Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика вируса Эпштейна-Барр.
2. Ассоциированные с ВЭБ заболевания человека.
2.1. Инфекционный мононуклеоз.
2.2. Лимфома Беркитта.
2.3. Лимфогранулематоз (болезнь Ходжкина).
2.4. Пострансплантационные и другие ВЭБ-ассоциированные лимфомы.
2.5. Рак желудка.
2.6. Рак носоглотки.
3. Особенности -молекулярно-генетической организации генома ВЭБ. Гены латентного и литического цикла.
4. Основные типы латентности генома ВЭБ и механизм их поддержания.
5. Латентный мембранный белок ВЭБ (LMP1).
5.1. Общая характеристика, положение в геноме, регуляция активности.
5.2. Основные функциональные домены молекулы LMP1. Иммортализирующие, трансформирующие и цитостатические свойства LMP1.
5.3. Молекула LMP1 как постоянно активированный аналог клеточного рецептора фактора некроза опухолей 1 (TNF-R1). Сигнальные свойства продукта гена LMP1: активация различных клеточных сигнальных путей.
6. Мутационные изменения гена LMP1 и их возможная роль в патогенезе развития неоплазий человека.
6.1. «Азиатский» (CaO LMP1) вариант гена LMP1 и его возможная связь с генезом нРНГ в Юго-восточной Азии.
6.2. Мутационные перестройки LMP1 при других неопластических заболеваниях человека (ЛГМ, лимфомы, РЖ, СПИД и др.).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Структурный анализ новых изолятов LMP1 ВЭБ от больных нРНГ и здоровых лиц.
1.1. Серологический мониторинг и отбор группы больных РНГ.
1.2. Амплификация LMP1-специфических последовательностей и клонирование в pGEM-T векторной системе. <
1.3. Сиквенсный анализ полученных клонов LMP1. i
2. Функциональный анализ изолятов LMP1 от больных нРНГ и здоровых лиц.
2.1. Реконструкция полноразмерных клонов LMP1 в составе эукариотического вектора pSG5. - ? ?
2.2. Проверка экспрессии белковых продуктов клонов LMP1 методами иммуноблотинга и РИФ.
2.3. Оценка функциональной способности клонов LMP1 активировать транскрипционный фактор NF-kB.
2.4. Оценка функциональной способности клонов LMP1 активировать транскрипционный фактор jun/AP-1.
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Введение к работе
Одной из важнейших фундаментальных проблем современной онковирусологии является изучение молекулярных механизмов действия онкогенных вирусов, к числу которых относят и вирус Эпстайна-Барр (ВЭБ). ВЭБ принадлежит к семейству герпесвирусов, является убиквитарным и персистирует в организме человека на протяжении всей жизни. Роль ВЭБ в возникновении таких опухолей человека как лимфома Беркитта (ЛБ), лимфогранулематоз (ЛГМ), недифференцированный рак носоглотки (нРНГ) считается доказанной. Спектр патологических процессов у человека, в возникновении которых, как полагают, участвует ВЭБ, постоянно расширяется. Так, в настоящее время широко обсуждается вопрос о роли ВЭБ в процессе канцерогенеза эпителиальных клеток желудка. Более того, за последние годы открылась реальная возможность изучения функций отдельных генов этого вируса в процессе канцерогенеза эпителиальных клеток человка.
Учитывая тот факт, что практически 100% населения планеты инфицировано ВЭБ, вопрос о механизме возникновения ассоциированных с этим вирусом заболеваний, включая и нРНГ, является важной актуальной задачей современной онковирусологии. В этой связи, ген ВЭБ - BNLF1, кодирующий латентный мембранный белок 1 (LMP1) представляет особый интерес. Во-первых, LMP1 - один из немногих генов ВЭБ, который обладает трансформирующим потенциалом in vitro. Во-вторых, этот ген ВЭБ является аналогом рецептора клеточного ростового фактора (предположительно TNFR1) и вызывает множественную активацию клеточных сигнальных путей. В-третьих, определенные перестройки этого гена, такие как множественные точечные мутации, делеция специфического фрагмента размером 30 пар нуклеотидов в третьем экзоне и другие, способствуют увеличению трансформирующего потенциала вируса /Ни et al., 1991/.
Генетические перестройки гена LMP1 характеризуют изоляты ВЭБ, полученные от больных нРНГ в Юго-Восточной Азии и Средиземноморье. Этирегионы считаются эндемичными районами по нРНГ. Поиск и молекулярно-генетический анализ таких изолятов в неэндемичной зоне, а именно на территории России, представляется актуальной научной и практической задачей, которая позволит, вероятно, как получить новые экспериментальные данные о трансформирующих потенциях гена LMP1, так и выяснить реальную роль новых изолятов ВЭБ в возникновении нРНГ.
Цель настоящей диссертационной работы состояла в молекулярном и функциональном анализе одного из генов латентной инфекции ВЭБ, LMP1, в вирусных изолятах, полученных из образцов опухолевой ткани больных нРНГ и лимфоцитов периферической крови (ЛПК) здоровых доноров. При этом мы планировали выяснить, относятся ли отечественные изоляты к генетическому типу ВЭБ, распространенному в указанных выше эндемичных для нРНГ регионах; провести поиск дополнительных специфических мутаций, присущих только отечественным изолятам из эпителиальных опухолей человека. В ходе выполнения исследования необходимо было решить следующие задачи:
создать архив клинического материала от больных нРНГ и здоровых лиц (биопсии опухолей, сыворотки и фракции лейкоцитов периферической крови);
провести скрининг сывороток больных нРНГ и здоровых носителей на наличие антител к белкам литической инфекции ВЭБ;
получить полноразмерные варианты гена LMP1 ВЭБ путем ПЦР-амплифика-ции из клинического материала, определить их первичную нуклеотидную структуру и выявить мутационные изменения данного гена;
субклонировать полученные варианты LMP1 ВЭБ в эукариотический экспрессирующий вектор и изучить их функциональное поведение.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые были определены нуклеотидные последовательности вариантов полноразмерного гена LMP1 ВЭБ, амплифицированного из опухолевых тканей больных нРНГ и ЛПК здоровых носителей из России; проведен анализ по изучению их экспрессии и способности активировать транскрипционные факторы NF-kB и АР-1.
Практическое значение полученных результатов состоит в том, что были выявлены определенные генетические отличия между изолятами LMP1 из опухолевой ткани больных нРНГ и периферической крови здоровых лиц. Среди этих генетических изменений присутствуют делеции различного размера, дополнительные "вставки", а также разнообразные точечные замены аминокислот во всех функциональных доменах гена LMP1 ВЭБ. Дальнейшее изучение этих генетических изменений, возможно, поможет расширить понимание сложного комплекса молекулярно-биологических, вирусологических и иммунологических закономерностей, которые лежат в основе патогенеза ВЭБ-ассоциированного нРНГ, а также в разработке новых подходов для ранней диагностики неоплазий человека.
