Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. 10
1.1. Этиология эндометриоза 10
1. 2. Клинические формы и клиническая картина эндометриоза . 11
1.3. Экзогенные факторы развития эндометриоза. 13
1.4. Эндогенные факторы развития эндометриоза. 14
1.4.1. Роль генетических факторов в развитии эндометриоза. 16
1.4.2.Роль гормональных факторов в развития эндометриоза. 19
1.4.3. Роль иммунологических факторов в развитии эндометриоза. 21
1.4.4. Роль оксидативного стресса в развитии эндометриоза. 24
1.5. Система детоксикации ксенобиотиков. 26
1.5.1. Гены и ферменты 1 фазы детоксикации ксенобиотиков . 30
1.5.1.1. Цитохромы Р-450. 30
1.5.1.1.1. Цитохром Р-450 1A1(CYP1A1). 31
1.5.1.1.2. Цитохром Р-450 2E1(CYP2E1). 32
1.5.1.1.3. Цитохром Р-450 19 (CYP19). 33
1.5.2. Гены и ферменты 2 фазы детоксикации ксенобиотиков 34
1.5.2.1. Глютатион-Б-трансферазы (GSTs). 34
1.5.2.1.1. Глутатион-Б-трансфераза класса М. 35
1.5.2.1.2. Глутатион-8-трансфераза класса Т. 36
1.5.2.2. Ацетилировапие (ариламин-М-ацетилтрансфераза (NAT). 37
1.5.2.2.1. Ариламин-Ы-ацетилтрансфераза 2 (NAT2). 37
1.5.2.3. Эпоксидгидролазы. 39
1.5.2.3.1.Микросомальная эпоксидгидролаза mEPHXl. 39
1.6. Ассоциация полиморфизма генов «внешней среды» с эндометриозом. 40
1.7. Проблемы лечения эндометриоза. 42
Глава 2. Материалы и методы. 45
2. 1. Обследуемые группы. 45
2.2. Реактивы, ферменты, биопрепараты, оборудование. 46
2.3. Исследуемые гены и их полиморфизмы. 47
2.4.Методы. 47
2.4.1. Экстракция геномной ДНК из периферической крови . 47
2.4.2. Полимеразная цепная реакция. 48
2.4.3. Гидролиз ДНК ферментами рестрикции. 51
2.4.5.Электрофорез в полиакриламидном геле и визуализация результатов. 52
2.5. Математические методы анализа. 52
3. Результаты 54
3.1 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у больных с эндометриозом и в контроле . 54
3.1.1 Анализ соответствия распределений закону Харди-Вайнберга. 54
3.1.2 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов Фазы 1 системы детоксикации ксенобиотиков. 55
3.1.3 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов Фазы 2 системы детоксикации ксенобиотиков. 62
3.2. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у больных с эндометриозом с различным эффектом от проводимой медикаментозной терапии. 71
3.2.1. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов Фазы 1 системы детоксикации ксенобиотиков у больных с эндометриозом с различным эффектом от проводимой медикаментозной терапии. 72
3.2.2 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов Фазы системы детоксикации ксенобиотиков у больных с эндометриозом с различным эффектом от проводимой медикаментозной терапии. 76
3.3. Анализ сочетаний генотипов по генам системы детоксикации ксенобиотиков у больных с эндометриозом и в контроле. 80
3.3.1. Анализ сочетаний «функционально ослабленных» генотипов у больных с эндометриозом и в контроле. 80
3.3.2. Анализ сочетаний «функционально ослабленных» генотипов в подгруппах больных с эндометриозом и в контроле. 84
3.3.3. Анализ сочетаний «функционально ослабленных» генотипов в группах больных с эндометриозом с различным эффектом от проводимой медикаментозной терапии. 86
4. Обсуждение результатов. 91
5. Выводы. 117
6. Приложение 1. 118
7. Список литературы.
- Клинические формы и клиническая картина эндометриоза
- Гены и ферменты 1 фазы детоксикации ксенобиотиков
- Экстракция геномной ДНК из периферической крови
- Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у больных с эндометриозом и в контроле
Введение к работе
Эндометриоз является одной из самых загадочных и нерешенных проблем в современной гинекологии, по частоте занимая 3 место после воспалительных заболеваний женских гениталий и миомы матки в структуре гинекологических заболеваний. В настоящее время эндометриоз принято рассматривать не только как специфическое местное гинекологическое заболевание, но и как патологический процесс («эндометриоидная болезнь»), в который вовлечены как смежные, так и отдаленные органы, и целые системы организма. Несмотря на многочисленные исследования, этиология и патогенез заболевания продолжают оставаться предметом научных дискуссий. Согласно современным представлениям, эндометриоз - это дисгормональное, иммунозависимое и генетически обусловленное заболевание, характеризующееся доброкачественным разрастанием ткани, сходной по морфологическому строению и функции с эндометрием, но находящейся за пределами полости матки (Баскаков и др., 2002).
По выражению М. R. Cohen, "Эндометриоз является почти эпидемией XX века от менархе до менопаузы" (Cohen, 1982). Частота эндометриоза по разным данным варьирует от 7 до 65%.
Большинство больных эндометриозом страдает от выраженного синдрома тазовых болей, 50 - 80% пациенток бесплодны, у многих женщин имеются нарушения эндокринного и иммунного статусов.
В настоящее время эндометриоз не только медицинская, но и социальная проблема. Заболевание, приводящее к нарушению репродуктивной функции и инвалидизации, приводит также к ощущению неполноценности, нанося физический и моральный ущерб женщинам в возрасте 20-40 лет.
Недостаточное понимание основных механизмов развития эндометриоза не позволяет добиться эффективности его лечения. Хирургическое лечение зачастую не способствует восстановлению специфических функций женского организма и не исключает рецидивов заболевания. Более чем 25-летний опыт гормональной терапии, направленной на подавление активности эндометриоидных очагов, развеял надежды на полное выздоровление и вызвал разочарование в связи с рецидивами и резистентностью многих клинических форм заболевания, не говоря уже о серьезных побочных эффектах лечения.
Причины возникновения, диагностика и лечение эндометриоза
остаются предметом споров от момента описания и до настоящего
времени. Однако нет сомнений в том, что эндометриоз является типичным
представителем мультифакториальных заболеваний. Это означает, что в
генезе патологического процесса важная роль принадлежит не одному, а
многим генам. Несомненно, генная сеть этого заболевания сложна и
разнообразна. Она включает различные гены метаболизма (детоксикации),
гены, ответственные за иммунный статус, эндокринные функции, гены
межклеточных взаимодействий. Патологические эффекты «мутантных»
вариантов (аллелей) этих генов в значительной степени провоцируются
действием неблагоприятных факторов внешней среды. Отмечающийся в
последние десятилетия рост заболевания, наряду с прогрессирующим
ухудшением экологической и токсикологической обстановки, а также
возможность экспериментальной индукции эндомертиоза у обезьян
(A.Gibbons,1993) свидетельствуют об участии генов системы
детоксикации ксенобиотиков (генов «внешней среды» - environmental genes) в патогенезе эндометриоза.
7 Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучить ассоциацию аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты 1-ой и 2-ой фазы системы детоксикации ксенобиотиков с развитием эндометриоза, а также определить их роль в эффективности медикаментозной терапии заболевания. Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач: 1 .Проанализировать частоты аллельных вариантов генов 1-й и 2-й фаз системы детоксикации (CYP1A1, CYP2E1, mEPXHl, CYP19, GSTM1, GSTT1, NAT2) у больных эндометриозом и в контрольной группе. 2.Провести комплексный анализ ассоциации аллельных вариантов генов 1 -й и 2-й фаз системы детоксикации у больных эндометриозом с учетом степени тяжести заболевания.
3.Проанализировать частоты полиморфных аллелей генов 1-й и 2-й фаз системы детоксикации у больных с различным эффектом медикаментозной терапии.
4.Провести суммарный анализ ассоциации аллельных вариантов генов 1-й и 2-й фаз системы детоксикации у больных с различным эффектом медикаментозной терапии.
5.0ценить вклад генов детоксикации в развитие эндометриоза и чувствительность к медикаментозной терапии заболевания. Научная новизна работы. Впервые изучены особенности аллельного полиморфизма генов CYP1A1 (A2455G(Ile462Val)), CYP2E1 (C9896G), CYP19 ((ТТТА)п повтор и del(TCT)) и 4-х генов фазы 2 GSTM1 (Del), GSTT1 (Del), NAT2 (С481Т , G590A G857A), mEPHXl (T337C(Tyrll3His) - 3-й экзон, A415G (Hisl39Arg) - 4-й экзон) при эндометриозе, а также проанализирована корреляция полиморфных вариантов изученных генов с тяжестью течения заболевания. Впервые показаны неслучайные ассоциации между развитием эндометриоза, степенью тяжести заболевания и полиморфизмом генов mEPHXl и GSTT1 у больных эндометриозом Северо-Западного региона
8 России. Впервые проведен ретроспективный анализ результатов медикаментозного лечения эндометриоза в зависимости от паттерна аллелей генов CYP1A1, CYP2E1, CYP19, GSTM1, GSTT1, NAT2 и mEPHXl. Впервые показано, что носительство аллеля D гена CYP19 и делеции (0/0) гена GSTM1 увеличивает риск резистентности к медикаментозному лечению у больных эндометриозом Северо-Западного региона России. Впервые показан синергический (аддитивный) эффект сочетаний изученных «функционально неполноценных» генотипов по генам 2-й фазы системы детоксикации при развитии и прогрессировании эндометриоза. Впервые при комплексном анализе полиморфизма генов, кодирующих ферменты фазы 2 детоксикации в группах пациентов с различными результатами медикаментозной терапии, выявлен синергический эффект «функционально неполноценных» ферментов, оказываемый на лечение больных эндометриозом.
Практическая значимость. Анализ генетического полиморфизма генов CYP19 ((ТТТА)п повтор в интроне 4 и del(TCT) в интроне 4), тЕРНХ1(Т331С (Tyrll3His) - 3-й экзон, A415G (Hisl39Arg) - 4-й экзон), GSTM1 (0/0), GSTT1 (0/0) можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска развития и эффективности лечения эндометриоза у женщин репродуктивного возраста. Материалы диссертационной работы вошли в методические рекомендации «Генетические аспекты профилактики и лечения эндометриоза» для врачей акушеров-гинекологов. Основные положения, выносимые на защиту.
1 .Функционально ослабленные генотипы GSTT1 0/0 и mEPHXl S, а также сочетания функционально ослабленных генотипов по генам фазы 2 системы детоксикации (GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, NAT2 S/S, mEPHXl S) ассоциированы с развитием наружного генитального эндометриоза.
2. Наличие определенных генотипов по генам CYP2E1 (аллель М (9896G)), CYP19 (del(TCT) в интроне 4), GSrM7(GSTMl 0/0), а также наличие
9 сочетанных «функционально ослабленных» генотипов GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, NAT2 S/S, mEPHXl S ассоциировано с различной эффективностью медикаментозного лечения эндометриоза.
Носительство сочетанного генотипа GSTM1 0/0 + CYP19 D/- или GSTT1 0/0 + CYP19 D/- или GSTM1 0/0 + (ТТТА)7(ТТТА)П увеличивает риск развития резистентности к медикаментозному лечению.
Выявленная ассоциация функционально ослабленных генотипов генов 1 и 2 фаз детоксикации с эндометриозом подтверждает роль неблагоприятных экзогенных факторов в развитии заболевания.
Апробация работы. Результаты работы представлены на 2-ом съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000), на 2-ом (4-ом) Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000), И-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), Международном конгрессе по предиктивной медицине (Франция, 2001), на Европейских конгрессах по генетике человека в 2003г. (Бирмингем, Великобритания), в 2004г. (Мюнхен, Германия), на Международном конгрессе по геному человека HGM2000 (Китай,2002).
Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (результаты и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 226 ссылок. Диссертация иллюстрирована 39 таблицами и 18 рисунками.
Клинические формы и клиническая картина эндометриоза
Несмотря на многолетние клинические и экспериментальные исследования эндометриоза достоверных сведений об этиологии заболевания достаточно мало (Koninchx, 1994). Существуют две основные теории происхождения эндометриоза. Согласно первой из них, эндометроиоидная ткань развивается из клеток целомического эпителия брюшины, которые в норме еще во внутриутробном периоде должны давать начало Мюллеровым протокам. В соответствии со второй теорией - непосредственно из клеток эндометрия, забрасываемых в брюшную полость в результате ретроградной менструации (заброс крови в брюшную полость через маточные трубы). Эта теория, получившая название «трансплантационной» в настоящее время общепризнанна. Тем не менее, принимая во внимание, что ретроградный заброс менструальной крови по некоторым оценкам отмечается почти у 90% женщин, остается непонятным, почему только у некоторых из них он приобретает агрессивный характер, то есть, завершается имплантацией и прорастанием клеток эндометрия в подлежащие ткани. Не ясно также, почему у части женщин процесс приобретает прогрессивный характер и быстро переходит в эндометриоидную болезнь, тогда как у других он имеет вялотекущее хроническое течение. Интересно отметить, что повышение социальной активности женщин и тенденция поздно рожать первого ребенка оказывают определенное влияние на развитие и течение эндометриоза.
Сто лет назад среднестатистическая женщина имела в течение своей жизни 40-60 менструальных циклов, поскольку большинство лет ее репродуктивного возраста уходило на беременность и лактацию. Сегодня же у современной женщины за репродуктивный период проходит около 400 менструальных циклов, и поэтому контаминация брюшной полости эндометриальными клетками в ходе ретроградных менструаций происходит с возрастающей частотой. В связи с этим можно всерьез говорить о том, что иммунная система скорее оказывается не в состоянии справиться с ними, нежели является исходно неполноценной: в итоге наблюдается эктопическая имплантация клеток эндометрия (Баскаков и др., 2002).
Установлена способность эндометриоидных клеток к имплантации и распространению при непосредственном занесении их в другие ткани во время операций, в результате разрыва эндометриоидных кист, а также гематогенным и лимфогенным путями (Баскаков и др., 2002, Стрижаков и др., 1995). При этом имеется в виду не попадание эндометрия из полости матки во время акушерских или гинекологических операций, а именно распространение элементов эндометриоза из имевшихся очагов. Отсутствие вокруг очагов эндометриоза соединительнотканной капсулы, способность к инфильтрирующему росту в окружающей ткани и метастазированию, ускорение разрастания после неполного удаления сближает эндометриоз с опухолевым процессом (Баскаков и др., 2002).
Как известно, эндометриоз представляет собой патологический процесс, при котором в миометрии или других органах половой системы и вне ее возникают включения (очаги), структура которых характеризуется наличием эпителиальных и стромальных элементов, присущих эндометрию.
К настоящему времени предложено более 10 классификаций наружного генитального эндометриоза, основанных, главным образом, на макро и/или микроскопической визуальной оценке анатомических поражений органов (локализация, глубина инвазии, выраженность спаечного процесса).
По современным представлениям верифицировать диагноз эндометриоза можно визуально во время лапароскопии, при которой можно идентифицировать синюшные, коричневатые, красно-багровые очаги. Диагноз подтверждается при гистологическом анализе. Представление о визуальных проявлениях эндометриоза в последние годы изменилось существенно и привело к выделению так называемых «малых» форм заболевания. К «малым» формам относятся мелкие единичные гетеротопии в области брюшины маточно-прямокишечного углубления, брюшины крестцово-маточных связок, на поверхности яичников. Обычно «малым» формам эндометриоза сопутствуют бесплодие, редко - болевые ощущения. Нарушений менструального цикла, как правило, не отмечается.
Среди классификаций наружного эндометриоза по степени распространенности наиболее употребляемой является классификация, предложенная A. Acosta (Acosta et al.,1973). По степени распространенности патологического процесса наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) подразделяется на «малые» формы, формы «средней» тяжести и «тяжелые».
Достаточно часто используется также классификация Американского Общества Фертильности 1985 г. (R-AFS), оценивающая распространение и инвазивность эндометриоза в баллах: I стадия (минимальная) 1-5 баллов II стадия (легкая) 6-15 баллов Шстадия (умеренная) 16-40 баллов ІУстадия (тяжелая) более 40 баллов
Частота бесплодия при генитальном эндометриозе примерно в 3 - 4 раза превышает частоту бесплодия в популяции, а частота самопроизвольного прерывания беременности (чаще в 1 триместре) колеблется от 10 до 50% (Лесков, 1998; Михнина, 1995; Dmowski, 1981; Waller, 1993). В настоящее время многими исследователями доказано, что эндометриоз встречается в любом возрасте независимо от этнической расы и социально-экономических особенностей (Адамян, Кулаков, 1998). Актуальность проблемы эндометриоза индуцировала многочисленные исследования, однако и до настоящего времени этиология и патогенез этого заболевания окончательно не установлены.
Среди уже известных причин, провоцирующих эндометриоз, выделяют как экзогенные, так и эндогенные факторы. Последние, достаточно условно можно разделить на гормональные, иммунологические, биохимические и генетические.
Гены и ферменты 1 фазы детоксикации ксенобиотиков
Цитохром Р-450, в литературе обозначаемый CYP, представляет собой группу ферментов, которые осуществляют не только метаболизм ксенобиотиков, но и участвуют в синтезе стероидных гормонов, холестерина, желчных кислот, простаноидов. Впервые цитохром Р-450 идентифицировали Klingenberg и Garfincell в микросомах печени крысы в 1958 год (Кукес, 2004).
Филогенетические исследования показали, что CYP появились в живых организмах около 3,5 миллиардов лет назад во время зарождения примитивных форм жизни.
Цитохром Р-450 является гемопротеином и в восстановленной форме связывает монооксид углерода с образованием комплекса с максимальным поглощением света при длине волны 450.
Наибольшее количество разнообразных ферментов этого суперсемейства находится в гепатоцитах, несколько меньше содержится в клетках кишечника, почек, легких, надпочечниках, головном мозге, коже, плаценте, миокарде. Важнейшим свойством CYP является способность метаболизировать практически все известные химические соединения. Наиболее важной реакцией при этом является гидроксилирование. У цитохрома Р-450 множество различных изоформ (изоферментов), которых на данный момент выделено более 1000 (Кукес, 2004)
Изоферменты семейства CYP I участвуют в метаболизме некоторых лекарственных средств (ЛС) и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) - основных компонентов табачного дыма и продуктов сжигания органического топлива. Отличительной особенностью изоферментов CYP I является их способность индуцироваться под воздействием ПАУ, в том числе, диоксина и 2,3,7,8,-тетерахлордибензо-р-диоксина (TCDD) (Кукес, 2004).
Ген CYP1A1 локализован на 15 хромосоме, в локусе 15q22-q24 и кодирует фермент арилуглеводородкарбоксилазу (АНН), представляющий собой белок, состоящий из 512 аминокислотных остатков, имеющий массу 58 кДальтон (Артамонов и др., 2004; Кукес, 2004). Фермент обнаружен, в основном в легких, в меньшей степени - в лимфоцитах и плаценте. Арилуглеводородкарбоксилаза участвует в метаболизме эстрогенов -осуществляет гидроксилирование эстрадиола, что приводит к его активации (Martucci, Fishman, 1993; Badawi et al., 2001). Полициклические ароматические углеводороды, в свою очередь, являются индукторами экспрессии гена CYP1A1. Проникнув в клетку и соединившись с Ah-рецептором, являющимся белком из класса регуляторов транскрипции, ПАУ образуют комплекс - ПАУ-АЬ-рецептор. Этот комплекс проникает в ядро и индуцирует экспрессию гена CYP1A1, связываясь со специфическим "диоксин-чувствительным" сайтом гена (Кукес, 2004). Таким образом, у курящих людей индукция CYP1A1 осуществляется наиболее интенсивно, что приводит к биоактивации канцерогенов.
На сегодняшний день идентифицируют 4 полиморфизма в гене CYP1A1 (Артамонов и др., 2004). Один из них, представляет собой однонуклеотидную замену A-G в экзоне 7 в положении 2455 последовательности гена и приводит к замене аминокислоты изолейцина (Не) на валин (Val) в 462 положении аминкислотной последовательности белка (Hayashi et al., 1992). В результате продуцируется фермент, активность которого почти в 2 раза выше, чем в исходном белке, что ведет к увеличению концентрации недоокисленных промежуточных токсических метаболитов и накоплению свободных радикалов. Этот полиморфизм встречается почти у 7% представителей европеоидной расы и рассматривается как фактор риска возникновения рака легких (Daly, 1995).
Ген CYP2E1 находится на 10 хромосоме, в локусе 10q24.3-qter и кодирует белок, состоящий из 493 аминокислотных остатков, имеющих молекулярную массу 56634 Дальтон. Фермент обнаружен в основном в печени и составляет около 7% от всех изоферментов цитохрома Р-450 (Кукес, 2004; Lewis et al., 1999; Lewis, 1999).
Цитохром Р-450 2Е1 вовлечен в биотрансформацию как ксенобиотиков, так и эндогенных субстратов (Bauer et al., 2005). Экзогенными субстратами данного изофермента являются небольшое число ЛС, а также этанол, нитрозамины, небольшие ароматические углеводороды (бензол, анилин) и алифатические хлоруглеводороды. Индукторами CYP2E1 являются этанол, изониазид, пиридин и некоторые другие ксенобиотики, а ингибиторами -дисульфирам и ритонавир. Также, существуют данные об участии изофермента CYP2E1 в метаболизме стероидных гормонов (Ball et al., 1990; Haas et al., 2006; Пальцев, 2004).
Экстракция геномной ДНК из периферической крови
В настоящей работе представлены результаты обследования 122 женщин Санкт-Петербурга в возрасте от 18 до 41 года с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) различной степени распространенности процесса, проходивших лечение в НИИ АГ им. Отта РАМН (таб. 1). Диагноз НГЭ у пациенток установлен на основании гистологического исследования биоптатов эндометриоидных гетеротопий (очагов), взятых в процессе лапароскопии. Группа больных эндометриозом была разделена дополнительно на 2 подгруппы в зависимости от распространенности процесса. В подгруппу с легкой степенью включили пациентов с эндометриозом I и II стадии. В подгруппу с тяжелой степенью включили пациентов с эндометриозом III и IV стадии.
Контрольную группу составили 90 женщин репродуктивного возраста (18-45 лет), проживающие на территории Санкт-Петербурга и не имеющих клинических проявлений эндометриоза на момент сбора материала.
В группу больных эндометриозом с успешным лечением вошли 51 женщины, которые хорошо переносили терапию агонистами гонадотропин-рилизинг-гормонов (ГнРГ), а после окончания курса медикаментозной терапии, у этих пациенток не было отмечено рецидива заболевания, и наступила беременность. Агонистами гормонов называются синтетические лиганды, вызывающие тот же эффект, что и природные гормоны (Кольман, Рем, 2000).
В группу больных эндометриозом со слабо выраженным эффектом от проводимой медикаментозной терапии вошли 71 женщина с длительным (более 2-х лет) рецидивирующим течением заболевания и возобновлением клинических симптомов эндометриоза после отмены лекарственных препаратов, а также с наличием выраженных побочных эффектов на фоне применения агонистов ГнРГ.
Наряду с агонистами ГнРГ пациенткам проводилась иммуномодулирующая терапия препаратами Циклоферон или Ронколейкин.
В работе были использованы следующие реактивы, ферменты, биопрепараты: акриламид, бис-акриламид, ЭДТА, 5% раствор глицерина, протеиназа К (фирма «Sigma» США), ТЕМЕД, додецилсульфат натрия, трисНСЬ (фирма «Serva», ФРГ), 2-меркаптоэтанол (фирма «Регах»,ФРГ), дсзоксинуклеотид фифосфаты, дидезоксинуклеотид-трифосфаты, тритон XI00, хлорид магния, хлорид натрия, сульфат аммония, персульфат аммония, ферменты рестрикции: Taql, Kpnl, Hindi, BamH, Dra I, EcoRV, Rsal («Сибэнзим»), термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus (НПО «Биотекс»), прибор для амплификации фирмы «ДНК-технология», США, олигонуклеотидные праймеры (НПО «Сибэнзим», г.Новосибирск).
Изучены особенности генетического полиморфизма 3-х генов фазы 1 системы детоксикации (CYP1A1, CYP2E1, CYP19) и 4-х генов фазы 2 (GSTMl, GSTTl, NAT2, mEPHXl). Характеристика изученных полиморфных вариантов представлена в таблице 2.
Образцы ДНК получали из лимфоцитов периферической крови либо проводили ПЦР непосредственно на сухих пятнах крови, помещая в реакционную смесь фильтр, пропитанный кровью, размером 1x1 мм.
Выделение ДНК из ядер лимфоцитов проводили в соответствии с методикой приведенной в руководстве Самбрук и др. с некоторыми модификациями (Sambrook et al., 1989).
В пробирку, содержащую 3 мл глюгицира (антикоагулянт, содержащий 20 г двузамещенного гидроцитрата Na и 30 г глюкозы в 1 л)
добавляли 10 мл крови.
2. Переносили по 5 мл крови в центрифужные 10-мл пробирки, добавляли 5 мл сахарозного буфера, перемешивали, центрифугировали в течении 10 минут, при скорости 3 тыс.об./мин. и удаляли супернатант.
3. Ресуспендировали осадок в 200 мкл буфера для протеиназы К (см 3.2.), переносили в 1.5-мл пробирку, добавляли SDS (10%) до конечной концентрации 0.5%, 5 мкл протеиназы К (концентрация 20 мг/мл); инкубировали в термостате (37С) 16 часов.. После инкубации проводили экстракцию белков.
4. Добавляли 500 мкл чистого фенола, перемешивали, центрифугировали в течении 10 минут, при скорости 5.5 тыс. об/мин. Переносили водную фазу в 1.5-мл пробирку, добавляли 500 мкл смеси фенола/хлороформа(1:1), перемешивали, центрифугировали течении 10 минут, при скорости 6 тыс.об./мин. Переносили водную фазу в1.5-мл пробирку, добавляли 500 мкл хлороформа, перемешивали, центрифугировали в течении 15 минут, при скорости 10 тыс.об/мин.
5. Переносили водную фазу в 1.5-мл пробирку, добавляли 50 мкл З М ацетата Na, добавляли два объема этанола (96%), перемешивали и наблюдали преципитацию геномной ДНК.
6. Центрифугировали в течение 10 минут, при скорости 14 тыс.об./мин. Удаляли водную фазу, промывали осадок 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в 50-200 мкл ТЕ.
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у больных с эндометриозом и в контроле
Нами проведен анализ наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов для генов фазы 1 системы детоксикации ксенобиотиков: C7/ 7 7(A2455G(Ile462Val), CYP2E1(C9S96G (Taq I полиморфизм)), CYP19 ((TTTA)n повтор в интроне 4 и del(TCT) в интроне 4), а также для генов фазы 2 системы детоксикации: NAT2 (С481Т, G590A, G857A), wP#X7(T337C(Tyrll3His) - 3-й экзон, A415G(Hisl39Arg) - 4-й экзон)) в группе больных с эндометриозом и в контрольной группе, а также в подгруппах больных
Для полиморфизма гена CYP1A1 показано, что распределение генотипов в контрольной группе, группе больных с эндометриозом, а также в подгруппах больных соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р 0.05).
Для полиморфизма гена CYP2E1 анализ ожидаемых и наблюдаемых частот генотипов не выявил различий как в группе и подгруппах больных с эндометриозом, так и в контроле (р 0.05). Аналогичные результаты были показаны для двух полиморфных вариантов гена CYP19 (р 0.05).
Для двух полиморфных вариантов гена mEPHXl распределение генотипов в контрольной группе, группе больных с эндометриозом, а также в подгруппах больных соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р 0.05). Для полиморфизма гена NAT2 анализ ожидаемых и наблюдаемых частот генотипов не выявил различий как в группе и подгруппах больных с эндометриозом, так и в контроле (р 0.05).
Для выявления возможной ассоциации полиморфизма генов фазы 1 системы детоксикации ксенобиотиков с развитием эндометриоза проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов между выборкой больных с эндометриозом и контролем, а также между подгруппами больных.
Ген CYP1A1. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма A2455G(Ile462Val) гена CYP1A1 между выборками больных с эндометриозом и контролем не выявил статистически значимых различий (р 0.05) между изученными группами. Частоты аллелей F (Val462) и N (Не 462) составили: 3.9% и 96.1% - в контроле, и 4.5% и 95,5% - в группе больных эндометриозом (табл. 5). Частоты генотипов F/F, F/N и N/N составили: 0.0%, 7.8% и 92.2% - в контрольной группе, и 0.0%, 9.0% и 91.0% - в группе больных (табл. 5).
Статистически значимые различия не выявлены при сравнении частот генотипов и аллелей полиморфизма Ile462Val гена CYP1A1 между подгруппами больных с эндометриозом и контрольной группой (р 0.05). Частоты генотипов F/F, F/N и N/N в этих подгруппах составили: 0.0%, 5.9% и 94.1% - для легкой степени, 0.0%, 13.0% и 87.0% - для тяжелой и практически не отличались от таковых в контрольной группе (0.0%, 7.8%) и 94.1%) (табл. 6). Частоты аллелей F и N составили: 2.9%) и 97.1% в подгруппе с легкой степенью заболевания, 6.5% и 93.5% в подгруппе с тяжелой степенью, 3.9% и 96.1% в контрольной группе.
Как следует из таблицы 6, частота аллеля F гена CYP1A1 в подгруппе с тяжелой степенью заболевания превысила таковую в подгруппе с легкой степенью более чем в 2 раза (6.5% против 2.9%, соответственно), однако, полученные различия статистически не достоверны.
Ген CYP2E1. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей C9896G полиморфизма гена CYP2E1 между выборками больных с эндометриозом и контролем не выявил статистически значимых различий (р 0.05). Частоты аллелей М (9896G) и N (9896С) составили: 10.6% и 89.4% -в контроле, и 8.2% и 91.8% - в группе больных (табл. 7). Частоты генотипов М/М, M/N и N/N составили: 1.2%, 18.8% и 80.0% - в контрольной группе, 1.6%, 13.1%) и 85.2% - в группе больных (табл. 7).
Статистически значимые различия не выявлены при сравнении частот генотипов и аллелей гена CYP2E1 между подгруппами больных с эндометриозом и контрольной группой (р 0.05). Частоты генотипов М/М, M/N и N/N в этих подгруппах составили: 2.9%, 11.8% и 85.3% - для легкой степени заболевания, 0.0%, 14.8% и 85.2% - для тяжелой степени и соответствовали таковым в группе контроля (1.2%, 18.8% и 80.0%)(табл. 8). Частоты аллелей М и N составили: 8.8% и 91.2% в подгруппе с легкой степенью эндометриоза, 7.4% и 92.6% в подгруппе с тяжелой степенью и 10.6% и 89.4% в контрольной группе.
