Введение к работе
1. Актуальность проблоны. Изучение этиопатогенетической роли вирусов при злокачественных новообразованиях человека и животных является одним иэ главных направлений в современней экспериментальной онкологии. Имеющиеся данные относительно семейства герпес-вирусов свидетельствуют о том, что некоторые его члены способны трансформировать клетки in vitro и индуцировать образование опухолей у лабораторных животных. Одним из таких вирусов является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), который ассоциирован с широким спектром патологических процессов у человека, включая и злокачественные (лимфо-ма Беркитта, к ди'ференцированный рак носоглотки и др.).
В инфицированных клетках вирус способен устанавливать как продуктивную (литическую) инфекцию с освобождением зрелых вирусных частиц и гибелью инфицированных клеток, так и непродуктивную (латентную) инфекцию, когда экспрессируется только часть вирусного генома. Обнаружение того факта, что в трансформированных клетка.. ВЭБ находится в латентном состоянии, предопределило направленность современных работ, в центре которых находится изучение функциональной роли генов латентной инфекции ВЭБ и их продуктов.
Одними из последних открытых генов латентной инфекции ВЭБ является гены, кодирующие латентные мембранные белки - белки терминального повтора {ТР1 и ТР2), имеющие сходную молекулярно-генети-чесхую организацию и отличающиеся лишь по первому N-концевому эк-эону, который входит в состав гена ТР1 и отсутствует у ТР2. основная гипотеза, существующая на сегодня, предполагает, что в латент-но-инфицированных ВЭБ В-лимфоцитах ТР1 является ключевым звеном, обеспечивающим сохранение латентного статуса инфекции и, соответственно, препятствующим активации литической инфекции ВЭБ.
Ракономерности экспрессии ТР в клетках недифференцированного рака носоглотки (нРНГ) практически не изучены, в частности, вследствие низкого уровня экспрессии этих белков, а также отсутствия соответствующих поли- и моноклональных антител. Тем не менее, существующие на сегодня данные позволяют предположить, что ТР мо->ет играть важную роль в патогенезе нРНГ. Так, транскрипты ТР1 в опухоле-ых клетках нРНГ определялись практически в 100% случаев, причем не только-в первичнс "J опухоли, нл и в метастазах. Кроме того, по предварительным данным;' антитела к ТР выявлялись только и
сыворотках крови больных нРНГ, но не в сыворотках крови больных другими ВЭБ-ассоциированными заболеваниями.
Такая специфичность иммунного ответа к ТР представляет большой интерес и с практической точки зрения, поскольку диагностика и дифференциальная диагностика опухолей носоглотки затруднена (в частности, вследствие сложности визуального осмотра исследуемой области, взятия биопсийного материала и его морфологической трактовки). Между тем, выделение различных гистологических форм РНГ является крайне актуальной задачей, поскольку это связано с их различным клиническим течением и прогнозом. 2. Цели н задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в разработке подходов к изучению экспрессии ТР в клетках недифференцированного рака носоглотки, а также анализе клинической значимости гуморального иммунного ответа к ТР у этих больных.
В ходе выполнения исследований предполагалось решить следующие задачи:
-
Получить рекомбииантные белки ТР1 в прокариотической системе. Отработать оптимальный способ экспрессии, выделения и очистки рекомбинантных белков.
-
Собрать сыворотки крови и биопсийный материал от больных опухолями верхних дыхательных и пищеварительных путей. Используя тест по определению уровня антител к белкам литической инфекции ВЭБ, выделить группу сольных нРНГ с последующим морфологическим подтверждением диагноза.
3} Провести скрининг сывороток крови больных нРНГ на наличие антител к ТР ВЭБ; исследовать динамику уровня этих антител,в процессе лечения.
-
Проанализировать наличие зависимости между характером гуморального ответа к ТР и клиническими характеристиками опухолевого процесса у больных нРНГ.
-
Провести предварительный иммунологический анализ , мблекулы ТР1: а) выявить участки молекулы белка, принимающие участие в формировании антигенных детерминант; б) оценить направленность гуморального ответа больных нРНГ к конкретным эпитопам молекуты ТР1.
3. Научная новизна. Научная новизна данной работы заключается в тон, что впервые был проведен комплексный анализ гукорального иммунного ответа к ТР у больных иРНГ (включая пациентов, находящихся в ремиссии свыше 5 лет, а также у больных, умерших от прогрессиро-вания этого заболевания) в зависимости от клинических характеристик этого заболевания. Получение коллекции плаэмидных клонов, экс-прессирующих как полноразмерный ТР1, так и отдельные участки его молекулы позволило оценить структурные и функциональные особенности молекулы ТР, а именно: иммуногённость и участие в формировании антигенных детерминант доменов белка, а также направленность гуморального ответа у больных нРНГ к конкретным эпитопам ТР. Полученные данные, свидетельствующие о направленности анти-ТР антител человека и животных к разным участкам белка, позволили проанализировать возможные причины неудач по изучению экспрессии этого белка в опухолевых клетках нРНГ и разработать подходы по получению соответствующих серологических реагентов (поли- и моноклональных антител) .
4,Научно-практическая значимость работы, Проведенные исследования вносят определенный вклад в малоизученную проблему взаимоотношения вируса с клетками эпителия на уровне функционирования индивидуальных генов латентной инфекции ВЭБ и их продуктов, а также способствуют пониманию особенностей иммунного ответа к ВЭБ при различных ВЭВ-ассоциированных патологиях и поиску эффективных путей иммунологического контроля этой инфекции. Решение поставленных в данной работе задач позволило проанализировать диагностическую и прогностическую значимость выявления антител к ТР у больных нРНГ. Полученное данные являются предварительными и работа в данном направлении будет продолжена. Тем не менее, применение в клинике теста по оценке изменения уровня антител к ТР до и после лечения в качестве параметра, определяющего эффективность проведенного лечения и прогноз заболевания в каждом индивидуальном случае, представляется весьма перспективным. Таким образом, полученные данные будут способствовать разработке новых подходов к мониторингу и прогнозу больных НРНГ. 5; Апробация работы. . Апробация диссертационной работы была прове-
дена ЗО января 1996 г. на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.
Основные положения диссертации докладывались на II и III международных конференциях "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (Россия, Санкт-Петербург, 1994 и 1995 г.г.), на школе иммунологии им. Джона Хампфри (Россия, Пущино, 1994 г.), а также на XXI Европейском симпозиуме по опухолевым вирусам человека (Австрия, Иннсбрук, 1995 г.)
-
Публикации. По материалам .выполненных исследований опубликовано 7 работ.
-
Структура и объен дпсавртацшь диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (включающего б глав), описания использованных материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит Iff рисунков, 2 таблицы, 1 приложение, занимает ЮЗ страниц машинописного текста. Библиография включает 4 источника отечественной и 122 иностранной литературы.
