Введение к работе
Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой наиболее распространенную форму первичных нейродегенеративных заболеваний пожилого возраста, которая характеризуется потерей памяти, расстройством речи и распадом психической деятельности [Davis, Samuels, 1998]. Несмотря на огромный объём накопленных за последнее время данных, этиология и патогенез заболевания остаются неясными. Лекарственные препараты, применяемые в настоящее время для лечения БА, имеют ограниченный эффект, временно улучшая симптоматику, и не задерживают процесс развития заболевания.
Нейроморфология БА хорошо известна и характеризуется накоплением в мозге больных амилоид-бета-пептида (Ав) в составе экстраклеточных амилоидных отложений, агрегированного белка тау в составе внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, дисфункцией и дегенерацией синапсов и гибелью нейронов. Однако первые проявления симптомов заболевания, связанные с потерей памяти и нарушением когнитивных функций, происходят в отсутствии каких-либо признаков амилоидоза или нейрофибриллярной патологии и сопровождаются лишь значительным уменьшением синаптической плотности [Terry, 1992, 2000]. Даже на более поздних стадиях БА потеря синапсов часто отмечается в отсутствии гибели нейронов, что указывает на первичное поражение синапсов при развитии заболевания [Masliah et al, 1994].
Доминирующей гипотезой развития БА является «гипотеза амилоидного каскада», в основе которой лежит положение о том, что повышенная секреция нейротоксичных форм Ар, являющегося главным компонентом амилоидных отложений в мозге больных, обусловливает всю цепочку патологических изменений, приводящих, в конечном счете, к амилоидозу, нейродегенерации, гибели нейронов и развитию деменции [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, Selkoe, 2002]. Главными доказательствами этой гипотезы являются генетические данные о том, что семейные формы БА (СБА) обусловлены мутациями в генах белков, непосредственно участвующих в генерации Ав: в гене белка предшественника Ав, получившего название АРР (amyloid precursor protein) (APP); гене пресенилина-1 (PS1) и гене пресенилина-2 (PS2) [Hardy, Selkoe, 2002].
Несмотря на широкое признание гипотезы «амилоидного каскада» первые сомнения в ее универсальном характере вызвали сообщения о том, что у больных в ранней фазе СБА нарушения памяти и дисфункция синапсов происходят в отсутствии амилоидогенеза или нейрофибриллярной дегенерации и предшествуют гибели нейронов [Masliah etal., 1994]. Аналогичные результаты были получены и у трансгенных мышей, несущих СБА мутации в генах APP и PS1 [Oddo et al., 2003.]. И, наконец, изучение больных с наследственными формами БА продемонстрировало, что мутации в PS1 и АРР не обязательно ведут к повышению тотального уровня Ар, а, напротив, могут приводить к его снижению [Stenh et al., 2002; Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. При этом в ряде случаев отмечалось изменение отношения секретируемого Ар, содержащего 40 и 42 аминокислоты (соответственно АР40 и АР42) [Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. Эти результаты однозначно показывают, что для ясного понимания патогенеза СБА необходимо учитывать не только изменение секреции Ар, но и возможные нарушения клеточных функций АРР и пресенилинов.
Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы - выяснение роли генов пресенилина 1 и АРР в развитии синаптической патологии при болезни Альцгеймера. В работе поставлены следующие задачи:
-
Определить клеточную локализацию PS1 в поляризованных клетках с высоким уровнем экспрессии эндогенного PS1 и исследовать его роль в установлении межклеточных контактов нейронов.
-
Определить эффект мутаций в гене PS1 на образование межклеточных контактов. Выявить возможные связи между нарушением нормальных функций PS1 (участие в клеточной адгезии) и дисфункцией синапсов.
-
Провести анализ структурных, морфологических и функциональных изменений в синапсах при гиперэкспрессии гена АРР человека в Drosophila melanogaster. Создать модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющую разделить цитотоксические эффекты АРР и Ар.
-
Провести анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина Е на модели БА Drosophila melanogaster.
Научная новизна работы. Методом высокоразрешающей сканирующей иммуноэлектронной микроскопии и конфокальной микроскопии показано, что PS1 участвует в процессах клеточной адгезии. Впервые показано, что в линиях нейронов, полученных от мышей с нокаутом гена PS1, происходит дегенерация конусов роста и уменьшение числа синапсов. Впервые показано, что мутации в гене PS1 снижают накопление PS1 в межклеточных контактах и ведут к нарушениям клеточной адгезии. Впервые разработана модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющая разделить цитотоксические эффекты АРР и Ар. Впервые показано, что экспрессия АРР может приводить к структурным и функциональным изменениям в синапсах, нейродегенерации, экспрессии синаптических белков и когнитивным нарушениям независимо от образования Ар. Впервые показано, что пептиды-миметики аполипопротеина Е уменьшают нейродегенерацию и восстанавливают когнитивные функции животных на модели БА в Drosophila melanogaster.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе данные имеют фундаментальное значение для понимания патогенеза наследственных форм БА. Полученные результаты расширяют представления о роли генов АРР и PS1 в дисфункции синапсов при БА. Проведенные исследования представляют теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования роли АРР и PS1 в проявлении и развитии синаптических нарушений при БА.
Итоги работы представляют несомненный интерес для практической медицины. Результаты проведенных исследований показывают, что миметики аполипопротеина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.
Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Клеточные функции PS1 и природа дисфункций, вызываемых мутациями в этом гене при наследственных формах БА, не исчерпываются участием PS1 в гамма-секретазном комплексе. PS1 вовлечен в процессы клеточной адгезии, формирование и образование синаптических контактов.
-
Нокаут гена PS1 может приводить к нарушениям в образовании синапсов.
-
Экспрессия гена АРР человека и его мутантной формы АРР-Swedish в нервных клетках Drosophila вызывает изменение синаптогенеза, проявляющееся в уменьшении содержания синаптических белков в мозге. Этот эффект коррелирует с нарушением у животных способности к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок Drosophila. Наблюдаемые синаптические нарушения предшествуют нейродегенерации и обусловлены экспрессией гена АРР независимо от образования Ар.
-
Пептиды-миметики аполипопротеина Е, созданные на основе его рецептор-связывающего домена, эффективно подавляют нейропатологические процессы, вызываемые экспрессией гена АРР человека на модели БА Drosophila melanogaster. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: Второй международной конференции «Биотехнология - биомедицина - окружающая среда» (Пущино, 2005); Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005); Европейской конференции по нейропсихофармакологи (Амстердам,
-
-
; Третьей международной конференции «Наука и бизнес» (Пущино,
-
, Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006); на Международном симпозиуме «Biological motility: basic research and practice» (Пущино, 2006); Второй научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина»; Бреслеровские чтения - II (Санкт- Петербург, 2006); Первом международном симпозиуме «Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials» (Флоренция, 2007); Европейской конференции по генетике человека (Париж, 2007; Ґетеборг, 2010, Амстердам, 2011); Международной конференции «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак, 2007; 2008; 2011); Третьей международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме «Biological motility: achievements and perspectives» (Пущино, 2008), на Российском конгрессе с международным участием "Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное" (Санкт-Петербург, 2010); на Международном симпозиуме «Biological Мotility. From fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2010); на Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008; Одесса, 2010; Киев, 2012); XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ, в том числе 14 оригинальных работ, опубликованных в журналах, включенных в список ВАК, две главы в коллективной монографии и 10 статей в сборниках и материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 234 страницы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 55 рисунков, 10 таблиц, заключение, выводы и список литературы, включающий 496 источников.
Похожие диссертации на Роль генов пресенилина 1 и белка предшественника амилоида в дисфункции синапсов при болезни Альцгеймера.
-
