Введение к работе
Актуальность проблемы
Белки в природе, как правило, функционируют в составе тех или иных надмолекулярных ансамблей, которые являются основой молекулярной организации биологических систем. Надмолекулярные структуры играют важную роль во многих биохимических процессах (фолдинг белков, транспорт, биосинтез). Регуляция каталитической активности и стабильности ферментов in vivo часто осуществляется именно посредством образования надмолекулярных ансамблей, включающих вещества различной природы, в частности, полиэлектролиты.
Изучение свойств полиэлектролит-белковых комплексов (ПБК) служит для понимания функциональной роли эндогенных полиэлектролитов (ПЭ) в разных метаболических процессах. ПБК, содержащие синтетические ПЭ, исследуются в качестве модельных систем для изучения взаимодействия белков с клеточными стенками, мембранами, с внутриклеточными ДНК и РНК, а также в системе антиген- антитело. В ряде случаев, исследование ПБК помогает понять механизм катализа, особенно сложный для отдельных ферментов. Преимущества такого моделирования заключаются в том, что оно позволяет исследовать физико-химические свойства комплекса в зависимости от длины цепи ПЭ, знака и плотности зарядов на ПЭ и состава среды. Кроме того, такие системы удобны для исследования, поскольку в определенных условиях допускают применение оптических методов.
Сродство ферментов к полизаряженным компонентам клетки независимо от их агрегатного состояния зависит от присутствия дву- и одновалентных ионов, находящихся в составе любого компартмента живой клетки. И хотя ионы дву- и одновалентных солей могут влиять как на сродство ферментов к полиэлектролитам и величину энергии активации катализа, так и на собственную конформацию ПЭ и соответственно на его персистентную длину, однако такие исследования практически отсутствуют (особенно это касается влияния двувалентных анионов). Это связано с тем, что в настоящее время разработана теория только для полимерных цепей в растворе, в то время как для ПБК описание их поведения находится только на уровне полуэмпирических закономерностей. Настоящая работа посвящена изучению влияния солевого состава среды на динамику образования и функциональные особенности ферментов в комплексе с ПЭ. Изучение динамики образования таких комплексов может позволить решать задачи, направленные на управление биологическими процессами в живых организмах.
При изучении взаимодействия белков как c cинтетичеcкими, так и c эндогенными
ПЭ обнаружены значительные изменения феpментативной активности, а в pяде cлучаев
наблюдали изменения и cтpуктуpныx xаpактеpиcтик белков после связывания их c ПЭ.
Разрушающее действие отдельных ПЭ на белки особенно важно учитывать при
использовании коллоидных частиц в биологических жидкостях при разработке микроконтейнеров для адресной доставки различных лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для этой цели разработаны технологии получения полиэлектролитных микрокапсул с последовательным наслоением ПЭ на твердое ядро с включенным в него биологически активным веществом. Применение таких микрокапсул с заряженной полиэлектролитной оболочкой, а также коллоидных частиц различных видов, в частности фосфолипидных везикул, в качестве средства транспортировки лекарств требует тщательной проверки их влияния на функциональные свойства белков, содержащихся в биологических жидкостях. И если изучение ферментов, инкапсулированных в такие микроконтейнеры, широко ведется, то исследования состояния белков в суспензии с заряженными коллоидными частицами практически отсутствуют. В настоящей работе было исследовано влияние разных типов заряженных коллоидных частиц на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.
Цель исследования
Изучить структурно-функциональные особенности белков в комплексе с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами и влияние биологически значимых ионов на состояние комплекса.
Задачи работы
-
Исследовать влияние полиэлектролитов на флуоресцентные свойства производных индола.
-
Определить кинетические характеристики изменения флуоресценции белков - лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина, при образовании комплекса с полиэлектролитом и сопоставить их с параметрами доступности остатков триптофана полиэлектролиту.
-
Исследовать влияние различных ионных форм фосфата на устойчивость лактатдегидрогеназы к тепловой денатурации и к разрушающему действию полиэлектролита.
-
Изучить влияние ионов сульфата на динамику разрушения лактатдегидрогеназы полиэлектролитом, измеренное различными методами, дающими представление о разрушении разных элементов структуры белка.
-
Исследовать влияние двух типов заряженных коллоидных частиц - полиэлектролитных микрокапсул и липосом на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.
Научная новизна работы
Показано, что скорость тушения флуоресценции белка при взаимодействии с ПЭ зависит не только от доступности его индольных аминокислотных остатков растворителю, но и от размеров каналов, в которые они погружены. Впервые показано, что из двух форм фосфата в нейтральной области рН только двувалентная форма стабилизирует лактатдегидрогеназу при разрушении полиэлектролитом и при тепловой денатурации. Это достигается взаимодействием фосфата с «кислой» конформацией белка в межсубъединичном анион-связывающем центре. Были определены временные характеристики процесса разрушения лактатдегидрогеназы полиэлектролитом, измеренные разными методами, которые дают представление о скоростях разрушения разных элементов структуры белка. Впервые показано, что полиэлектролитные микрокапсулы с заряженной оболочкой, суспендированные в растворы белков, сорбируют их на своей поверхности, но не изменяют ни структуру, ни функцию белков. Это дает возможность использовать их в перспективе в качестве средства адресной доставки биологически активных веществ.
Практическая значимость
Результаты теоретического и экспериментального анализа сруктурно-
функциональных особенностей белков в комплексе с полиэлектролитами могут быть использованы не только для выяснения функциональной роли эндогенных полиэлектролитов, но и определить механизм катализа, который в ряде случаев оказывается достаточно сложным для отдельных ферментов.
Pезультаты исследования cpодcтва белков к полиэлектpолитным микрокапсулам (ПМК) показали, что микрокапсулы, формируемые c заданной конфигуpацией оболочки, могут быть эффективно использованы в пpоцедуpе выделения и очистки белков в качестве cоpбента, иммобилизирующего белки, не нарушая их cтpуктуpу и функции. Показанная в pаботе «нейтpальность» полиэлектролитных микрокапсул по отношению к белку, наxодящемуcя в pаcтвоpе, позволяет избежать нежелательных побочных эффектов при использовании ПМК в качестве cpедcтва адpеcной доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на отечественных и международных
конференциях: «Ломоносов 2009» (Москва, 2009), «Экспериментальная и теоретическая
биофизика 2009» (Пущино, 2009), «XII Молодежная конференция по органической
химии» (Суздаль, 2009), «Биология - наука 21 века (Пущино, 2010), «Ломоносов 2010»
(Москва, 2010), «XV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и
конформациям молекул» (Петрозаводск, 2010), «Математика. Компьютер. Образование»
(Пущино, 2010), «Биология - наука 21 века (Пущино, 2011), V Российский симпозиум
«Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2011; Пущино, 2011).
По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4
статьи.
Структура и объем диссертации
