Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 10
2.1 Общие сведения о митозе 10
2.1.1 Фазы митоза и строение митотического аппарата 10
2.1.2 Микротрубочки 13
2.1.3 Общие сведения о кинетохоре
2.2 Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор 16
2.3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочки и кинетохора 16
2.4 Фосфорилирование кинетохорных белков киназой Aurora B играет ключевую роль в установлении биориентации хромосом 19
2.5 Комплекс NDC80 – важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки 23
3 Материалы и методы 28
3.1 Приготовление проточной камеры, очистка и силанизация покровных стекол 28
3.1.1 Изготовление многоразовых проточных камер 28
3.1.2 Подготовка покровных стекол
3.2 Приготовление микротрубочек, стабилизированных таксолом и белков NDC80. 32
3.3 Микроскопия полного внутреннего отражения 33
3.4 Анализ данных микроскопии
3.4.1 Определение кривых связывания комплексов NDC80 и МТ с помощью TIRF микроскопии. 41
3.4.2 Анализ кооперативности NDC80-MT взаимодействия с использованием метода восстановления флюоресценции после выжигания (FRAP). 46
3.5 Теоретические подходы к оценке энергии связывания с МТ 46
4 Результаты 49
4.1 Описание математической модели сайта связывания микротрубочки с кинетохора 49
4.2 Математическая модель сайта связывания микротрубочки
4.2.1 Фракция МТ-связанных комплексов определяет время закрепления МТ к сайту. 53
4.2.2 Физиологическая стабильность закрепления МТ за кинетохор обеспечивается крайне короткоживущими взаимодействиями между комплексами и МТ. 57
4.2.3 Кооперативность молекулярных взаимодействий сильно увеличивает влияние молекулярных параметров на стабильность закрепления КМТ. 59
4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro 65
4.3.1 Взаимодействие NDC80 и MT определяет полное число фосфомиметических замен, а не их положение в хвосте Hec1 65
4.3.2 Увеличение числа фосфомиметических мутаций в хвосте Hec1 приводит к градуальному росту коэффициента диффузии комплекса NDC80 по МТ и уменьшению времени взаимодействия с МТ. 70
4.3.3 Увеличение числа фосфомиметических замен в хвосте Hec1 градуально уменьшает энергию взаимодействия между единичными молекулами NDC80 и МТ. 74
4.3.4 Взаимодействие NDC80-NDC80 слабое по сравнению с взаимодействие NDC80-MT. 80
4.3.5 Кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется при фосфорилировании хвоста Hec1. 89
4.4 Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80. 92
4.4.1 Клетки с мутантным комплексом NDC80, содержащим одну
фосфомиметическая мутацию в хвосте Hec1 комплекса NDC80, имеют нормальный кинетохорный пучок. 92
4.4.2 Модель полного кинетохора со множеством сайтов закрепления. 93
4.4.3 Алгоритм симуляции 95
4.4.4 Анализ чувствительности сайтовой модели кинетохора 97
4.5 Модель кинетохора, содержащая сайты связывания КМТ не может описать наблюдаемые изменения в регуляции кинетохор-МТ взаимодействия при фосфорилировании. 101
4.6 Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов NDC80 с МТ не ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных. 1 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
6 Выводы 109
7 Список сокращений и условных обозначений 110
8 Список литературы 111
- Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор
- Подготовка покровных стекол
- Математическая модель сайта связывания микротрубочки
- Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80.
Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор
Ошибки в процессе деления клетки приводят к хромосомной нестабильности, что является серьезной опасностью для здоровья человека (Thompson et al., 2010). Ошибки в процессе митоза могут привести к анеуплоидии – ситуации, когда одна или обе дочерние клетки содержат неправильное число хромосом. В настоящий момент хорошо известно, что хромосомная нестабильность часто обуславливается нарушениями в динамике взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами. Даже низкие дозы веществ, которые влияют на взаимодействие кинетохоров и микротрубочек, приводят к ошибкам в процессе распределения хромосом по дочерним клеткам (Bakhoum et al., 2009). В митозе, МТ присоединяются и отсоединются от кинетохоров со средним временем закрепления 3 -4 мин в прометафазе (Bakhoum et al., 2009; Cimini et al., 2006; Zhai et al., 1995). По мере того как число МТ на кинетохорах возрастает, закрепления МТ к кинетохорам становятся более стабильными, и их среднее время закрепления увеличивается до 7 – 10 мин в метафазе (Cimini et al., 2006; DeLuca et al., 2006). Природа связей, которые обеспечивают такое динамическое закрепление МТ и кинетохора остается слабо исследованной.
Предыдущие теоретические работы моделировали кинетохор как совокупность отдельных сайтов связывания МТ, каждый из которых содержит МТ-связывающие комплексы, организованные в структуру цилиндра (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002; Shtylla and Keener, 2010) или кольца (Armond and Turner, 2010; Efremov et al., 2007; Liu and Onuchic, 2006; Molodtsov et al., 2005) (рис. 2.4). Эти модели привели к значительному пониманию того, как хромосомы могут перемещаться вместе с разбирающимся концом деполимеризующейся МТ, а также как сила, создаваемая кинетохорными МТ, может передаваться хромосоме. Но все эти модели не рассматривали аспект стабильности закрепления МТ к кинетохору. Классический МТ-связывающий «рукав Хилла» представляет собой структуру, состоящую из 65 комплексов, 90-95% из которых находятся в состоянии связанном с МТ в каждый момент времени в отсутствие внешней силы (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002). Таким образом, рукав Хилла, и сопрягающее устройство в виде кольца, состоящее из 15-20 МТ-связывающих комплексов (Efremov et al., 2007), будут формировать очень стабильные закрепления, которые, возможно, будут открепляться только если на МТ будет действовать сила, направленная от кинетохора и превышающая 5-10 пН. Структурные исследования кинетохоров в различных организмах показали, что, наиболее вероятно, интерфейс кинетохор-МТ состоит из многочисленных фибрилл (Dong et al., 2007; McIntosh et al., 2013), а не рукавов. В последнее время было разработано несколько теоретических моделей кинетохоров состоящих из независимых МТ-саязывающих белков (Civelekoglu-Scholey et al., 2013; McIntosh et al., 2008), однако, в этих моделях не исследовался систематически вопрос о том, какие структурные и молекулярные параметры обеспечивают и регулируют стабильность закрепления МТ и кинетохора.
Наиболее изученным простейшим кинетохором в клетках эукариот является кинетохор почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Кинетохоры в данных организмах образуют закрепление с единственной микротрубочкой, и белковая композиция и структурная организация данных кинетохоров хорошо изучена средствами флюоресцентной микроскопии высокого разрешения (Joglekar et al., 2009) и электронной микроскопии (Gonen et al., 2012). В клетках позвоночных число кинетохорным микротрубочек растет в течение прометафазы митоза, и к моменту наступления метафазы кинетохоры содержат примерно 25-30 кинетохорных микротрубочек (McDonald et al., 1992; McEwen et al., 1997). Сайт взаимодейтвия с единичной микротрубочкой на кинетохорах позвоночных содержит во многом похожие белки, что и кинетохор почкующихся дрожжей (Joglekar et al., 2008), поэтому довольно распространено представление о том, что кинетохоры позвоночных организмов состоят из отдельных сайтов связывания с микротрубочкой, где каждый такой сайт аналогичен по строению и по белковому составу близок к простейшему кинетохору почкующихся дрожжей (Zinkowski et al., 1991). Однако важно заметить, что на данный момент анализ кинетохоров позвоночных с помощью электронной микроскопии не обнаружил повторяющихся структурных элементов, которые могли бы быть такими сайтами взаимодействия с микротрубочками (Dong et al., 2007; McIntosh et al., 2013). Данный факт оставляет открытой возможность того, что кинетохоры, связывающие большое количество КМТ, не содержат структурной организации, а белки, связывающие МТ, распределены по поверхности кинетохора случайным образом (модель молекулярного «газона»). В соответствии с распространенным представлением о субъединичном строении кинетохоров высших эукариот, многие теоретические модели кинетохора Рис. 2.4. Теоретические модели взаимодействия микротрубочки и кинетохора. продполагают, что кинетохорные микротрубочки могут взаимодействовать с определенным набором специализированных белков, которые объединяются в один сайт. Данный сайт часто представляется как рукав (Hill, 1985), или как кольцо, с которым взаимодействует микротрубочка (Efremov et al., 2007). Ключевым свойством таких моделей является то, что одна микротрубочка может взаимодействовать только с кинетохорными белками, принадлежащими одному сайту (Joglekar and Hunt, 2002), и кинетохорные белки, принадлежищие различным сайтам, не могут взаимодействовать одновременно с одной микротрубочкой.
Динамические взаимодействия между микротрубочками (МТ) и кинетохорами крайне важны для аккуратного деления клетки, но немногое известно о биофизике этих взаимодействий (Grishchuk et al., 2012; Joglekar et al., 2010). Были предложены различные модели, объясняющие закрепления микротрубочки и кинетохоров. Модели, описывающие закрепления кинетохор-микротрубочка, можно разделить на два класса. Одни модели описывают взаимодействия кинетохора и микротрубочки посредством некоторых структурных образований, таких как кольца или рукава (Davis et al., 2007). Другой класс моделей описывает кинетохор-микротрубочковое взаимодействие через множество независимых соединений (McIntosh et al., 2008; Zaytsev et al., 2013; Civelekoglu-Scholey et al., 2013; Keener and Shtylla et al., 2014). Такая различная организация кинетохора приводит к различным термодинамическим и кинетическим требованиям к индивидуальным кинетохорным белкам, связывающимся с микротрубочками. На данном этапе сложно осуществить предпочтение одной модели другой, потому что немногое известно о количественных характеристиках взаимодействия с микротрубочками индивидуальных кинетохорных белков. По этой причине, крайне актуальной задачей является полное биофизическое исследование молекулярного взаимодействия между ключевыми кинетохорными белками и микротрубочками. Так как стабильность закрепления кинетохорных микротрубочек изменяется в процессе митоза, это исследование должно также затрагивать и молекулярные механизмы регуляции взаимодействий между кинетохорными белками и микротрубочками.
Подготовка покровных стекол
Модель пространственного разведения кинетохоров и области активности киназы Aurora B. Небиориентированные конфигурации хромосом не обладают достаточным натяжением и находятся в области высокой активности киназы Aurora B (схема сверху), что приводит к фосфорилированию кинетохорных белков и дестабилизации закреплений с микротрубочками. После случайного возникновения биориентированного состояния, кинетохоры растаскиваются под действием натяжения со стороны микротрубочек в область низкой активности киназы Aurora B (схема внизу), что приводик к дефосфорилированию кинетохорных белков и стабилизации полученного биориентированного состояния. связывающихся с микротрубочками соответствует слабой аффинности взаимодействия с микротрубочкой (Welburn et al., 2010). Таким образом, закрепления кинетохорных микротрубочек в небиориентированной конфигурации в клетках нестабильны. Процесс закрепления и открепления кинетохорных микротрубочек происходит по принципу проб и ошибок до тех пор, пока не образуется биориентированная конфигурация, при которой каждый из сестринских кинетохоров будет иметь закрепления с микротрубочками из противоположных полюсов. Такая конфигурация соответствует максимальному натяжению между кинетохорами, что приводит к увеличению межкинетохорного расстояния и пространственному разведению кинетохоров из области высокой активности киназы Aurora B в область ее низкой активности. В установленной биориентированной конфигурации кинетохорные белки переходят в дефосфорилированное состояние благодаря действию по крайней мере одной белковой фосфатазы PP1, присутствующей в цитоплазме. Дефософрилирование кинетохорных белков связывающихся с микротрубочкой приводит к стабилизации закреплений микротрубочек и кинетохоров на биориентированных хромосомах. Такая выборочная стабилизация биориентированных конфигураций и дестабилизация небиориентированных конфигураций приводит к тому, что в процессе метафазы биориентированные конфигурации начинают преобладать и к моменту наступления анафазы все хромосомы, за редкими исключениями, переходят в биориентированное состояние.
Комплекс NDC80 – важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки Комплекс NDC80 является важнейшим кинетохорным белком, связывающимся с микротрубочками в клетках эукариот (Cheseeman et al., 2006; Tooley and Stukenberg et al., 2011). В литературе приводятся оценки, что на кинетохоре для взаимодействия с одной микротрубочкой имеется от 6 до 22 комплексов NDC80 (Johnson et al., 2010; Lawrimore et Рис. 2.7. Схема комплекса NDC80 и его N-концевого участка белка Hec1 с указанием сайтов фосфорилирования Aurora B киназой. al., 2011; Aravamudhan et al., 2013). Однако, детали структурной организации этих комплексов на кинетохоре и то, как эта организация изменяется в процессе митоза, на данный момент остаются неизвестными.
Комплекс NDC80 состоит из двух гетеродимеров: Spc24-Spc25 и Hec1-Nuf2 (Ciferri et al., 2008) (рис 2.7). Домен связывания с микротрубочкой комплекса NDC80 представлен глобулярными доменами гетородимера Hec1-Nuf2, содержащими консервативный Calponin Homology (CH) домен, который так же присутствует и в других белках, взаимодействующих с микротрубочкой; например, белок EB1. Белок Hec1 комплекса NDC80 также содержит бесструктурный полепептидный участок длинной 80 аминокислот на своем N-конце. Известно, что данный участок белка Hec1 необходим для связывания комплекса NDC80 с микротрубочками in vitro (Cheseeman et al., 2006; Wei et al., 2007) и для установления закреплений кинетохор-микротрубочка in vivo (Guimaraes et al., 2008; Miller et al., 2008).
Так же известно, что на данном 80-ти аминокислотном участке белка Hec1 расположено 9 аминокислот, которые могут фосфорилироваться киназой Aurora B (DeLuca et al., 2006). На начальных стадиях митоза данные аминокислоты белка Hec1 находятся в фосфорилированном состоянии, но в ходе митоза степень фосфорилирования белка Hec1 уменьшается до состояния, при котором белок Hec1 содержит 0-1 фосфатную группу (DeLuca et al., 2011). Работы in vitro на очищенном рекомбинантном комплексе NDC80, содержащем мутации на аспарагиновую кислоту, имитирующие отрицательный заряд фосфатных групп (фосфо-миметические мутации), показали, что внесение таких мутаций во все аминокислоты, расположенные в сайтах фосфорилирования, уменьшает аффинность комплекса NDC80 к микротрубочкам более чем в 10 раз (Umbreit et al., 2012). Однако, эффект внесения промежуточного числа фосфо-миметических мутаций на аффинность комплекса NDC80 к микротрубочке остается неизвестным. Также неизвестен и характер зависимости характеристик взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой от числа фосфо-миметических мутаций – будет ли эффект изменяться градуально, или имеется скачкообразное изменение аффиности при достижении некоторого порогового числа фосфорилирований (Salazar and Hfer, 2009).
Раннее, в литературе было предложено несколько различных моделей того, как взаимодействие комплекса NDC80 с микротрубочкой регулируется фосфорилированием. В одной из моделей, фосфорилирование комплекса NDC80 напрямую уменьшает сродство комплекса NDC80 к микротрубочке, которое частично опосредовано зарядовым взаимодействием между положительно заряженным 80-ти аминокислотным N-концевым участком белка Hec1 и отрицательно заряженными С-концевыми участками белков тубулинов, из которых состоит микротрубочка (Guimaraes et al., 2008; Miller et al., 2008).
Другие работы предлагают модель, в которой фосфорилирование комплекса NDC80 регулирует как сродство комплекса к микротрубочке, так и способность комплекса NDC80 олигомеризоваться на поверхности микротрубочке в зависимости от того, в какой части 80-ти аминокислоткого участка белка Hec1 расположены фосфатные группы (Alushin et al., 2010; Alushin et al., 2012). В данной модели, в концевом участке белка Hec1 выделяются две функциональные зоны – зона 1, которая содержит аминокислоты с 44-й по 66-ю, и зона 2, которая содержит аминокислоты с 4-й по 15-ю. Фосфорилирование аминокислот, расположенных в зоне 1, приводит к уменьшению аффинности комплекса NDC80 к микротрубочке, в то время как фосфорилирование аминокислот в зоне 2 приводит к декластеризации комплексов NDC80 на поверхности микротрубочки (рис. 2.8).
Математическая модель сайта связывания микротрубочки
Вычисления, описанные выше, были проведены для случая, когда взаимодействие отдельных комплексов и МТ было не кооперативным (параметр кооперативности = 1). Далее было исследовано, как введение кооперативности, т.е. усиление взаимодействия комплексов и МТ в присутствии уже связанных комплексов, влияет на среднее время закрепления КМТ. На рис. 4.5 приведен график зависимости времени закрепления КМТ для величин параметра кооперативности от 1 до 8. Эти величины соответствуют коэффициентам Хилла 1 и 2.5, соответственно. Видно, что среднее время закрепления КМТ 3-10 мин может быть получено для всех рассмотренных значений параметра кооперативности, хотя большие значение параметра кооперативности требуют больших значений константы диссоциации KD, которая возрастает нелинейно при увеличении .
В работе Zaytsev et al., 2013, из анализа электронно-микроскопических изображений, был сделан вывод, что параметр кооперативности очень велик. Из рис. 4.6 видно, что для больших значений параметра кооперативности, метафазная стабильность КМТ достигается в модели только в том случае, когда взаимодействия отдельных комплексов и МТ крайне нестабильны. Например, для = 40 (коэффициент Хилла 8.7) модель предсказывает, что константа диссоциации должна достигать 4,000. Такая слабая аффинность означает, что молекулярные взаимодействия должны быть крайне короткоживущими.
На рис. 4.7 показано, что когда параметр кооперативности изменяется в диапазоне от 1 до 400, это приводит к изменению в среднем времени взаимодействия комплекса и МТ от долей секунды до долей миллисекунды. В то же время, число комплексов, в среднем связанное с МТ в стационарном состоянии, увеличивается с увеличением . Это увеличение очень резкое в диапазоне от 1 до 20, но зависимость становится более пологой для = 50 – 400, при которых среднее число связанных комплексов на МТ составляло примерно 11. Для ещё больших значений это число стремится к 12 - полному числу комплексов на сайт. Рис. 4.5. Зависимость времени закрепления микротрубочки за сайт связывания на кинетохоре от константы диссоциации и параметра кооперативности. Области с вертикальной и горизонтальной штриховкой показывают диапазоны значений параметров, при которых времена взаимодействия микротрубочки и сайта связывания меньше минуты или более 103 минут, соответственно. Рис. 4.6. Значения константы диссоциации комплексов, взаимодействующих с микротрубочкой, при которых достигается физиологическое время закрепления КМТ (10 мин), как функция фактора кооперативности. Рис. 4.7. Время взаимодействия отдельного белка с микротрубочкой (синий, левая ось) и среднее число связанных с МТ белков (красный, правая ось), при которых достигается физиологическое время закрепления КМТ (10 мин) как функция фактора кооперативности. Важно обратить внимание, что кооперативность взаимодействия комплексов и МТ очень сильно усиливает описанные выше эффекты для случая некооперативного взаимодействия. С увеличением , различие между молекулярным масштабом по времени и временным масштабом взаимодействия МТ с кинетохором становится ещё больше (рис. 4.8). Когда связывание комплексов и МТ сильно кооперативно, очень небольшие изменения в молекулярных параметрах существенно усиливаются и очень сильно влияют на стабильность закрепления КМТ. Например, для = 100 (коэффициет Хилла 7.8), физиологическая стабилизация закрепления КМТ по мере прогресса митоза требует увеличения только на 5%. Такая высокая чувствительность ко входным параметрам может привести к существенным нестабильностям из-за случайных флуктуаций молекулярных параметров или в случае небольших изменений в числе комплексов на один сайт.
С помощью стохастической математической модели впервые было систематически проанализировано, как молекулярные характеристики кинетохорных МТ-связывающих комплексов влияют на стабильность закрепления МТ к кинетохору. Эта зависимость может быть измерена экспериментально. Организация МТ-связывающего сайта, рассмотренная в модели, является интуитивно простой и естественной. Было продемонстрировано, что основные результаты модели остаются в силе (или усиливаются) в широком диапазоне значений параметров, особенно при изменении числа комплексов на кинетохор. Хотя физиологическая стабильность закрепления может быть достигнута для любых наперед заданных значений скоростей ассоциации и диссоциаций, диапазон соответствующих величин KD является узким, что означает, что время молекулярных взаимодействий комплексов и МТ должно быть на 4 порядка короче, чем среднее время взаимодействия МТ и кинетохора. Таким образом, молекулярные взаимодействия крайне короткоживущие, и каждое событие связывание длится только 30 – 50 мс (рис. 4.8). Когда МТ-связывающий сайт содержит большее число комплексов или кооперативность велика, небольшие изменения в молекулярных константах приводят к существенным эффектам в стабильности МТ. Рис. 4.8. Полученная в модели зависимость времени закрепления микротрубочки и кинетохора от времени закрепления отдельного комплекса за микротрубочку (1/koff). Зависимость была посчитана для трех значений фактора кооперативности. Видно, что при увеличении фактора кооперативности, времена молекулярных взаимодействий, при которых достигаются физиологические значения стабильности КМТ, резко уменьшаются. 4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro
Для исследования влияния фосфорилирования NDC80 на взаимодействие с МТ был использован метод одно-молекулярной микроскопии in vitro на флюоресцентном TIRF микроскопе. Для этих целей использовались «Bonsai» NDC80-GFP комплексы с укороченным участоком супер-спирали, но с нативным МТ-связывающий доменом, содержащим различное число фосфомиметических мутаций в хвостовом домене белка Hec1. Введенные таким образом замены на апарагиновую кислоту были расположены в местах, предсказанных как сайты фосфорилирования киназой Aurora B (рис. 4.9).
Сначала был исследован вопрос о влиянии определенного положения сайта фосфорилирования на взаимодейтсвия NDC80-MT. Было проанализировано три мутантных комплекса NDC80, которые отличались только положением одной фосфо-миметической мутации в хвосте Hec1, и два мутанта с четырьмя фосфо-миметическими мутациями в различных комбинациях (Рис 4.9, в рамке). События связывания этих единичных комплексов с закрепленной на покровном стекле микротрубочкой, их диффузия на поверхности МТ и их диссоциации с поверхности МТ, регистрировались с высоким временным разрешением в буфере BRB80, который по ионной силе близок к физиологической внутриклеточной ионной силе. Анализ яркости связанных комплексов показал, что более 95% зарегистрированных событий связывания соответствуют яркости единичного GFP комплекса, что означает, что комплексы NDC80 не олигомеризуются и взаимодействуют с МТ как отдельные молекулы (рис. 3.5). Полуавтоматический анализ полученных кимограмм был сделан с помощью самостоятельно разработанной программы для построения зависимости среднеквадратичного смещения в зависимости от времени (рис 4.10).
Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80.
Далее, было проанализировано, как сайтовая модель кинетохора описывает наблюдаемое в клетках изменение толщины кинетохорного пучка в ответ на фосфорилирование комплекса NDC80. Эти расчеты были проведены с теми же молекулярными параметрами, что и расчеты, описанные в предущем параграфе, за исключением скоростей диссоциации, значения которых брались из результатов in vitro анализа комплексов NDC80, содержащих различное число фосфомиметических мутаций. На рис. 4.29 приведен результат такого анализа, из которого видно, что сайтовая модель крайне чувствительна к фосфорилированию NDC80: в расчетах кинетохора, содержащего комплексы без фосфомиметических мутаций (9A или noD), микротрубочки занимали почти все свободные сайты.
Однако, КМТ практически полностью отсутствовали при моделировании кинетохора, содержащего комплексы с более чем одной фосфомиметической мутацией. Таким образом, число КМТ в модели уменьшалось с увеличением числа фосфомиметических мутаций значительно более резко, чем было измерено в клетках. Для того, чтобы попытаться добиться лучшего соответствия теоретических и экспериментальных данных, были систематически проварьированы ключевые параметры модели, но эти изменения не улучшили соответствие между теорией и экспериментом. Например, ответ сайтовой модели на фосфорилирование оставался крайне резким при варьировании числа комплексов NDC80 в сайте, или в модели, где положение сайтов связывания на кинетохоре было выбрано случайным образом, или при варьировании фактора кооперативности. Далее, было предположено, что скорости диссоциации для комплексов NDC80 с различным числом фосфомиметических мутаций в клетках могут отличаться от соответствующих скоростей, измеренных in vitro. Такое различие может возникнуть из-за наличия кинетохорного натяжения (Akiyoshi et al., 2010), которое изменяется с изменением размера кинетохорного пучка, что наблюдается в экспериментах с клетками. Однако, когда константа диссоциации комплексов NDC80 была поправлена с учетом этого эффекта, ответ модели на фосфорилирование был все ещё более резким, чем в эксперименте.
Дополнительно, были рассмотрены альтернативные варианты калибровки сайтовой модели, основанный на комплексе 2D NDC80 вместо 1D NDC80, и использующий параметр kon, оцененный из известных размеров кинетохора и плотности комплексов NDC80. С этими модификациями фосфорегулирование кинетохорного пучка в сайтовой модели продолжало иметь резкую зависимость, демонстрируя, что детали калибровки не влияют на данное поведение модели.
Основываясь на этих результатах, было заключено, что резкий ответ сайтовой модели на фосфорилирование комплексов NDC80 является внутренним свойством данной модели и не может быть изменен через параметры модели или способ калибровки. Природа такого поведения модели заключается в способе устройства кинетохора, содержащего независимые «кластеры» из комплексов NDC80, образующих сайты связывания КМТ. Это проиллюстрировано на рисунке 4.30, где приведены относительные изменения среднего времени взаимодействия комплексов NDC80 с различным числом фосфомиметических мутаций, измеренные in vitro, и относительные изменения длительности кинетохор-МТ взаимодействия, предсказанные для соответствующих кинетохоров. Как было показано выше, внесение каждой фосфомиметической мутации уменьшает время взаимодействия комплекса NDC80 и МТ примерно в 1.7 раз. Модель кинетохора, основанная на существовании выделенных сайтов связывания, существенно усиливает небольшие изменения в константах взаимодействия отдельных NDC80 комплексов. Такое умножение является прямым следствием того, что микротрубочки закрепляются в каждом сайте через множество отдельных комплексов NDC80 и факта, что комплексы в пределах одного сайта ограничены во взаимодействии только с одной КМТ.
Относительное время взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой (красные точки) и относительное время взаимодействия микротрубочек с кинетохором (синие точки). Данные нормированы на значение времени для 1D NDC80.
Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов NDC80 с МТ не ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных.
Альтернативная модель кинетохора (модель молекулярного газона) не содержит отдельных сайтов связывания с МТ. В этой модели то же самое полное число комплексов NDC80, что и в сайтовой модели, было распределено по поверхности кинетохора случайным образом. Взаимодействия между комплексами NDC80 и МТ было ограничено только расстоянием от места закрепления комплекса NDC80 на кинетохоре до МТ, а не принадлежностью комплекса NDC80 к тому или иному сайту. Таким образом, в данной модели во время симуляции один и тот же комплекс NDC80 мог случайным образом связываться с различными МТ. В противоположность сайтовой модели, это привело к тому, что приходящие на кинетохор МТ конкурировали за имеющиеся комплексы NDC80, взаимодействуя с любым доступным комплексом NDC80. Проведенные расчеты показали, что после калибровки модель кинетохора в виде молекулярного газона сохранила все положительные черты сайтовой модели с комплексом 1D NDC80. Модель кинетохора в виде молекулярного газона предсказывала формирование кинетохорного пучка за 15-20 мин, что соответствует физиологическому значению. Та же модель хорошо описывала распределение числа КМТ в стационарном состоянии и скорость их обмена. Однако, в отличие от сайтовой модели, модель кинетохора в виде молекулярного газона предсказывала изменения стабильности закрепления КМТ, хорошо согласующиеся с изменениями во времени молекулярного взаимодействия отдельных NDC80 комплексов (рис 4.31).
