Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика дыхательных расстройств новорожденных 10
1.1.1. Респираторный дистресс-синдром Ю
1 1.2. Эпидемиология и факторы риска РДС 13
1.1.3. Наследственные факторы риска РДС 15
1.14 Врожденная пневмония 17
1.1.5. Эпидемиология и факторы риска врожденной пневмонии 17
1.2. Сурфакчантный комплекс легких 19
12 1 Состав, свойства и функции сурфактаптной системы легких 19
12 2 Метаболизм сурфактанта 22
1.3. Гены-кандидаты дыхательных расстройств у новорожденных 23
1.3.1. Роль гидрофильных белков сурфактанта SP-A и SP-D в составе сурфактанта 26
13 2 Роль гидрофобных апопротеинов сурфактанта SP-B и SP-C в составе сурфактанта 29
1.4. Ціпокииы и дыхательная система новорожденных 34
1.5. Ангиотепзин-превращающий фермент и дыхательная система новорожденных 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1. Объект исследования 47
2 11. Распределение обследуемых индивидов по группам 48
2.2. Выделение ДНК 50
2.3. Проведение полимеразнои цепной реакции и ПДРФ-анализа 51
2.4. Проведение электрофореза и визуализация результатов 57
2.5. SSCP-анализ 58
2 5 1. SSCP-анализ с щелочной денатурацией 58
2.6. Определение нуклеотидной последовательности 59
2.7. Статистические методы обработки резулыаюв исследования 59
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Полиморфизм генов белков сурфактанта у больных с дьіхаїельньїми расстройствами 62
3.1.1. Результаты SSCP-анализа промоторной обчисти и 4-го экзона zenaSFTPB 63
3.1.2. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов SFTPB, SFTPC, SFTPD среди бочьных с дыхательными расстройствами и в контрольной группе 67
3.2. Полиморфизм генов цитокинов у больных с дыхательными рассіройствами 86
3.2.1. Распределение частот генотипов и аллелей почиморфных локусов генов TNFauLTA среди больных с дыхательными расстройствами и в контро іе... 86 3.2 2. Распределение генотипов и аллелей полшюрфных локусов генов семейства IL1B среди больных с дыхательными расстройствами и в контроле 90 3.2.3 Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса -174G>C гена IL6 среди больных с дыхательными расстройствами и в контроле. 97
3.2.4. Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса -251Т>А гена IL8 среди больных с дыхательными расстройствами и в контроле.. 99
3.2.5. Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса -627С>А гена IL10 среди бочьных с дыхательными расстройствами и в контроче
3.3. Полиморфизм гена ангиоіензин-превращающего фермента у новорожденных с дыхательными расстройствами 104
Заключение по
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Список литературы
- Эпидемиология и факторы риска РДС
- Состав, свойства и функции сурфактаптной системы легких
- Распределение обследуемых индивидов по группам
- Результаты SSCP-анализа промоторной обчисти и 4-го экзона zenaSFTPB
Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на значительные достижения неонатологии последних десятилетий, проблема дыхательных расстройств по-прежнему актуальна. Леючные патологий остаются самыми частыми причинами развития критических состояний у новорожденных, особенно недоношенных. Это определяется сохранением, и даже увеличением высокого уровня заболеваемости детей с экстремально низкой массой тела по мере улучшения их выхаживания [Дементьева Г.М., 2002; Nogee L., 2004]. Среди всех дыхательных нарушений новорожденных одно из ведущих мест принадлежит респираторному дистресс-синдрому и врожденной пневмонии.
Большую часть пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных составляют больные респираторным дистресс-синдромом (РДС) [Bober К., Swietlinski J., 2006]. А в структуре причин неонатальной смертности в России на долю этой патологии приходится 17.5% [Шабалов Н.П., 2004].
Хотя терминология в отечественной и зарубежной литера іуре не совпадает, считается, что РДС встречается повсеместно у 1-2% всех живорожденных и у 14%о детей, родившихся с массой тела менее 2500 грамм. Частота развития РДС обратно пропорциональна степени недонашивания беременности [Strandjord Т.Р. et al., 2000; Haataja R., 2001; Grafoor Т. et al., 2003]. По данным на 1996 г., распространенность РДС в России составляла 197.6 на 10 000 родившихся живыми [Шабалов Н.П., 2004]. За последние годы не наблюдалось тенденции уменьшения количества заболевших [Дементьева Г.М., 2002]. По данным Горздрава за 2006 год в г. Уфе дыхательные нарушения наблюдались у 15.18%) новорожденных от числа всех рожденных, из них 46.52%) оказались недоношенными.
В основе респираторного дистресс-синдрома (РДС) лежит нарушение функции сурфактанта, что может быть связано с дефицитом, или дефектом его
продукции, инактивацией или усилением деградации. Вторичный дефицит сурфактаніа наблюдается и в случае развития внутриутробной пневмонии. Нарушение состава и количества сурфактанта связано со снижением его защитной функции и возникновением воспаления [Фомичев М.В., 2004].
Клинические и рентгенологические признаки РДС неспецифичны, во многом сходны с таковыми при врожденной пневмонии: одышка, экспираторные шумы, западение грудной клетки на вдохе, присіупьі апноэ и т.п. Очень типичны для РДС нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы. Серьезную опасность представляет также вторичная инфекция [Шабалов П.П., 2004].
В связи с ухудшением состояния здоровья матерей и распространенностью внутриутробного инфицирования, внутриуїробная пневмония также остается одной из важных проблем неонатальной пульмонологии. Более того, нередко заболевание протекает по схеме: РДС-пневмония-сепсис [Шабалов Н.П., 2004].
Пневмонию диагностируют примерно у 0.5-1% доношенных и 10-15% недоношенных новорожденных. По данным литературы, пневмонию на секции выявляют у 15-38% мертворожденных и 20-32% умерших живорожденных детей [Бойко Т.В. и др., 2000].
Хотя воспалительный процесс в ткани легкого может быть изначально и неинфекционной этиологии, пневмонию всегда рассматривают как инфекционный процесс. Врожденные пневмонии вызываются возбудителями, проникшими к ребенку от матери трансплацентарно, анте- или интранатально [Архипов В.В. и др., 2002].
С целью профилактики и лечения РДС, пневмонии и некоюрых других заболеваний оріанов дыхания в настоящее время применяется экзогенный сурфактанг и различные способы дотации кислорода. Однако, механизм действия сурфактанта не всегда ясен, а данные последних лет говорят о возможности возникновения патологий, связанных с применением искусственной вентиляции легких. В контексте вышесказанного,
7 эффективность и показания к применению указанных способов профилактики и лечения нуждаются в дополнительном изучении и экспериментальном обосновании [Herting Е. et al., 1999; Apisarnthanarak A. et al., 2003; Jobe A., 2006].
Респираторный дистресс-синдром новорожденных и врожденная пневмония относятся, по всей видимости, к многофакторным заболеваниям [Copland 1.В., Post М., 2002]. Такие признаки контролируются множественными взаимодействующими факторами как экзогенного, так и эндогенного характера, в том числе генетическими. В случае многофакторных болезней мугантный генотип обладает неполной пенетрантностью, и риск, ассоциированный с такой мутацией, превышает среднепопуляционный всего в несколько (2-3) раз [Аульченко Ю.С., Аксенович Т.И., 2006]. Одним из методов генетики многофакторных заболеваний является исследование ассоциации полиморфных вариантов генов, продукты которых предположительно задействованы в развитии и регуляции тех или иных звеньев патогенеза заболевания [Silverman Е., Palmer L., 2000; Hall I., 2002].
К факторам риска, способствующим развитию РДС относятся: сахарный диабет у матери, острая кровопотеря в родах, кесарево сечение, перинатальная гипоксия и асфиксия, мужской пол новорожденного, рождение вторым из двойни, внутриутробные инфекции [Haataja R., 2001; Шабалов Н.П., 2004]. Как было показано в нескольких исследованиях, одним из факторов риска РДС является генетическая предрасположенность [Makri V. et al., 2002; Haataja R., 2001; Marttila R. et al., 2003; Van Sonderen L., et al., 2002; Floras J., 2005].
Поскольку в патологическом повреждении сурфактантной системы и нарушениях кровообращения в легких принимают участие разнообразные медиаторы воспаления и регуляторы сосудистого тонуса, молекулярно-генетическое исследование природы дыхательных расстройств у новорожденных является наиболее полным, когда в анализ включается множество генов, эффект которых модифицирован внешнесредовым влиянием.
8 Исходя из патогенеза респираторного дисгресс-синдрома и врожденной пневмонии новорожденных, для молекулярно-генетического анализа нами были выбраны гены, белковые продукты которых относятся к системам сурфактанта, цитокиновой сети и ренин-ангиотензиновой системы.
Цель исследования: оценить роль полиморфных вариантов генов белков сурфактанта, цитокинов и ангиотензин-превращающего фермента в формировании наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных.
Задачи:
Сформировать выборки и создать коллекцию ДНК новорожденных с дыхательными расстройствами и здоровых новорожденных.
Проанализировать полиморфизм генов белков сурфактанта SFTPB, SFTPC, SFTPD и гаплотипы генов SFTPB, SFTPD у больных с дыхательными расстройствами и здоровых новорожденных.
Провести анализ полиморфных локусов іенов цитокинов TNFa, LTA, ILIB, IL1RN, IL6, IL8, ILIO, а также гаплотипов генов TNFa-LTA и ILIB-ILlRNy больных с дыхательными расстройствами и здоровых новорожденных.
4. Изучить особенности распределения частот аллелей и генотипов
инсерционно-делеционного полиморфизма гена АСЕ у больных с
дыхательными расстройствами и здоровых новорожденных.
5. Определить генетические маркеры предрасположенности и устойчивости
новорожденных к дыхательным расстройствам, врожденной пневмонии,
респираторному дистресс-синдрому и его инфекционным осложнениям.
Научная новизна
Впервые в России у новорожденных с дыхательными расстройствами проведен анализ полиморфизма генов белков сурфактанта (SFTPB, SFTPC, SFTPD), цитокинов (TNFa, LTA, ILIB, ILIRN, IL6, IL8, ILIO) и ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ). Впервые исследована ассоциация аллелей и
9 генотипов полиморфных локусов генов SFTPD, цитокинов и АСЕ с развиїием РДС, врожденной пневмонии и риском возникновения инфекционных осложнений у новорожденных с РДС.
Практическая значимость
Результаты исследования можно использовать для прогнозирования развития дыхательных расстройств у новорожденных и инфекционных осложнений у детей с РДС.
Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования врачей.
Положения, выносимые на защигу:
По распределению частот гаплотипов гена SFTPB, гаплотипов генов семейства IL1B и генотипов гена АСЕ выборка новорожденных с дыхательными расстройствами достоверно отличается от группы здоровых новорожденных.
Генетическими маркерами предрасположенности к расстройствам дыхания в первые сутки после рождения являются определенный гаплотипический вариаш гена SFTPD и делеционный аллель гена АСЕ.
Риск развития РДС новорожденных маркируется генами SFTPB, IL1B, ILIRN. Риск развития врожденной пневмонии маркирует ген SFTPD.
Полиморфные варианты генов SFTPD, TNFa, ILIRN, ILK) ассоциированы с развитием инфекционных осложнений у новорожденных с РДС.
Важной составной частью генетической структуры подверженности РДС и
врожденной пневмонии новорожденных являются полиморфные варианты генов SFTPB, SFTPD, TNFa, IL1B, ILIRN, ILIO, ACE.
Эпидемиология и факторы риска РДС
. Эпидемиология и факторы риска РДС Частота развития РДС находится в обратной зависимости от срока гестации новорожденного и колеблется в пределах 82-88 % - у детей менее 27 недель гестации, и 1-2% - при сроке гестации 37 недель и более [Robillard P.Y. et al., 1994; Strandjord T.P. et al., 2000; Haataja R., 2001; Grafoor T. et al., 2003]. БГМ (СДР I типа, РДС) и ее последствия - причина 30-50 % неонаїальньїх смертей [Шабалов Н.П., 2004].
Несмотря на несовпадения терминологии в отечественной и зарубежной литературе, считается, что РДС встречается повсеместно у 1-2%) всех живорожденных и у 14% детей, родившихся с массой тела менее 2500 грамм. По данным на 1996 г., распространенность РДС в России составляла 197.6 на 10 000 родившихся живыми [Шабалов Н.П., 2004]. За последние годы не наблюдалось тенденции уменьшения количества заболевших [Дементьева Г.М., 2002]. По данным Горздрава за 2006 г. в г. Уфа дыхательные расстройства наблюдались у 15.18% новорожденных от числа всех рожденных, из них 46.52% оказались недоношенными.
Большая часть наиболее распространенных заболеваний человека не следуют простому менделеевскому типу наследования, а являются результатом действия многих генетических факторов в сочетании с воздействиями среды и случайными причинами, то есть имеют мультифакториальную (или мультифакторную - К.В.) природу. В категорию таких признаков попадают основные причины заболеваемости и смертности в современных популяциях человека: сахарный диабет, сердечнососудистые заболевания, бронхиальная астма, рак, генетическая составляющая чувствительности к инфекциям и др. [Геномика-медицине, 2005]. К этому ряду комплексных мультифакторных заболеваний (МФЗ), по-видимому, относится и респираторный дистресс-синдром [Yurdakok М, 2004] (рис. 1.1).
К факторам риска, способствующим развитию РДС, относятся: сахарный диабет у матери [Robert M.F. et al., 1976; Фомичев MB., 2002], острая кровопотеря в родах [Gluck L., Kulovich М., 1973], кесарево сечение [White Е. et al., 1985], перинатальная гипоксия и асфиксия [Robson Е., Hey Е., 1982], особенно при высоком или низком риске преэклампсии, мужской пол новорожденного [Farrel P.M., Wood R.E., 1976], рождение вторым из двойни [Verduzco R. et al., 1976; Arnold С. et al., 1987; Mercer B.M. et al., 1993; Prins R.P., 1994], внутриутробные инфекции [Шабанов Н.П., 2004].
Профилактика недонашивания, введение глюкокортикоидов для ускорения созревания легочной ткани при угрозе преждевременных родов, увеличение длительности безводного промежутка, плацентарная недостаточность артериальная гипертензия у беременной и сам процесс родов снижают частоту и/или тяжесть РДС. Это связано со стимулирующим выработку сурфактанта действием кортикостероидов, эндогенных катехоламинов, а также тиреоидных гормонов [Фомичев М.В., 2002].
Кроме того известно, что недоношенные дети из Афро-американской популяции реже страдают от РДС, переносят его в более легкой форме и с меньшими осложнениями, чем новорожденные дети европеоидов [Farrell P.M., Wood R.E., 1976; Husley T.C. et al., 1993].
Подобно другим комплексным болезням РДС не проявляет четкого паттерна наследования. До внедрения адекватных методов терапии новорожденные с этой патологией неизбежно погибали. В результате, для данного заболевания семейное изучение больных было невозможно, как невозможно было составить и достаточно обширные родословные. Анализ сцепления и полногеномное сканирование, широко применяемые для изучения сцепления генетических маркерных локусов с заболеванием, были просто неприменимы к РДС. Вполне возможно, что, благодаря успехам в лечении последних лет и снижению смертности от РДС, в будущем станет возможным проведение семейных исследований, по крайней мере, двух поколений больных [IIaatajaR.,2001].
К настоящему моменту стали известны лишь отдельные закономерности развития РДС. В небольшом исследовании близнецов (31 пара) была показана высокая конкордантность монозигот (85%), но сравнению с дизиготами (44%) [Myrianthopoulos N.C. et al., 1971]. Эти данные не подтвердились для популяции финнов при анализе 133 пар (55 и 48%, соответственно). Однако, по мнению авторов, это не исключает значительного вклада генетической компоненты в этиологию РДС [Haataja R., 2001]. Следует учесть, что в возникновении данного заболевания немаловажную роль играют факторы, действующие во время беременности и родов [Philips D.I., 1993]. Например, как было упомянуто выше, для родившегося первым из двойни повышен риск внутриутробного инфицирования, но снижен риск развития респираторного дистресс-синдрома [Arnold С. et al., 1987].
Состав, свойства и функции сурфактаптной системы легких
Сурфактант - (от английского «surfactant» - surface active substance) -высокоэффективное поверхностно-активное вещество легких.
Строго говоря, следует рассматривать сурфактантную систему легких, куда входят неклеточный альвеолярный комплекс и клетки альвеол. Комплекс клеток объединяет альвеолоциты 1-го и 2-го типов, секреторные клетки Клара и альвеолярные макрофаги [Романова Л.К. и др., 1994] Неклеточный компонент состоит из сурфактантного альвеолярного комплекса, который включает межфазный, резервный сурфактант и жидкую гипофазу. Гипофаза расположена непосредственно над поверхностью эпителиальных клеток и служи І жидкой подложкой для межфазного сурфактанта. В ней обнаруживаются упорядоченные бимембранные структуры резервного сурфактанта -тубулярного миелина. Межфазный сурфактант представляет собой однослойную мембрану на границе раздела фаз жидкость-воздух [Болезни органов дыхания, 2000].
Сурфактант примерно на 90% состоит из липидов. 80% из всех липидов - фосфолипиды: фосфатидилхолин (ФХ) (лецитин) составляет 70% (до 60% насыщенный ФХ), фосфатидилглицерол, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, лизофосфатидилхолин - остальные 30%) [King R.J., 1982]. На белки, как сывороточные, с относительной молекулярной массой 65-70 кДа, так и апопротеины сурфактаната, массой до 45 кДа, приходится 10% от общего состава комплекса. Функциональная роль сывороточных протеинов в составе сурфактанта не выяснена, однако они могут ингибировать его активность [Hallman М. et al., 1991]. Из четырех протеинов сурфактанта (SP) А, В и С являются его апопротеинами. Они служат важными детерминантами структуры, гомеостаза и поверхностной активности сурфактанта. Кроме і ого, SP-A и SP-D играют иммуномодулирующую роль [Mason RJ. et al., 1998]. На SP-A приходится 50% всех протеинов. SP-A и SP-D являются гидрофильными белками, принадлежащими к группе лектинов млекопитающих - коллекіинов. SP-B и SP-C представляют из себя небольшие чрезвычайно гидрофобные протеины, сходные по строению с сапозинами [Haataja R., 2001].
В настоящее время описано множество функций сурфактанта. Биофизические функции: снижение поверхностного натяжения на границе жидкость-воздух до величин, близких к 0 и препятствие спадению альвеол на выдохе [Hawgood S., Clements J.A., 1990], облегчение расправления легких при первом вдохе, стабилизация и поддержка мелких воздухоносных путей, защита альвеолярного эпителия о г повреждений и облегчение мукоцилиарного клиренса, перенос частиц менее 6 мкм в гипофазу легочной жидкости, облегчение удаления частиц и разрушенных клеток из альвеол в бронхи в конце выдоха [Griese М., 1999], регуляция микроциркуляции в легких и проницаемости стенок альвеол, препятствие развитию отека легких [Pattle R.E., 1995].
Иммунологические и другие функции: фосфолипиды супрессируют пролиферацию, продукцию иммуноглобулинов и цитотоксичность лимфоцитов, фосфолипиды ингибируют стимулированное эндотоксинами освобождение цитокинов из макрофагов (TNFu, IL1, IL6), SP-A и SP-D опсонизуруют различные микроорганизмы, модулируют фагоцитоз, хемотаксис и оксидативное разрушение макрофагов, но способны также оказывать противовоспалительное действие на легочную среду, сурфактант нейтрализует эндогенные медиаторы: радикалы и активные формы кислорода, SP-A и SP-D способны захватывать и связывать бактериальные токсины [Haagsman Н.Р., van Golde L.M., 1991; Griese M, 1999; Gardai S.J., et al., 2003], SP-B и SP-C играют непосредственную роль в сборке тубулярного миелина и перемещении фосфолипидов на границу жидкость-воздух, SP-B и SP-C способны взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами фосфолипидов [Yurdakok М., 2004], SP-B сам по себе способен обращать воспалительные реакции и поддерживать функцию легких in vivo [Ikegami М. et al., 2005].
Распределение обследуемых индивидов по группам
Объектом исследования служили 108 новорожденных детей с дыхательными расстройствами, в том числе с респираторным дистресс-синдромом, врожденной пневмонией и сепсисом с проявлениями пневмонии. Все пациенты находились на лечении в отделении Реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГДКБ № 17 г. Уфы в период с 2003 по 2005 г.
Обследование пациентов и постановку диагноза проводили врачи реаниматологи и неонатологи городской детской клинической больницы № 17 г. Уфы . Диагноз «респираторный дистресс-синдром» или «врожденная пневмония» ставился на основании учета анамнестических, лабораторных данных (анализ мочи, вирусологические и бактериологические обследования, анализ крови с подсчетом количества тромбоцитов, газовый состав крови), клинической картины (одышка, экспираторные шумы, западение грудной клетки на вдохе, приступы апноэ, цианоз, раздувание щек, парадоксальное дыхание, напряжение крыльев носа, отек кистей и стоп, признаки угнетения ЦНС, олигурия, признаки кишечной непроходимости, гиповолемия, внугрижелудочковые кровоизлияния, легочная гипергензия, наслоение вторичной инфекции) и рентгенологического исследования грудной клетки (диффузные симметричные очаги пониженной прозрачности, воздушная бронхограмма, пониженная иневматизация периферических легочных полей, рассеянные ателектазы - РДС, рассеянная перибронхиальная очаговая или сливная инфильтрация, очаговые тени на фоне усиленного бронхососудистого рисунка и эмфиземы - пневмония).
На каждого больного была заполнена специально разработанная нами анкета. В нее вошли данные опроса и амбулаторной карты матери и карты наблюдений новорожденного. Включены сведения о факторах риска матери, сопутствующих заболеваниях, протекании беременности и родов, результаты клинического наблюдения, лабораторных и специальных исследований (общий и биохимический анализ крови, мочи, газовый состав и кислотно-основное состояние крови, рентгенография). Для дальнейшего анализа использованы данные о течении заболевания ребенка, полученные в день поступления в ГДКБ № 17, первоначальный и уточненный в ходе лечения диагноз.
Все новорожденные нуждались в интенсивной дыхательной терапии продолжительностью не менее 48 часов. В день поступления основными методами респираторной помощи служили: искусственная вентиляция легких -у 45.37% пациентов (49 детей), спонтанное дыхание с постоянным положительным давлением в дыхательных путях (СРЛР) у 12.04% новорожденных (13 детей), спонтанное дыхание с дотацией кислорода в детскую кислородную палатку или через лицевую маску - 33.33% (36 детей). Лечение завершилось выздоровлением или переводом в другое отделение для 97 детей, летальным исходом на первом месяце жизни у 11 новорожденных.
Три ребенка были исключены из исследования по причине выявления у них позднее пороков развития.
Все больные были разделены на 2 условные группы: группа «РДС»: 71 новорожденный с РДС. Из них 24 новорожденных ребенка (22.22%) с респираторным дистресс-синдромом, неосложненным пневмонией (подгруппа «РДС без ВП»), 47 детей (43.52%), с наслоившейся инфекцией в виде пневмонии или сепсиса с очагом инфекции в легких (подгруппа «РДС + ВП»); группа «ВП»: 37 детей (34.26%) с врожденной пневмонией или врожденной генерализованной инфекцией с признаками пневмонии.
Распределение больных новорожденных по полу было следующим: 67 мальчиков (62.04%)) и 41 девочка (37.96%). 17 новорожденных (17.17% ) имели массу менее 1500 граммов, 50 - менее 2500 граммов (50.51%о), 28 - 2500 граммов и более (28.28%), 4 - свыше 4000 граммов (4.04%). Средний вес младенцев составил 2295±845 граммов. По степени недоношенности больные были распределены по следующим группам: новорожденные с гестационным возрастом 28-31 неделя - 30 детей (30.3%), 32-36 недели - 40 детей (40,4%), 37-42 недели - 29 детей (29.3%). Средний гестационный возраст больных составил 34.14±3.83 (28-42) недели. В результате естественных родов появилось на свет 62 больных ребенка (62.62%), путем кесарева сечения - 37 новорожденных (37.37%).
В группу сравнения случайным образом было отобрано 104 практически здоровых ребенка 1-х суток жизни, родившихся в условиях физиологического детского отделения Родильного дома № 8 г. Уфы в 2003-2005 гг. Мальчиков в этой группе оказалось 44 (42.3%), девочек 60 (57.7%). Вес новорожденных составил в среднем 3518±404 граммов, средний гестационный возраст - 39.18±1.03 недели (37-41). Соотношение новорожденных но способу рождения (естественные роды/кесарево сечение) составило 93/8 (92.08/7.92%). Группу сравнения была условно названа «контролем».
Этнический состав групп сравнения представлен в табл. 2.1. Можно заметить, что распределение индивидов по этническим іруппам практически не различалось между новорожденными с респираторным дистресс-синдромом (РДС) (х2=5.16, df=4, Р=0.27), врожденной пневмонией (ВП) (х2=3.37, df=4, Р=0.50) и контролем.
Результаты SSCP-анализа промоторной обчисти и 4-го экзона zenaSFTPB
Известно, что мутации, заключенные в промоторной области гена, моїут значительно влиять на уровень его экспрессии. Экзон 4 гена SFTPB некоторые исследователи считают «горячей точкой» мутаций [Lin Z. et al., 1998]. Для выявления возможных мутаций в гене SFTPB у больных с дыхательными расстройствами нами проведен SSCP-анализ промоторной 5 -области и 4-го экзона.
SSCP-анализ промоторной области гена SFTPB изучаемых образцов ДІIK больных дыхательными расстройствами и здоровых новорожденных выявил 3 различных варианта подвижности фрагментов однонитевой ДНК (дорожки D, Е, F), встречавшихся как в группе больных, так и в контроле (рис. 3.1).
Секвенирование образцов ДНК каждого из 3-х вариантов позволило деіектироваїь замену Л на С 18-ю нуклеотидами «выше» точки инициации транскрипции (приложение, рис.1). Последующий ПДРФ анализ четырех просеквенированных и шести случайно отобранных образцов ДНК позволил подтвердить наличие ранее описанной Lin Z. с соавт. (2000) замены: -18А С (рис. 3.2). F F Е D F D D SSCP-анализ 4-го экзона гена SFTPB также выявил встречающиеся в обеих группах варианты электрофоретической подвижности: дорожки А, В, С (рис.3.3). Поскольку по литературным данным в 4-м экзоне описан лишь один частый полиморфизм [Lin Z. et al., 2000], для его детекции была подобрана рестриктаза Bst4CI. ПДРФ-анализ 20-ти случайно выбранных образцов ДНК подтвердили наличие замены цитозина (С) на тимин (Т) в 1580 положении данного гена (рис.3.4). Результаты SSCP и ПДРФ анализов полное і ью согласуются.
В группе больных, кроме того, обнаружены 2 образца с изменениями электрофоретической подвижности иного характера. Один из вариантов в гетерозиготном, по-видимому, состоянии обнаружен и в контроле (рис.3.5).
Известно более 10 мутаций в 4-м экзоне гена SFTPB. Поскольку секвенирование обнаруженных нами фрагментов ДНК с измененной подвижностью провести не удалось, данные образцы были протестированы на наличие относительно частой мутации - замене С на GAA в 1549 положении. Однако обработка рестриктазой TaqI не выявила данной мутации ни в одном из случаев (рис.3.6). Все новорожденные с описанными изменениями выжили. Вероятно, обнаруженные нарушения в последовательности ДНК 4-го экзона гена SFTPB не являются фатальными и не связаны с полным отсутствием белка SP-B в альвеолярном пространстве.
Полиморфные сайты в промоторной области и 4-м экзоне гена SFTPB (-18А С и 1580 ОТ) были ранее описаны в литературе, однако упоминаний о возможности проведения SSCP-анализа для их детекции нами не обнаружено. Следует отметить, что при описанных нами условиях проведения SSCP-анализа возможно получить более четкую и воспроизводимую картину разделения однонитевых фрагментов ДНК в ПААГ, нежели после обработки соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Кроме того, для проведения SSCP-анализа не требуется применение дорогостоящих эндонуклеаз. Таким образом, метод SSCP можно рассматривать как альтернативу ПДРФ-анализу полиморфных локусов -18А С и 1580 С Т гена SFTPB.
Благодаря идентификации полиморфизмов промоторной области и 4-го экзона гена SFTPB, обнаруженных в ходе SSCP анализа, стало возможным исследование частот генотипов и аллелей по локусам -18А С и 1580ОТ ієна SFTPB в анализируемых группах.
При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -18А С достоверных различий между группой больных с ДР и контролем отмечено не было (Р=0.15, Р=0.31 (табл. 3.2, приложение, табл.1).
Наряду с этим, в общей группе больных с ДР, в группах РДС и ВП гетерозиготный генотип СА полиморфного локуса -18А С встречался наиболее часто, 47.62, 44.12 и 54.05% соответственно. Общее распределение генотипов в группах больных с РДС и ВП не отличалось от контроля (Р=0.45; Р=0.34 соответственно). В контроле генотипы АС и АА выявлялись одинаково часто: 42.31 и 43.27% случаев, тогда как среди больных с ДР и в группе с РДС наблюдалось небольшое увеличение доли аллеля С (42.86 и 42.65%) и геногипа СС (19.05 и 20.59%) за счет уменьшения доли геногипа АА (33.33 и 35.29%). Последнее было особенно заметно в іруппе больных с ВП (29.73%) по сравнению с контролем (43.27%) (табл.3.2, приложение, табл. 1).
Между подгруппами больных с разными формами РДС различий в частотах генотипов также не обнаружено (Р=0.98) (табл.3.2, приложение, табл. 4).
Исследование распределения частот аллелей и генотипов маркера 1580С Т гена SFTPB статистически значимых различий между группами больных с ДР и здоровых новорожденных не показало (Р=0.27 и Р=0.49 соответственно) (табл. 3.3, приложение, табл. 1).
