Содержание к диссертации
Введение
1. Анализ факторов прогноза при раке молочной железы 9
1.1 "Классические" факторы прогноза 9
1.2 Молекулярно-биологическая классификация рака молочной железы 12
1.3 Изменение экспрессии генов при раке молочной железы 14
1.3.1 Изменение экспрессии некоторых генов адгезии и миграции при пролиферативных заболеваниях МЖ 15
1.3.2 Изменение экспрессии некоторых генов пролиферации и дифференцировки при пролиферативных заболевания МЖ 15
1.3.3 Изменение экспрессии некоторых генов, участующих в реакциях метаболизма стероидных гормонов 17
1.3.4 Изменение эксперссии некоторых генов супрессоров/активаторов опухолевого роста и регуляторы клеточного цикла 17
1.3.5 Изменение экспрессии некоторых генов при активации ангиогенеза 20
1.4 Профили экспрессии генов как прогностический маркер РМЖ 22
1.4.1 Системы определения профиля экспрессии генов на основе ОТ-ПЦР 25
1.4.2 Системы определения профиля экспрессии генов на основе технологии микрочипов 33
1.5 Заключение 41
2. Материалы и методы 42
2.1 Клиническая характеристика исследуемых групп, описание используемых диагностических методов 42
2.2 Клинико-морфологическая характеристика исследуемых групп 44
2.3 Методика пробоподготовки и ОТ-ПЦР в настоящем исследовании 46
2.4 Краткая характеристика исследуемых генов 49
3. Результаты исследования 52
3.1 Анализ изменения экспрессии генов в зависимости от типа ткани 52
3.1.1 Сравнение морфологически неизмененной ткани (МНТ) и ткани рака молочной железы (РМЖ) 52
3.1.2 Анализ изменения экспрессии генов в ткани фиброаденомы молочной железы 54
3.1.3 Сравнение экспрессии генов в ткани фиброаденомы и рака молочной железы 55
3.1.4 Сравнение экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани при фиброаденоме и морфологически неизмененной ткани при раке молочной железы 64
3.2. Анализ экспрессии генов в зависимости от морфологических характеристик ткани в образцах рака молочной железы 66
3.2.1 Анализ экспрессии генов в зависимости от размеров опухоли 66
3.2.2 Анализ экспрессии генов в зависимости от наличия метастатических лимфоузлов и отдаленных метастазов (категория N и М по классификации TNM) 67
3.2.3 Анализ экспрессии генов в ткани РМЖ в зависимости от степени злокачественности, морфологии опухоли, статуса рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста HER2/neu 70
3.3 Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от экспрессии рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста HER2/neu в образцах рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования 77
3.4 Анализ экспрессии генов маркеров пролиферации и апоптоза в зависимости от направления изменения экспрессии гена рецепторов прогестерона 80
4. Обсуждение 84
Выводы 95
Практические рекомендации 97
Список литературы 98
- Изменение экспрессии некоторых генов адгезии и миграции при пролиферативных заболеваниях МЖ
- Клинико-морфологическая характеристика исследуемых групп
- Сравнение экспрессии генов в ткани фиброаденомы и рака молочной железы
- Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от экспрессии рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста HER2/neu в образцах рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является наиболее распространенным онкологическим заболеванием в женской популяции, составляя 20,5% от всех онкологических заболеваний (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2011). Одновременно достаточно высокими, до 70%, являются показатели выявляемое заболевания на ранних (I-II) стадиях, что позволяет использовать менее токсичные программы лечения (Харченко В.П., Рожкова Н.И., 2010). С другой стороны, излишне щадящая тактика в отношении онкологических больных связана с риском рецидивирования заболевания.
Выбор тактики лечения при раке молочной железы определяется сочетанием
факторов, описывающих такие особенности опухоли как размер образования, наличие
метастазов в регионарные лифоузлы, степень злокачественности, пролиферативная
активность, оцениваемая по уровню экспрессии белка КІ67 (Jalava P., et al., 2006) и т.д
(A. Goldhirsch, W. С. Wood, 2009). При этом, однозначными показаниями для
адьювантной химиотерапии принято считать большой размер опухоли (Т>5 см),
более 4 метастазов в регионарные лимфоузлы (N2-N3), высокая степень
злокачественности (G3) и высокая пролиферативная активность (экспрессия КІ67
более 30%), минимальные значения по данным критериям (Т<2 см, N0, G1,
Ki67<15%) представляют собой относительные показания для адьювантной
гормонотерапии. Однако при размере опухоли от 2.1 до 5 см, наличии метастазов в 1-
3 регионарных лимфоузлах (N1), 2 степени злокачественности (G2), экспрессии КІ67
16-30%енобходимость назначения адьювантной химиотерапии является
недоказанной. Таким образом, использование «классических» факторов прогноза не всегда позволяет адекватно выделить группу высокого риска рецидивирования.
В многочисленных исследованиях сказано, что исследование экспрессии одного или комплекса генов в ткани опухоли имеет независимое прогностическое значение (Chang, 2007, Cobliegh, 2005, Esteva, 2005, Gianni, 2005, Habel, 2006, Mina, 2006, Paik, 2004, и Paik, 2006). В частности, эксперты конференции StGallen 2011 признают, что использование профиля экспрессии генов OncotypeDX, в основе которого лежит оценка экспрессии мРНК 16 генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и клеточной дифференцировки, адекватно отражает биологическую гетерогенность рака молочной железы и может применяться для определения прогноза заболевания и рекомендации назначения химиотерапии (Gnant М, 2011). Таким образом, выявление закономерностей экспрессии генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в ткани доброкачественных и злокачественных образований может дать новые, более достоверные факторы прогноза и повысить эффективность дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований молочной железы.
Цель работы
Исследовать экспрессию комплекса генов, участвующих в процессах
пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных
взаимодействий в морфологически неизмененной ткани молочной железы при фиброаденоме и инвазивном раке молочной железы, и определить взаимосвязь их
экспрессии с клинико-морфологическими характеристиками доброкачественных и злокачественных опухолей.
Задачи исследования
Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при раке молочной железы
Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при фиброаденоме молочной железы
Провести сравнительный анализ экспрессии генов в образцах рака молочной железы в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли
Научная новизна
Количественно определена экспрессия мРНК 17 генов маркеров пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в неизмененной ткани молочной железы, в ткани фиброаденомы и рака молочной железы на различных стадиях заболевания. Изучена взаимосвязь относительного содержания мРНК исследуемых генов в ткани опухоли молочной железы с основными клинико-морфологическими особенностями опухоли. Впервые оценена связь уровня экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани с морфологическими особенностями рака молочных желез. Получены статистически значимые отличия экспрессии исследуемых генов в зависимости от типа опухоли, а также в зависимости от клинико-морфологических характеристик рака молочной железы. На основании определения и сравнения уровня экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR в ткани рака молочной железы разработан алгоритм, позволяющий выявлять опухоли, имеющие неблагоприятные молекулярно-биологические характеристики.
Научно-практическая значимость
В результате проведенного исследования оценена клиническая значимость и информативность определения уровня экспрессии мРНК комплекса генов в ткани фиброаденомы молочной железы и ткани рака молочной железы. Разработан алгоритм определения изменения направления экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR при раке молочной железы как дополнительный диагностический критерий в комплексной диагностики потенциально более злокачественных опухолей.
Положения, выносимые на защиту
-
Экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза, клеточных рецепторов и генов межклеточных взаимодействий в образцах инвазивного рака молочной железы значительно повышена по сравнению с морфологически неизмененной тканью и фиброаденомой.
-
В образцах инвазивного РМЖ при большом размере опухоли, наличии регионарных и отдаленных метастазов повышена экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза и генов межклеточных взаимодействий.
-
Активность процессов пролиферации и апоптоза в морфологически неизмененной ткани связана с уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu опухоли при раке молочной железы.
4. Сравнительная индивидуальная оценка экспрессии генов в образцах опухоли и морфологически неизмененной ткани дает дополнительную информацию для выявления потенциально более злокачественных опухолей.
Апробация материалов диссертации.
Материалы диссертации были доложены: на II Междисциплинарном форуме «Медицина молочной железы: на стыке специальностей», Москва в 2012 году; Worldwide Innovative Networking in personalized cancer medicine (WIN) 2012, Париж. Апробация работы прошла в ФГУ Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий 09 апреля 2012 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 в журналах, рецензируемых ВАК.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, трех глав, а также выводов и списка литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 12 отечественных и 220 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 14 рисунками.
Изменение экспрессии некоторых генов адгезии и миграции при пролиферативных заболеваниях МЖ
Одним из методов определения молекулярного фенотипа опухоли является определение экспрессии генов в ткани опухоли путем количественной оценки мРНК транскриптов. В основе определения экспрессии генов лежит количественное определение транскриптов матричной РНК (мРНК) в цитоплазме клетки. Матрицей для мРНК являются гены на молекуле ДНК, активность которых (частота транскрипции) отражается количеством мРНК молекул в клетке. Количество РНК-транскриптов в цитоплазме свидетельствует об уровне экспрессии гена и коррелирует с количеством кодируемого белка, повышение или снижение концентрации которого способно приводить к изменению функционального состояния клетки [35]. Материальной основой процесса являются технологии с использованием микрочипов или ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). Эти технологии широко описаны в литературе [14, 42, 139, 179] и мы не будем останавливаться на их технологической сути. Результатом исследования является определение количества транскриптов мРНК в материале; некоторые примеры подобных исследований представлены ниже. 1.3.1 Изменение экспрессии некоторых генов адгезии и миграции при пролиферативных заболеваниях МЖ
Матриксные металлопротеазы (ММР) являются поверхностными молекулами клетки и способны расщеплять элементы межклеточного матрикса [154], также молекулы принимают участие в активации/инактивации цитокинов [161, 206] и регулировании апоптоза [51, 77]. Однако основной их функцией является участие в процессах миграции и клеточной адгезии [64, 214]. Peihong S. исследовал экспрессию пт23, ММР-2, TIMP-2 (тканевой ингибитор ММР-2) при различных пролиферативных процессах в ткани молочной железы [167]. Автор установил достоверные отличия в экспрессии генов в исследуемых группах (р 0.05). В случае аденокарциномы экспрессия пт23 и TIMP-2 была низкой, а ММР2, напротив, высокой. Результаты исследования подтверждаются данными Wu Т.Т., который определил достоверно высокий уровень экспрессии ММР2 и ММР9 в образцах рака молочной железы по сравнению с окружающей опухоль нормальной тканью и фиброаденомой [225].
Активины являются факторами роста, контролирующими пролиферацию клетки [58, 131, 177]. Они относятся к суперсемейству трансформирующего фактора роста-(3 [132, 180]. Активины экспрессируются в клетках рака молочной железы высокой степени злокачественности и обладают антипролиферативной активностью, в частности блокируют клеточный цикл в стадии G0/G1 in vitro [34, 133]. Мишенью для активинов являются мембранные белки, обладающие серин-треонинкиназной активностью [121]. Причем транскрипционная активность различных единиц активина (а, (ЗА и (ЗВ) различна в норме и при раке молочной железы [114, 178]. В свою очередь, фоллистатин (FST) и фоллистатин-зависимый белок (FLRG) блокируют образование комплекса активин/серин-треонин киназа и дальнейший каскад реакций [69, 99, 124], что также справедливо для других представителей TGF-3 [88, 100, 102, 128, 189]. Bloise Е. и др. [30] исследовали экспрессию MPFQC И белка FST и FLRG в нормальной ткани (п=8) и при различных пролиферативных заболеваниях молочной железы (гиперплазия без атипии, п = 17, фиброаденома, п = 17, протоковый рак in situ, n = 10 и инвазивный протоковый рак, п = 15). Экспрессия обеих молекул наблюдалась во всех исследуемых группах, как на уровне мРНК, так и на уровне белка; для мРНК и белка FST было отмечено повышение экспрессии в строме фиброаденомы (р=0.033, р=0.032, соответственно). FLRG характеризовался более высокой экспрессией в цитоплазме и ядре эпителиальных клеток инвазивного рака по сравнению с нормальной тканью.
Другим геном, изменение экспрессии которого влияет на процессы клеточного цикла и пролиферацию, является Ets2 [83, 144, 228]. Кодируемый им фактор транскрипции контролирует активность теломераз путем изменения экспрессии гена обратной транскриптазы теломеразы (hTERT) [79, 95, 116]. С помощью RT-PCR Buggy Y. с коллегами установили, что степень экспрессии значительно повышена при раке, в отличие от нормальной ткани (р=0.006) [33].
Роль индуктора злокачественной прогрессии играет ген c-kit [103], кодирующий белок CD117 [21, 26], участвующий в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток [85, 109]. Kondi-Pafiti А. исследовал экспрессию гена при пролиферативных заболеваниях молочной железы: фиброзно-кистозной мастопатии, склерозирующем аденозе, фиброаденоме, атипической дольковой гиперплазии, протоковом/дольковом раке in situ и инвазивной аденокарциноме. Высокая экспрессия (85,3%) была отмечена при доброкачественных пролиферативных заболеваниях (фиброзно-кистозная мастопатия, склерозирующий аденоз, фиброаденома), в случае неинвазивной и инвазивной аденокарциномы экспрессия была значительно ниже и колебалась в пределах 20-43%. Автор считает высокую экспрессию c-kit признаком доброкачественного фенотипа опухоли [122]. К аналогичному заключению пришел Yared М.А. [230].
Клинико-морфологическая характеристика исследуемых групп
В исследование было включено 38 пациенток с фиброаденомой (ФА) молочной железы и 57 больных раком молочной железы (РМЖ) I-IV стадии. А также 95 образцов неизмененной ткани молочной железы. Таким образом, всего было исследовано 190 образцов ткани.
Все пациентки проходили обследование и получали лечение в хирургических отделениях ФГУ Российского Научного Центра Рентгенрадиологии. В период с ноября 2008 по июль 2009 года.
Стандартный минимальный объем предоперационного обследования включал проведение маммографии обеих молочных желез в двух проекциях, ультразвуковое исследование молочных желез, зон регионарного лимфогенного метастазирования (подмышечных, надключичных и подключичных лимфатических узлов) и брюшной полости, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, а также комплекс дополнительных методов исследования (КТ, МРТ, остиосцинтиграфия и т.д.) по показаниям. Рентгенологическое исследование проводили на маммографической установке "MAMMODIAGNOST US" фирмы "Philips". Ультразвуковое исследование аппарате «SONOLINE Elegra» фирмы и «Vivid 4» фирмы GE.
Морфологическое исследование опухоли включало следующие этапы: гистологическое исследование опухоли и блока регионарных лимфоузлов (в случае рака молочной железы). В случае рака молочной железы проводилось иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов стероидных гормонов (эстрогенов, прогестерона), эпидерманьного фактора роста HER2/neu, а также цитогенетический анализ амплификации гена с-егЬВ2 методом FISH. предварительно фиксированный в 10% нейтральном буферном формалине и заключенный в парафин. СрезДля проведения иммуногистохимического исследования использовали материал, ы толщиной 3-5 мкм после депарафинирования в трех сменах ксилола по 15 минут, двух сменах этанола (100% и 96% ) и регидратации нагревали для восстановления антигенных свойств при температуре 95 С.
Время нагревания для антител к рецепторам эстрогена (N 1575 DAKO, Дания), прогестерона (N 1630 DAKO, Дания) составляло 20 минут или 40 минут для с-егЬВ-2 (1:400, А0485 DAKO, Дания) в растворе для восстановления антигенных свойств с рН 6,0 (S 1700, DAKO, Дания).
После остывания в течение 20 минут при комнатной температуре и 3 минут промывки в дистиллированной воде блокировали эндогенную пероксидазу 3% раствором перикиси водорода (S 2001, DAKO, Дания) в течение 5 минут.
После нанесения первичных антител препараты инкубировали на водяной бане в холодильнике при 4 С в течение 12ч. На всех этапах для промывки срезов использован стандартный раствор трис-буфера (S 3001, DAKO, Дания). На втором этапе использовали проявочную систему DAKO REAL EnVision, Rabbit/Mouse. В качестве хромогена использован диаминобензидин. Данная методика соответствует ручной проводке образцов. При окрашивании в автостейнере время инкубации с антителами соответствуют выбранным протоколам. Доокрашивание исследуемых образцов выполняли раствором гематоксилина Mayer в модификации Lillie (S3309, DAKO, США). После дегидратации в этаноле, ксилоле срезы заключали в бальзам и просматривали в световом микроскопе. Результаты иммуногистохимических реакций оценивались полуколичественным способом. Учитывался как характер окрашивания, так и его интенсивность.
Для определения амплификации гена с-егЬВ2 в образцах ткани рака молочной железы использовался метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с применением ДНК зондов PathVysion HER-2 (Abbott). Анализ проводился по протоколу, рекомендованному фирмой производителем ДНК зондов.
В группу больных с ФА вошли пациентки в возрасте от 20 до 59 лет, средний возраст которых составлял 35,8 ±13 лет. По морфологическим характеристикам в 27 из 38 случаев (71%) фиброаденома имела смешанное строение, в 7 из 38 (18,4%) - интраканаликулярная, в 4 из 38 (10,6%) -интраканаликулярная. В 83%) опухоль локализовалась в верхнее-наружном квадранте железы. В группу больных раком молочной железы вошли больные в возрасте от 36 до 87 лет, средний возраст составил 57,2±11,6 лет. В 69%) опухоль локализовалась в верхнее-наружном квадранте железы. Другие локализации были распределены примерно в равной пропорции, составляя от 4% (при локализации опухоли в нижнее-внутреннем квадранте и
Сравнение экспрессии генов в ткани фиброаденомы и рака молочной железы
Мы провели анализ уровня экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани молочной железы в зависимости от уровня экспрессии рецепторов в ткани опухоли. Были обнаружены достоверные отличия в экспрессии генов в окружающей опухоль нормальной ткани при сравнении таких фенотипических характеристик опухоли как статус рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu.
В том случае, если опухоль по данным ИГХ экспрессирует рецепторы эстрогена, в морфологически неизмененной ткани наблюдается более низкий уровень пролиферативной активности: снижение экспрессии маркеров пролиферации KI67 (10,92 о.е. при РЭ+ фенотипе опухоли по сравнению с 29,31 о.е. при РЭ-; Р=0,0039), STK15 (37,72 о.е. по сравнению с 86,26 о.е.; Р=0,0244) и CCNB1 (8,73 o.e. по сравнению с 16,38 o.e.; P=0,0032) при отсутствии достоверных отличий в уровне экспрессии мРНК самих рецепторов (Таблица 3.13). Таблица 3.13. Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от уровня рецепторов эстрогена в ткани рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования. Ген пРЭ- пРЭ+ ! Среднее РЭ- Среднее РЭ+ Р KI67 19 38 : 29,31 10,92 0,003994 STK15 19 38 86,26 . 37,72 0,024436 CCNB1 19 38 16,38 8,73 0,003210 ESR 19 38 і 116,13 195,28 0,195407 PRG J_9 38 : 1748,64 2147,13 0,565411 Аналогичная картина наблюдается в неизмененной ткани при ПР положительном фенотипе опухоли (таблица 3.14): снижение экспрессии КІ67 (12,31 о.е. при ПР+ фенотипе по сравнению с 25,18 о.е. при ПР-; Р=0,0430), STK15 (36,21 о.е. по сравнению с 84,22 o.e.; Р=0,0226), CCNB1 (9,36 о.е. по сравнению с 14,57 о.е.; Р=0,0442), ингибитора апоптоза BIRC5 (13,36 о.е. по сравнению с 44,86 о.е.; Р=0,0166), а также С-егЬВ2 (18,93 о.е. по сравнению с 42,63 о.е.; РЮ,0736) и его гомолога GRB7 ( 282,78 о.е. по сравнению с 585,18 о.е.; Р=0,0160). Достоверных отличий уровня экспрессии мРНК самих рецепторов прогестерона не получено.
Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от уровня рецепторов прогестерона в ткани рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования Ген пРП- пРП+ Среднее РП- Среднее РП+ р КІ67 21 36 ! 25,18 ! 12,31 ! 0,043056 57X75 21 36 і 84,22 : 36,21 ; 0,022675 CCNB1 21 36 ; 14,57 9,36 0,044246 BIRC5 20 35 44,86 13,36 : 0,016630 ESR 21 36 142,54 184,27 0,487281 PRG 21 36 1491,92 2319,02 0,219651 C-erbB2 _1L 36 42,63 18j93 0,073629 GRB7 21 36 585,18 282,78 0,016074 Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани относительно интенсивности окрашивания клеток опухоли антителами к HER2/neu проводился в группах +1 и +3. В группе +3 повышена экспрессия ингибитора пролиферации PTEN (17,9 о.е при HER2/neu 3+ по сравнению с 10,7 о.е. при HER2/neu 1+; Р=0,0257) и активатора каспаз NDRG1 (1116,07 о.е. по сравнению с 441,82 о.е.; Р=0,0011). Экспрессия мРНК самого С-егЬВ2 (75,3 о.е. по сравнению с 16,21 о.е.; Р=0,0145) и его гомолога GRB7 (870,4 о.е. по сравнению с 292,97 о.е.; Р=0,009) также была повышена в группе HER2/neu+3. А экспрессия маммаглобина была, наоборот, снижена в этой группе (8949,7 о.е. при HER2/neu 3+ по сравнению с 27807,21 о.е. при HER2/neu 1+; Р=0,1019) (Таблица 3.15).
Таблица 3.15. Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от экспрессии эпидермального фактора роста HER2/neu в образцах рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования Ген n HER2/neu +1 nHER2/neu 1+3 I Среднее HER2/neu +1 Среднее HER2/neu +3 P PTEN 24 8 1 10,71 17,911 0,025773 NDRG1 24 .___«_ J 441,82 1116,07 0,001102 HER-2/neu 24 8 ] 16,21 75,283 0,014523 GRB7 24 8 J 292,97 870,396 0,009060 MGB1 24 8 ! 27807,21 8949,720 0,101950 Согласно полученным результатам активность генов-маркеров пролиферации и ингибиторов апоптоза в морфологически неизмененной ткани ниже в случае рецептор-положительного фенотипа опухоли. А в случае НЕР\2/пеи-положительного фенотипа опухоли (3+) в окружающей ткани наблюдается повышение активности ингибиторов пролиферации.
Полученные отличия экспрессии генов пролиферации и апоптоза в морфологически неизмененной ткани позволяют предположить, что экспрессия рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста является фенотипической особенностью не только самой опухоли, но ткани молочной железы в целом, или наблюдаемые изменения экспрессии в морфологически неизмененной ткани являются проявлением системного характера онкологического заболевания. Отсутствие достоверных отличий экспрессии мРНК ESR и PGR в исследуемых группах, а также то, что в 79% (45 из 57 случаев) женщины в исследуемых группах находились в постменопаузе, свидетельствует о том, что данные отличия экспрессии не являются следствием влияния менструального цикла.
Отсутствие статистически значимых отличий экспрессии генов пролиферации и апоптоза в образцах рецептор-позитивных и рецептор-негативных РМЖ, и наличие подобных отличий в морфологически неизмененной ткани при сравнении по одним и тем же критериям, может свидетельствовать о наличии связи между активностью процессов пролиферации и апоптоза в ткани молочной железы и развитием опухоли с определенным фенотипом. Пролиферативная активность окружающей морфологически неизмененной ткани в случае рецептор-позитивных опухолей ниже по сравнению с неизмененной тканью в случае рецептор-негативных опухолей. Таким образом, исследование пролиферативной активности морфологически неизмененной ткани при раке молочной железы может дать дополнительную информацию в оценке пролиферативной и апоптотической активности ткани молочной железы при наличии злокачественной опухоли, а маркерами активности могут выступать именно рецепторы стероидных гормонов и HER2/neu.
В настоящем исследовании мы обнаружили, что при сравнительной индивидуальной оценке экспрессии мРНК ESR, PGR и С-егЬВ2 в клетках рака молочной железы уровень их экспрессии может как снижаться, так и повышаться относительно значений в морфологически неизмененной ткани. При дальнейшем анализе экспрессии генов-маркеров пролиферации, апоптоза и межклеточных взаимодействий наиболее интересные результаты были получены при сравнительной оценке их экспрессии в опухолях, в которых экспрессия мРНК прогестерона повышается (прогестерон-положительные; PGR+ опухоли) относительно уровня экспрессии в морфологически неизмененной ткани и в опухолях, в которых экспрессия прогестерона снижается (прогестерон-отрицательные; PGR- опухоли) относительно уровня экспрессии в неизмененной ткани.
Отличия между группой PGR+ (М=7048,1. о.е. ± 7346,5 о.е), (М±т, где М-среднее значение, т - стандартное отклонение), и группой PGR- (М=648,3 о.е.±880,07 о.е.) по сравнению со значения в морфологически неизмененной ткани (М=2014,3 о.е. ± 2437,7 о.е.) являются статистически значимыми (Р 0,009) (Рисунок 3.13).
Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от экспрессии рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста HER2/neu в образцах рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования
В целом динамика экспрессии генов пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий соответствует клинико-морфологическим изменениям, наблюдаемым при развитии и прогрессировании рака молочной железы. Однако не для всех характеристик опухоли, рутинно определяемых в клинической практике, динамика экспрессии генов коррелировала с изменением значения маркера.
Несколько интересных наблюдений было отмечено при анализе экспрессии генов в образцах морфологически неизмененной ткани. На наш взгляд интерпретация полученных результатов в первую очередь интересна с позиций взаимодействия опухоли с окружающим матриксом. Существование подобного рода взаимодействий является известным фактом, однако законы, по которым протекает этот процесс неизвестны [46, 173, 191]. В нашем исследовании были обнаружены достоверные отличия экспрессии генов в неизмененной ткани при сравнении таких фенотипических характеристик опухоли как статус рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu. Если опухоль по данным ИГХ экспрессирует рецепторы эстрогена, в морфологически неизмененной ткани наблюдается более низкий уровень пролиферативной активности: снижение экспрессии маркеров пролиферации KI67, STKJ5 и CCNB1 при отсутствии достоверных отличий в уровне экспрессии мРНК самих рецепторов. Аналогичная картина наблюдалась в неизмененной ткани при прогестерон-позитивном по данным ИГХ фенотипе опухоли: снижение экспрессии KJ67, STK15, CCNB1, ингибитора апоптоза BIRC5, а также С-егЬВ2 и его гомолога GRB7. Это позволило нам предположить, что пролиферативная и апоптотическая активность окружающей опухоль ткани отличается в зависимости от молекулярных особенностей опухоли, т.е. реагирует на фенотип опухоли. Это обстоятельство позволило предположить, что оценка взаимоотношения экспрессии генов в опухоли и морфологическит неизмененной ткани позволит создать систему оценки степени агрессивности молекулярного фенотипа опухоли. При сравнительном анализе экспрессии мРНК рецептора прогестерона в ткани опухоли и морфологически неизмененной ткани позволил выявить следующую закономерность: в ряде случаев уровень экспрессии мРНК рецептора прогестерона в ткани опухоли был ниже, чем в морфологически неизмененной ткани у одного больного, тогда как в других опухолях, наоборот, уровень экспрессии был выше по сравнению морфологически неизмененной тканью у одного больного. При этом, в 30% случаев данная оценка не совпадала с результатами иммуногистохимического анализа. После того, как образцы рака молочной железы I-II стадии были классифицированы как прогестерон-позитивные и прогестерон-негативные, анализ экспрессии генов позволил выделить образцы, характеризующиеся повышенным уровнем экспрессии генов-маркеров пролиферации и генов-ингибиторов апоптоза - агессивный молекулярный фенотип. Следует отметить, что подобных результатов не удалось добиться при использовании "классических" факторов прогноза.
В результате проведенного анализа литературы и сравнения с результатами проведенного нами исследования можно сделать следующие заключения: во-первых, изменение контроля пролиферативной активности эпителия протоково-дольковой единицы, вероятно связано с ремоделированием не только активности рецепторов эстрогена, но и прогестерона, что подтверждается появлением положительной корреляции с экспрессией циклина В в образцах неизмененной ткани при раке молочной железы, во-вторых, морфологические изменения при раке молочной железы являются следствием нарушения биологического контроля пролиферации, что происходит задолго до появления морфологических изменений, и именно поэтому морфологической оценки локальной распространенности опухоли явно недостаточно для прогнозирования поведения опухоли, ее пролиферативного и метастатического потенциала. Также не исключено, что оценка этого потенциала для самой опухоли не является столь значительной, так как, принимая во внимание теорию опухолевого поля, а также доказательства существования различных механизмов взаимодействия системы опухоль - матрикс, необходимо учитывать возможности окружающей ткани определять поведение уже существующей опухоли или возможность образования новой.
![Клинико-эпидемиологические особенности дисгормональных заболеваний и рака молочных желез у мужчин в процессе адаптации к условиям среды обитания [Электронный ресурс]](/i/i/4607/176829.png "Клинико-эпидемиологические особенности дисгормональных заболеваний и рака молочных желез у мужчин в процессе адаптации к условиям среды обитания [Электронный ресурс] Мельников Алексей Александрович")