Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные возможности диагностики рака носоглотки (обзор данных литературы) ...,... 11
ГЛАВА 2. Общая характеристика собственных клинических наблюдений методы исследования 37
2.1. Общая характеристика материала 37
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Методика эндоскопического исследования верхних дыхательных путей ...41
2.2.2. Способы получения материала для морфологического исследования... 45
2.2.3. Способы получения материала для иммуносерологического и молекулярного исследований при раке носоглотки... 47
2.3. Резюме .47
ГЛАВА 3. Эндоскопическая семиотика и диагностика рака носоглотки ... ...50
3.1. Эндоскопическая семиотика рака носоглотки 50
3.2. Диагностика рака носоглотки 56
3.2.1. Клинико-эндоскопическая диагностика рака носоглотки ... 56
3.2.2. Уточнение распространенности первичной опухоли при раке носоглотки .—... ...65
3.3. Морфологическая диагностика рака носоглотки 74
3.4. Резюме... ...81
ГЛАВА 4. Иммуно-серологические и молекулярно-биологические исследования при раке носоглотки ... 86
4.1. Иммуно-серологический тест рака носоглотки. 86
4.1.1. ВЭБ-специфические антигены и характеристика клеточных линий, используемых в качестве тест-клеток 86
4.1.2. Показания для применения иммуно-серологического теста 91
4.1.3. Иммуно-серологический тест в диагностике рака носоглотки носоглоточного типа 91
4.1.4. Маркеры ВЭБ в динамическом наблюдении больных после лечения 95
4.2. Молекулярно-биологические исследования 100
4.3. Резюме 105
Заключение 109
Выводы 122
Практические рекомендации 124
Список литературы 125
- Методика эндоскопического исследования верхних дыхательных путей
- Клинико-эндоскопическая диагностика рака носоглотки
- ВЭБ-специфические антигены и характеристика клеточных линий, используемых в качестве тест-клеток
- Молекулярно-биологические исследования
Введение к работе
Актуальность проблемы
Новообразования носоглотки занимают второе место среди локализаций опухолей верхних дыхательных путей и составляют по данным различных авторов от 0,4 до 3% всех злокачественных новообразований (Напалков Н.П. и соавт., 1977, 1981; Тихонова Н.А., 1980; Давыдов М.И. и соавт., 2002, 2003). Распространенность рака носоглотки зависит от территориального и расового признаков, а также врожденных фактов (Buell Ph., 1973; Hirayma Т., 1978; Yan L., Xi Z., Drettner В., 1989; Anim J.T., 1991; Coffin СМ., 1991, Hahn P. etal.,2001).
Высокий процент диагностических ошибок при исследовании носоглотки зависит от ее анатомо-топографических соотношений и затрудненности полноценного осмотра традиционными методами. Не случайно носоглотку называют «слепой зоной» верхних дыхательных путей и основным методом диагностики до настоящего времени считают ее пальцевое исследование. В связи с этим трудно говорить о ранней диагностике опухолевой патологии, если учесть еще и тот факт, что рак носоглотки имеет характерные биологические особенности роста. Небольшие опухоли могут давать обширное мета-стазирование в регионарные лимфатические узлы, которое связывают со снижением Т-клеточного иммунитета (Tamura S. et al., 1992). Клиническим проявлением дефекта иммунной системы является тот факт, что темпы роста метастазов опережают темпы роста первичной опухоли, а также способность к гематогенной диссеминации (Белоусова Н.В. и соавт., 2000; 2003).
Малая доступность носоглотки для осмотра затрудняет проведение дифференциальной диагностики злокачественных новообразований и неопухолевых патологий. Кроме сложностей распознавания новообразований имеются существенные трудности получения полноценного материала для морфологического исследования, т.к. у большинства больных биопсия вы- полняется «вслепую». В связи с этим возникает необходимость многократного повтора биопсии. При выраженных клинических данных до 20% больных принимается на лечение без подтверждения наличия опухоли морфологическими методами (Cachin Y. et al.,1978).
Эндоскопический метод исследования верхних дыхательных путей, разработанный и впервые примененный для осмотра носоглотки в отделении эндоскопии РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина, позволил визуализировать патологию этого отдела дыхательной системы (Пачес А.И. и соавт., 1975; Бело-усова Н.В., Шабаров В.Л., 1979; Белоусова Н.В., 1983; Поддубный Б.К. и соавт., 1987; Белоусова и соавт. 2000).
Рак носоглотки преимущественно представлен двумя морфологическими формами: плоскоклеточным раком с разной степенью дифференци-ровки клеток (умеренно- и низкодифференцированный) и недифференцированный рак носоглоточного типа, который составляет более 60% наблюдений. В 1921 году Schminke и Regaud впервые применили термин «лимфоэпи-телиома», описав особый вариант опухоли носоглотки, желая при этом подчеркнуть ее двойное тканевое происхождение. Он по существу является фактором «незнания» и употребляется в тех случаях, когда тканевая природа опухоли представляется неясной и трудно отдать предпочтение, как недифференцированному раку, так и лимфоме.
К сожалению, термином лимфоэпителиома «опухоль Шминке» в практике до настоящего времени обозначаются самые разнообразные опухоли (В-клеточные лимфомы, низкодифференцированный плоскоклеточный рак, ве-ретеноклеточный рак). В последнее время большинство исследователей склонны ее относить к недифференцированному раку носоглоточного типа.
Большое внимание в последние годы исследователи уделяют связи между недифференцированным раком носоглотки и герпесоподобным вирусом Эпштейна-Барр (Степина В.Н. и соавт., 1987; Gurtsevich V. et al., 1986; Fahreus R. et al., 1988; Ernberg J. et al., 1990).
Первичная инфекция ВЭБ сопровождается продукцией гуморальных антител к капсидному антигену (КА) и раннему антигену (RA) ВЭБ. Антитела к раннему антигену исчезают, тогда, как антитела к каспидному ВЭБ присутствуют практически всю жизнь. При ряде опухолевых заболеваний титры антител к антигенам ВЭБ значительно повышаются. В большинстве случаев повышение титров антител к антигенам ВЭБ является следствием снижения контроля над уровнем размножения вируса со стороны клеточного иммунитета. Свидетельством присутствия латентного вируса является наличие антител к КА ВЭБ в сыворотке здоровых людей. У здоровых лиц титры антител к капсидному антигену ВЭБ отражают уровень размножения ВЭБ. В нормальных условиях титры к КА ВЭБ колеблются в пределах от 1:20 до 1:160. При недифференцированном раке носоглоточного типа происходит значительное повышение титра к КА ВЭБ, вследствие снижения контроля над уровнем размножения вируса со стороны клеточного иммунитета (Афанасьева Т.А. и соавт., 1995; Freeh В. et al., 1993).
В настоящее время известно, что практически все население планеты (95-100%) инфицировано ВЭБ, но новообразования, в возникновении которых вирус принимает непосредственное участие, возникают достаточно редко и с неодинаковой частотой в различных этнических группах и географических регионах. Исходя из сказанного, изучение механизма возникновения ВЭБ-ассоциированных новообразований, включая и РНГ, является важной актуальной проблемой современной онковирусологии.
Вышеизложенное определило цель настоящего исследования: улучшение диагностики рака носоглотки и его особой формы недифференцированного рака носоглоточного типа.
Задачи исследования
Разработка эндоскопической семиотики и эндоскопической диагностики нРНГ.
Определение характерологических особенностей нРНГ.
Оценка диагностической значимости и прогностического теста гуморального ответа к вирусу Эпштейна-Барр.
Изучение генетических модификаций гена LMP1 в ВЭБ-ассоциированных неоплазиях и определение вариантов гена LMP1 в опухолевой ткани изучаемых нами больных нРНГ.
Выявление ведущих диагностических критериев недифференцированного рака носоглоточного типа.
Материал и методы исследования
Для решения поставленных задач проанализированы данные 184 больных раком носоглотки из 6000 пациентов с патологией верхних дыхательных путей, обследованных в отделении эндоскопии РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина с 1991 по 2002 год. На основании комплексного обследования у 122 больных выявлен недифференцированный рак носоглоточного типа. Возраст больных колебался в от 11 до 80 лет.
В процессе работы использовали эндоскопический метод исследования для визуальной диагностики патологии верхних дыхательных путей и получения материала для цитологического, гистологического и молекулярного исследований. Полный эндофиброскопический осмотр верхних дыхательных путей включает в себя переднюю и заднюю риноэпифарингоскопию и осмотр нижележащих отделов глотки и гортани.
Эндоскопическое исследование выполняли с помощью различных моделей гибких эндоскопов, производства японской фирмы «Olympus». Наиболее целесообразно в онкологической практике использовать аппараты с наибольшим биопсийным каналом. Это позволяет получить достаточное количество материала для морфологических и молекулярных исследований.
Всем больных с опухолью носоглотки производили биопсию для гистологического исследования, брали мазки-отпечатки для цитологического исследования, производили забор материала для молекулярного исследова- ния. Одновременно брали кровь из вены для изучения гуморального ответа к вирусу Эпштейна-Барр.
Заключение визуального эндоскопического осмотра сопоставляли с другими диагностическими методами обследования.
Научная новизна работы
Используя в арсенале диагностических исследований эндофибро-скопический метод, как метод визуальной диагностики и способ получения материала для морфологического и молекулярного исследования, также, производя одновременный забор крови для изучения гуморального ответа к вирусу Эпштейна-Барр, мы впервые всесторонне охарактеризовали недифференцированную форму рака носоглоточного типа. На большом клиническом и экспериментальном материале показаны клинические, эндоскопические, морфологические и биологические особенности недифференцированного рака носоглоточного типа.
Разработаны эндоскопические дифференциально-диагностические критерии этой формы рака носоглотки, которые подтверждены данными морфологических и молекулярных исследований и исследованиями серологического маркера вируса Эпштейна-Барр.
Изучение уровня гуморального ответа к вирусу Эпштейна-Барр в динамике показало необходимость использования данного маркера для диагностики и оценки лечения и течения заболевания.
Полученные молекулярно-биологические данные свидетельствуют о том, что наличие «Сао»-подобной делеции в гене LMP1, не является обязательным условием в патогенезе нРНГ, инициируемого ВЭБ. Возможно, не только эта делеция 30 п.н., но и дополнительные мутации и генетические перестройки в гене LMP1 играют важную роль в инициировании патологического процесса и формировании опухоли в неэндемичных для нРНГ регионах, одним из которых является Россия.
Практическая значимость работы и предложения по использованию полученных результатов
Проведенное исследование раскрывает возможности эндофиброскопи-ческого метода в диагностике рака носоглотки. Критерии эндоскопических дифференциально-диагностических картин позволяют охарактеризовать особую форму рака носоглотки - недифференцированный рак носоглоточного типа, что подтверждается морфологическими и серологическими данными. Закономерно выявляемая связь высоких титров ВЭБ-специфических антител у больных недифференцированным раком носоглотки позволяет использовать серологические маркеры ВЭБ в качестве высокоспецифического и информативного маркера недифференцированного рака носоглоточного типа.
Зависимость уровня гуморального ответа к антигенам ВЭБ от регрессии опухоли или прогрессирования заболевания позволяет использовать этот фактор не только для диагностики недифференцированного рака носоглотки, но и для оценки эффективности проводимого лечения и прогноза заболевания.
Разработаны и внедрены в практику практические рекомендации по диагностике и иммуно-серологическому контролю над течением недифференцированного рака носоглоточного типа.
Реализация результатов работы
Результаты исследований внедрены в практику РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина и Московского Онкологического Диспансера.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Методика эндоскопического исследования верхних дыхательных путей
Первичный фиброскопический осмотр включал детальный осмотр всех отделов верхних дыхательных путей.
Исследование осуществлялась различными моделями фибробронхо-скопов фирмы «Olympus», японского производства или аппаратами для исследования верхних дыхательных путей, которые отличаются от первых только длинной рабочей части. Непременным условием в онкологической практике является наличие биопсийного канала в фиброскопе, так как одновременно с изучением визуальных данных и установления диагноза, основанного на визуальных картинах, необходимо взятие материала для цитологического, гистологического и других видов исследования.
Фиброскопическое исследование верхних дыхательных путей у большинства пациентов не требовало специальной подготовки. Осмотр проводился натощак или спустя 4 часа после приема пищи. Это требование связано с возможным раздражением рефлексогенных зон глотки и повышенным рвотным рефлексом, что небезопасно при использовании местной анестезии или общего обезболивания у детей.
Выбор метода обезболивания и премедикации зависел от задач исследования, возраста, психологического и функционального состояния пациента. У большинства взрослых людей фиброскопический осмотр верхних дыхательных путей выполнялся без премедикации. У больных с выраженным рвотным рефлексом, обильной саливацией производилась одноразовая медикаментозная подготовка. Обычно больному вводили 0,1% раствор сернокислого атропина (0,7-1,0 мл). При наличии в анамнезе аллергических реакций добавляли 2% раствор супрастина (1-2 мл).
Анестезию слизистой оболочки полости носа и ротоглотки осуществляли путем распыления различных анестетиков местного действия. В настоящее время мы используем 10% раствор лидокаина 2-3 дозы. При необходимости -прицельной биопсии 2% раствор лидокаина в количестве 5-6 мл. Лидокаин в этой дозировке обеспечивает хорошую анестезию и не дает аллергических реакций.
Предварительно перед фиброскопическим исследованием осуществляли осмотр полости рта и ротоглотки с помощью шпателя с волоконной оптикой российского производства.
Исследование начинали с осмотра полости носа и осуществляли с двух сторон: через наружные носовые отверстия - передняя ринофиброскопия, что соответствует методике традиционной риноскопии, и через хоану - задняя ринофиброскопия. Последняя позволяет получить информацию о состоянии задних отделов полости носа и носоглотки при сужении просвета или обту-рации его опухолью.
При передней ринофиброскопии дистальный отдел фиброскопа проводили между нижней раковиной и дном полости носа. Первоначально изучали нижние отделы полости носа, ее дно, нижний отдел латеральной стенки, участок, прилегающий к носовой перегородке в области нижней раковины. Затем аппарат вводили в средний носовой ход. Ротационные и поступательные движения фиброскопа с одновременным изменением угла дистального конца с помощью блока управления позволяли последовательно осмотреть все стенки полости носа. Осматривали среднюю носовую раковину и средний носовой ход, обращая особое внимание на латеральную его стенку. Увеличивая угол изгиба, изучали верхний носовой ход и верхнюю носовую раковину. Выравнивая угол изгиба дистального конца аппарата и постепенно, продвигая его вглубь, осматривали задние отделы. Аналогичное исследование выполняли с другой стороны.
Заднюю ринофиброскопию осуществляли путем введения дистального конца фиброскопа через полость рта.
При осмотре верхних дыхательных путей путем введения рабочей части аппарата через полость рта, во избежание прикуса фиброскопа, между верхними и нижними зубами пациента вставляли мундштук-загубник или больной фиксировал кончик языка двумя пальцами, между которыми находилась марлевая салфетка.
В полость рта вводили рабочий конец фиброскопа, который продвигали до задней стенки ротоглотки, с помощью блока управления дистальный конец поворачивали на 90 и заводили за мягкое небо. Затем угол изгиба увеличивали до 120-130. Аппарат поступательным движением продвигали до сошника. Через хоаны осматривали задние концы раковин с обеих сторон, общий носовой ход, средние отделы полости носа. Эпифарингофиброскопию также осуществляли с двух сторон. Переднюю эпифарингоскопию выполняли путем дальнейшего продвижения аппарата по среднему или нижнему носовому ходу в носоглотку. При передней эпифарингофиброскопии дистальный конец аппарата незначительно сгибали вверх, и осматривали верхнюю стенку с глоточной миндалиной. Продвигая аппарат вперед, изучали состояние верхней стенки на всем протяжении, включая задний угол. Постепенно извлекая аппарат, и меняя угол изгиба вниз, осматривали заднюю стенку. После осмотра задней стенки, меняя угол изгиба вверх, затем вниз и ротируя фиброскоп по оси рукой, осматривали поочередно боковые стенки. Особое внимание при этом обращали на состояние устья слуховой трубы, трубного валика и розенмюллеровской ямки. При увеличении угла дистального конца аппарата вниз последовательно осматривали глоточную поверхность мягкого неба и язычка.
При исследовании нижних отделов верхних дыхательных путей рабочую часть продвигали дальше вниз.
Достоинством передней эпифарингофиброскопии является возможность пристального изучения всех отделов носоглотки за исключением передней части.
Заднюю эпифарингофиброскопию осуществляли путем введения рабочей части аппарата через полость рта до задней стенки ротоглотки. Изгибая дистальную часть аппарата вверх под углом 90, осматривали заднюю стенку и задний угол носоглотки. Однако аппарат идет по касательной и незначительные изменения можно не уловить. Увеличивая угол изгиба до 120-130, изучали верхнюю стенку. При увеличении угла и продвижении аппарата вперед, становилась хорошо обозрима, передняя часть носоглотки и задние отделы полости носа. Несколько извлекая аппарат, и ротируя по оси, методично осматривали боковые стенки с расположенными на них анатомическими образованиями. Медленно извлекая аппарат из полости носоглотки, осматривали глоточную поверхность мягкого неба. Именно двустороннее исследование носоглотки позволило детально изучить все стенки. Следует заметить, что при выполнении передней эпнфарингоскопии мы получаем прямую картину, а при задней эпнфарингоскопии - обратную картину носоглотки.
Клинико-эндоскопическая диагностика рака носоглотки
На основании данных клинического обследования и зеркального осмотра верхних дыхательных путей рак носоглотки был установлен у 90 больных (48,9% наблюдений рака носоглотки). Необходимо отметить, что наряду с гиподиагностикой имела место и гипердиагностика рака носоглотки и оши бочная диагностика злокачественных новообразований. В эту группу вошли пациенты с гипертрофией глоточной миндалины, аденоидитом, раком околоушной слюнной железы и раком гортани. Передняя и задняя эпифаринго-фиброскопия в 95,1% наблюдений позволила поставить на основании визуальных данных правильный первичный диагноз рака носоглотки. Разница в частоте постановки правильного утвердительного диагноза злокачественного новообразования носоглотки при эндоскопии и оториноларингологическом осмотре статистически достоверна (t=6,8, р 0,01, т.е. вероятность различия 99%). То же самое можно сказать и об ошибочном диагнозе: 36,8% при зеркальном осмотре и 1,1% при эндоскопии (t=l 1,1, р 0,01).
На основании полученных данных видна высокая специфичность эндоскопического метода исследования при выявлении рака носоглотки.
Приводим выписки из историй болезни.
История болезни № 02.9113 больного А., 51 год. Обратился в поликлинику РОНЦ РАМН 2.04.2002 г. с жалобами на отсутствие носового дыхания, выделения из носа. Осмотрен в кабинете поликлиники. На шее с двух сторон определялись увеличенные до 2 см узлы. Справа в позадичелюстной области узел размером 3,5 см в диаметре. Дыхание через нос отсутствует. В полости носа справа разрастания опухолевой ткани. Носоглотку осмотреть не удалось. Диагноз рак носоглотки с метастазами в лимфатических узлах шеи с двух сторон. Направлен в отделение эндоскопии.
Эндоскопически при передней риноэпифарингоскопии: задний отдел правой половины носа занят опухолевыми разрастаниями серо-розового цвета. Слева: опухоль определяется на уровне хоаны, которая обтурирова-на. Опухоль темно красного цвета, при дотрагивании кровоточит. При задней эпифарингоскопии: вся полость носоглотки заполнена бугристой опухолью, с участками серо- или темно-красного цвета. Опухоль исходит из свода носоглотки. Произведена биопсия, мазки-отпечатки с опухоли. Произведен забор крови из вены на определение титров ВЭБ. Заключение: Рак носоглотки, экзофитная форма роста, ТЗ.
Цитология от 03.04.2002 № 02-15529: недифференцированный рак носоглоточного типа. Гистология от 05.04.2002 г. № 02-5741: разрастания недифференцированного рака носоглоточного типа.
Серология ВЭБ: IgG YCA 640, ЕА 320, IgA YCA 160. Показатели соответствуют активной фазе опухолевого процесса. В отделении опухолей головы и шеи РОНЦ РАМН с 15.04.02 по 19.04.02 больному был проведен первый курс химиотерапии по схеме фтору-рацил по 1 г в 1-5 дни, СД 5,0 г, цисплатин 180 мг в 2 дня. С 14.04.02 по 18.04.02 второй курс химиотерапии по той же схеме. С 24.06 по 19.07.02 ДГТ СОДна первичный очаг 40 Гр., на регионарные зоны 34 Гр. В удовлетворительном состоянии больной был направлен под наблюдение районного онколога. Наблюдался в поликлинике РОНЦ РАМН. Ремиссия в течение 2 лет.
История болезни № 03/14233 больного С, 31 год. Обратился в поликлинику РОНЦ РАМН 23.07.2003 г. с жалобами па затруднение носового дыхания, наличие лимфатических узлов на шее слева. Осмотрен в кабинете поликлиники: носовое дыхание затруднено, на шее слева пальпируется конгломерат лимфатических узлов 4,0 на 4,0 см. Просвет ротоглотки сужен за счет инфильтрации мягкого неба, что затрудняет осмотр носоглотки. Диагноз рак носоглотки с метастазами в лимфатических узлах слева. Направлен в отделение эндоскопии.
Эндоскопически: мягкое небо утолщено, ригидно, деформировано и выбухает в просвет ротоглотки. В носоглотке бугристый опухолевый инфильтрат занимает глоточную поверхность мягкого неба, обе боковые стенки и частично свод. Биопсия, мазки. Заключение: Рак носоглотки с распространением в ротоглотку, T3N2M0.
Цитология ЛЬ 03-12327 от 28.07.03: недифференцироваїшьгй рак носоглоточного типа. Гистология от 28.07.03 № 03-14854: недифференцированный рак носоглоточного типа.
В отделении опухолей головы и шеи с 11.08.03 по 15.08.03 проведен 1-ый курс химиотерапии по схеме: 5-фторурацил СД 5,0 (1-5 дни), цисплатин 170 мг в 1-ый день, латран 8 мг. С 13.08.03 по 16.09.03 проведен 1-ый этап лучевой терапии СОД 40 Гр. В процессе облучения отмечались явления лучевого эпителиита, эпидермита. После лечения регрессия опухоли на 50%. С 22.09 по 26.09.03 проведен 2-ой курс химиотерапии по схеме: 5-фторурацил СД 5,0 г (1-5 дни), цисплатші 170 мг во 2-ой день, зофран 8 мг. Проведен 2-ой курс лучевой терапии СОД 68 Гр. При контрольном эндоскопическом исследовании полная регрессия опухоли.
Как видно из приведенных историй болезни на основании осмотра первоначальный правильный диагноз рака носоглотки был поставлен в случаях распространенного опухолевого процесса в носоглотке. Детально осмотреть носоглотку не удалось. Данные о локализации опухоли и материал для морфологической идентификации получен при эндоскопическом осмотре. Подозрение на рак носоглотки на основании клинического и оторино-ларингологического осмотра в совокупности с пальцевым исследованием, которое в риноларингологической практике остается до настоящего времени ведущим, высказано в 12,5% наблюдений.
Приводим выписки из историй болезни.
История болезни № 00/5394 больного Ш., 18 лет. Обратился в поликлинику РОНЦ РАМН 18.01.2000 г. с жалобами на головную боль, наличие лимфатических узлов на шее слева. При осмотре в кабинете на шее слева конгломерат лимфатических узлов 6x5 см. В носоглотке при палы\евом исследовании пальпируется уплотнение. Диагноз: подозрение на рак носоглотки с метастазами на шее слева. Больной направлен в эндоскопическое отделение.
Эндоскопически: в своде носоглотки утолщение слизистой оболочки полиповидной формы 1,3 на 0,9 см, рельеф разрыхлен, поверхность шероховата. Биопсия, мазки, кровь на ВЭБ. Заключение: Рак носоглотки, смешанная форма роста без изъязвления, ТІ, с метастазами в лимфатических узлах шеи.
ВЭБ-специфические антигены и характеристика клеточных линий, используемых в качестве тест-клеток
Диагностическим тестом для рака носоглотки служит обнаружение в сыворотках больных высоких титров IgG и IgA-антител к ВЭБ-ассоциированным антигенам. Как показали предварительные исследования, информативными являются сочетания IgA-антител к капсидному антигену (КА) и IgG-антител к капсидному и раннему антигенному комплексу (РА) ВЭБ.
Процесс трансформации В-лимфоцитов под влиянием ВЭБ сопровождается появлением серии структурных вирусных и клеточных антигенов, специфичность которых контролируется вирусом. В настоящее время выведено множество суспензионных В-клеточных линий, трансформированных ВЭБ. Одни из шгх получены из клеток лимфомы Беркитта - это так называемые моноклональные лимфомные линии. Другие выведены in vitro путем культивирования В-лимфоцитов пупочного канатика, инфицированных ВЭБ или просто культивированием лимфоцитов периферической крови серопози-тивного донора. Эти линии получили название поликлональных лимфобла-стных линий, в которых ВЭБ является иммортализатором В-лимфоцитов. Все В-клеточные линии проявляют различную способность к синтезу структурных вирусных белков. Во всех трансформированных ВЭБ-клетках определяются геном вируса и вирус-специфический ядерный антиген - EBNA. Этот антиген находится в ядрах в 2 формах - растворимой (S) и связанной с хроматином. Роль EBNA не ясна. Известно, что синтез EBNA является автономной функцией вирусного генома, не подчиняющейся клеточному контролю. Было высказано предположение, что EBNA играет важную роль в поддержании состояния трансформации клетки.
Другим продуктом вирусного генома являются белки раннего антигенного комплекса. Впервые ранний антиген (РА) был идентифицирован в клетках линии RAJI, после суперинфекции их ВЭБ. При этом было установлено, что антиген, синтезируемый такими клетками, отличается по своей специфичности от капсидного антигена ВЭБ, который является структурным компонентом вирусного капсида. РА-ВЭБ не обнаруживается в составе вирусных частиц и классифицируется как неструктурный вирусный антиген.
Капсидный антиген (КА) локализуется в ядре и цитоплазме ВЭБ-продуцирующих клеток. Этот антиген является структурным белком вирусного капсида и обнаруживается только в вируспродуцирующих клетках. Антитела к этому антигену в низких титрах содержит практически все взрослое население, а в сыворотках больных инфекционным мононуклеозом, лимфо-мой Беркитта и раком носоглотки титры антител к КА-ВЭБ достигают очень высоких значений.
Для тестирования сывороток крови человека на наличие и титры антител к антигенам ВЭБ нами были использованы клеточные линии P3HR1 (клетки, продуцирующие активный вирус) и RAJI (клетки, не продуцирующие вирус, но содержащие его в латентном состоянии). Для увеличения количества клеток, содержащих ВКА и РА, клеточные культуры обрабатывали добавлением ТРА (12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат) в концентрации 20 нг/мл и культивировали в течении 3-5 дней. После отмывки в PBS клеточную суспензию наносили на предметные стекла в виде изолированных капель, высушивали, фиксировали охлажденным ацетоном и хранили до использования при -20 С. Все сыворотки, подлежащие тестированию, предварительно инактивировали при 56С. Перед работой клеточные препараты оттаивали и высушивали при комнатной температуре. Контуры клеточных капель обводили черным фломастером (по лицевой стороне) и на каждую каплю наносили соответствующие разведения исследуемых или контрольных сывороток так, чтобы капли сывороток на препарате не сливались. Минимальное разведение тестируемых сывороток было 1:10 с последующим двукратным разведением до 1:1280. Далее проводили инкубацию фиксированных на стекле клеток с сывороткой во влажной камере в течение 30 мин. при 37 градусах Цельсия с последующим 3-кратным тщательным отмыванием препаратов в PBS (Ph 7,0-7,2). Хорошо отмытые препараты высушивали при комнатной температуре. На сухие препараты наносили меченые флуоресцеинизотиоционатом иммуноглобулины, которые в нашем исследовании были представлены антителами против IgG или IgA глобулинов человека (Sigma, США; ИЭМ им. Н.Ф. Гамалея, Россия). Инкубацию с меченными глобулинами проводили 30 мин при 37С во влажной камере с последующим отмыванием путем многократного погружения в PBS с 3-кратной сменой раствора. При тестировании сывороток на антитела к КА-ВЭБ использовали препараты с фиксированными клетками линии P3HR-1, а при тестировании сывороток на антитела к РА использовали препараты с фиксированными клетками линии RA Л. В качестве негативного контроля использовали сыворотку, заведомо не содержащую антител к ВЭБ. При позитивном контроле антигенсо держащие препараты обрабатывали сывороткой с высокими титрами антител к соответствующим вирусспецифическим антигенам. Контроль качества меченых иммуноглобулинов осуществляли в реакции, где вместо сыворотки наносили каплю PBS с последующей обработкой мечеными сыворотками против глобулинов классов IgG или IgA. Отсутствие свечения в негативных контролях и яркое окрашивание в позитивных свидетельствовало о специфичности реакции. На фотографиях 1 и 2 представлены примеры тестирования сывороток больных РНГ на КА и РА ВЭБ, а также контрольной негативной сыворотки.
Молекулярно-биологические исследования
В настоящее время хорошо известно, что практически все население планеты (95-100%) инфицировано ВЭБ, но новообразования, в возникновении которых вирус принимает непосредственное участие, возникают достаточно редко и с неодинаковой частотой в различных этнических группах и географических регионах. Исходя из сказанного, изучение механизма возникновения ВЭБ-ассоциированных новообразований, включая и РНГ, является важной актуальной задачей современной онковирусологии.
Как было сказано выше, при изучении генетической структуры и функции отдельных генов ВЭБ исследователи пришли к выводу о том, что ряд генов вируса, кодирующих белки латентной инфекции, обладают в той или иной степени трансформирующими клетку потенциями. Среди указанных генов особенное место занимает ге н LMP1, кодирующий латентный мембранный белок 1 (LMP1). Последний обладает всеми свойствами онкобелка: он способен трансформировать В-лимфоциты и фибробласты грызунов in vitro, а введение трансформированных таким образом клеток бестимусным мышам приводит к возникновению у них опухолей (Baichwal V.R., Sudgen В., 1988; Dirmeier U. et al., 2003).
Накопленная в отношении LMP1 информация однако не давала ответа на основной вопрос, почему при поголовном инфицировании населения ВЭБ, злокачественные заболевания, инициированные этим вирусом, возникают крайне редко. Ответ на этот принципиальный вопрос, казалось бы, наметился в работе, выполненной Ни et al. (1991). Ими, в частности, было обнаружено, что ген LMP1, амплифицированный от китайского больного нРНГ, содержит делецию 30 п.н. в С-терминальной области гена, и набор точечных мутаций в промоторной области и кодирующей последовательности гена. Схематическое изображение структуры LMP1 представлено на рисунке 1.
Этот вариант гена, названный «Сао», проявлял более выраженные трансформирующие способности in vitro и оказался более туморогенным у мышей с выраженным комбинированным иммунодефицитом (SCID) по сравнению с геном LMP1 стандартного (дикого) варианта вируса, штамма В95.8.
Позже было показано, что варианты гена LMP1 с указанной делецией не только широко распространены в географическом регионе, эндемичном для нРНГ, каковым является Юго-Восточная Азия, но встречаются, хотя и гораздо реже, в других географических регионах мира. Более того, делециро-ванные варианты гена были также амплифицированы из опухолевых клеток больных другими ВЭБ-ассоциированными новообразованиями, в том числе ЛГМ и периферическими Т-клеточными лимфомами. При этом процент «Сао»-позитивных случаев в группе больных с вышеуказанной патологией в различных географических регионах существенно варьировал: от 10-30% в Европе до 80-100% в Китае, Мексике и Малайзии (Lin JC, et al., 1995; Hayashi К, et al., 1997; Dirnhofer S, et al., 1999). Делецированные варианты LMP1 были обнаружены и при некоторых лимфоидных реактивных состояниях, и даже у здоровых лиц (Khanim F. et al., 1996; Dolcetti R. et al., 1997; Fischer J.N. et al.,.1999). При этом одни авторы не выявили более высокой частоты делецированных вариантов гена у больных различными ВЭБ-ассоциированными новообразованиями по сравнению со здоровой популяцией того же географического региона. Другие сообщили об их существенном преобладании по сравнению с вариантами гена LMP1 дикого типа, например, в T/NK-клеточных назальных лимфомах.
Таким образом, накопленные, в том числе и противоречивые, данные свидетельствуют о необходимости изучения генетических модификаций гена LMP1 в ВЭБ-ассоциированных неоплазиях для конкретного географического региона. В связи с выше изложенным, представлялось необходимым выяснить: 1) какие варианты гена LMP1 присутствуют в опухолевой ткани изучаемых нами больных РНГ и имеются ли у них «Сао»-подобные делении, характерные для больных РНГ из эндемичного для этого заболевания региона
Юго-Восточной Азии; 2) отличаются ли в России варианты гена LMP1, обна руженные у больных РНГ, от вариантов этого же гена, амплифицированных из В-лимфоцитов периферической крови здоровых лиц; 3) имеются ли генетические отличия у вариантов LMP1 ВЭБ, перснстирующнх среди населения в России от вариантов LMP1 европейского происхождения.
Данный раздел работы мы проводили совместно с сотрудниками лаборатории вирусного канцерогенеза ГУ Российский Онкологический научный Центр им. Н.Н.Блохина РАМН.
Для исследования использовали клинический материал, состоящий из 20 образцов опухолей от больных недифференцированным гистологическим вариантом рака носоглотки (нРНГ) и 15 образцов периферической крови здоровых лиц (доноров крови), отобранных методом случайного отбора. В исследуемые группы вошли лица обоего пола в возрасте от 16 до 53 лет из различных регионов европейской части России, среди которых не было представителей монголоидной расы.
