белка SUUR и уровнем недорепликации ДІЖ в политенных хромосомах слюнных желёз. Выявлен первый непосредственный партнёр белка SUUR - белок НР1. Установлено, что для взаимодействия между этими двумя белками необходимы и достаточны средняя заряженная часть белка SUUR и С-концевая часть белка НР1, содержащая хромотеневой домен.
Научно-практическая значимость исследования
Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о компонентах хроматина, контролирующих процессы репликации и транскрипционной активности генов. Впервые обнаружено и охарактеризовано прямое физическое взаимодействие белка SUUR с другим белком гетерохроматина, а именно белком НР1. Полученные данные важны для понимания особенностей процесса репликации в районах гетерохроматина. Помимо этого, в данной работе выполнено полномасштабное картирование белков SUUR и НР1 и сравнительный анализ распределения этих и ряда других белков хроматина в хромосомах Drosophila melanogaster. В настоящее время эти данные активно используются в биоинформационных исследованиях, посвященных картированию и предсказанию функционально значимых белковых кластеров в хромосомах Drosophila melanogaster.
Материалы данной диссертационной работы используются в курсах лекций для студентов биологических факультетов ряда вузов.
Апробация работы
Основные результаты данной работы были представлены на: семинаре ВОГиС «Актуальные проблемы генетики и селекции», 30 ноября 2005 г., Новосибирск, Россия; международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию со дня рождения академика Д.Г. Кнорре, 30 июля - 3 августа 2006 г., Новосибирск, Россия; международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», 9-12 мая 2007 г., Томск, Россия; 8-ой международной конференции по гетерохроматину, 3-9 июня 2007 г., Губбио, Италия; международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине», посвященной 90-летию со дня рождения академика Д.К. Беляева, 7 -9 августа 2007 г., Новосибирск, Россия; международной конференции «ДНК репликация и поддержание генома у эукариот», 5-9 сентября 2007 г., Колд Спринг Харбор, США; 20-ой европейской конференции по исследованию дрозофилы, 12 - 14 сентября 2007 г., Вена, Австрия; II Съезде Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, 16-19 октября 2007 г., Санкт-Петербург, Россия.
Публикации
По теме диссертации опубликовано или находится в печати 5 работ.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 288 ссылок. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 24 рисунка и приложения на 29 страницах.
