Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение молекулярных механизмов канцерогенеза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) – одна из приоритетных задач современной онковирусологии. ВЭБ относится к семейству герпесвирусов, имеет убиквитарный характер распространения в человеческой популяции и является этиологическим агентом ряда злокачественных заболеваний человека, чем обусловлен большой интерес к его изучению. Показано, что ведущую роль в возникновении лимфомы Беркита, лимфомы Ходжкина, недифференцированного рака носоглотки и других, ассоциированных с вирусом заболеваний, играет активация его латентных генов, ответственных за трансформацию и иммортализацию инфицированных этим вирусом клеток [Robertson and Kieff, 1995; Young and Rickinson, 2004].
Среди генов латентной инфекции особое место занимает LMP1. Продукт этого гена, латентный трансмембранный белок 1 (LMP1), является конститутивно активированным аналогом клеточного рецептора фактора некроза опухоли TNF-R1 [Mosialos et al., 1995]. Активируя различные клеточные сигнальные каскады, LMP1 действует как вирусный онкоген, осуществляя трансформацию B-лимфоцитов человека и фибробластов грызунов [Wu et al., 2006; Shair et al., 2007]. Другой не менее значимой уникальной особенностью этого гена является его ярко выраженный полиморфизм. Известно, что различные варианты ВЭБ, несущие специфические мутационные перестройки в LMP1, персистируют в географически ограниченных регионах и часто с их присутствием связывают увеличение доли ВЭБ-ассоциированных заболеваний как, например, недифференцированного рака носоглотки в странах Юго-Восточной Азии [Sandvej et al., 1997; Edwards et al., 1999; Walling et al., 1999].
Установлено, что нуклеотидные замены и делеции гена LMP1, с которыми принято связывать повышение трансформирующей способности кодируемого им белка, наиболее часто выявляются в его С-концевой терминальной области. Ранее также показано, что эти события приводят к нарушениям в аминокислотных последовательностях LMP1, которые служат сайтами связывания этого вирусного белка c белком-рецептором -TrCP/HOS, комплекса SCF (skp1 – Cullin1 – F-box) E3 убиквитин лигазы (SCF-TrCP/HOS) – системы целенаправленной деградации белков. В результате указанных событий наблюдается усиление трансформирующей активности LMP1, что показано в экспериментах in vitro [Tang et al., 2003]. Ряд выявляемых мутаций в этом гене, возможно, ответственен за понижение цитотоксичности, иммуногенности и времени полужизни LMP1, что позволяет предположить их важную роль в повышении его трансформирующего потенциала.
Изучение функциональной значимости наиболее часто встречающихся мутаций в данном гене, определение их роли в изменении ключевых сигнальных каскадов клетки представляется актуальной научной и практической задачей, решение которой, вероятно, позволит определить важность этих генетических перестроек в усилении процесса канцерогенеза in vivo, опосредованного этим вирусом. Полученные данные, в свою очередь, позволят расширить наши знания и приблизиться к пониманию механизмов ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза и сопутствующих ему опухолевых заболеваний человека.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли часто выявляемых мутаций в CTAR-доменах гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр в модификации ключевых сигнальных путей клетки.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Создать генетические конструкции на основе ретровирусного вектора с использованием коллекции мутантов полноразмерного гена LMP1, имеющих нарушения в -TrCP/HOS-мотивах, ответственных за взаимодействие белка с убиквитин-протеосомальной системой клетки;
-
Получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие продукты исследуемых вариантов гена на базе клеток Mv-1-Lu, Rat-1, NRK-49F, трансформированных LMP1 ретровирусными конструкциями;
-
Провести анализ вариантов LMP1 с мутациями, инактивирующими HOS-мотивы, на их способность активировать в полученных клеточных линиях ряд ключевых сигнальных путей, включая NF-kB, AP-1 и PI3K-Akt;
-
Проверить способность исследуемых вариантов гена вызывать индукцию окиси азота (NO) в инфицированных ими клетках, а также определить форму NO-синтазы, что имеет принципиальное значение для функциональной активности LMP1.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Убиквитин-протеосомальная система целенаправленной деградации клеточных белков, как известно, имеет первостепенное значение в таких жизненно важных процессах в клетке, как регуляция клеточного цикла, дифференцировка, развитие клеточного ответа к стрессовым факторам и ряду других. За последние годы неоднократно показано взаимодействие различных вирусных белков с компонентами убиквитин-протеосомальной системы, в том числе и латентных белков герпесвируса Эпштейна-Барр. Однако процесс взаимодействия LMP1 с белком-рецептором -TrCP/HOS E3 убиквитиновой лигазы все еще остается мало изученным. Известно, что нарушение связывания убиквитинового комплекса SCF-TrCP/HOS с молекулой LMP1 приводит к усилению трансформирующей активности этого белка in vitro, и нарушению регуляции активности NF-kB, значение которого в процессах клеточной трансформации активно изучается в последние годы.
В данной работе впервые показана роль конкретных мутаций исследуемого гена в нарушении сигнальных каскадов клетки, их участие в индукции активных форм азота, а также влияние на структурные компоненты цитоскелета. Для исследования внутриклеточных изменений, вызванных отдельными мутациями в гене LMP1, а также их сочетаниями нами создана чувствительная экспериментальная модель. На базе этой модели осуществляли анализ функциональной значимости наиболее часто встречающихся мутаций гена LMP1 во внутриклеточных процессах.
Практическое значение исследования состоит в изучении тонкого механизма усиления трансформирующей активности мутантных молекул LMP1, опосредованной влиянием этого белка на регуляцию сигнальных путей клетки. Данные, полученные в ходе этого исследования, будут иметь принципиальное значение в поиске подходов эффективной профилактики заболеваний, вызываемых герпесвирусом Эпштейна-Барр. Исследование сложных взаимодействий белка LMP1 с убиквитин-протеосомальной системой является ключевым в понимании проблемы деградации «опухолевых» форм белка в инфицированной клетке, что также имеет большое значение для поиска новых терапевтических подходов при лечении вызываемых вирусом патологий.
Апробация работы
Диссертация апробирована 18 июня 2008 года на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, биохимии опухолей, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на 16-ой и 17-ой международных конференциях “AIDS, Cancer and Public Health” 2007, 2008 (Санкт-Петербург, Россия), Всероссийской научно-практической конференции “Отечественные противоопухолевые препараты” 2007, 2008 (Москва, Россия), 8-ой международной школе-конференции “Immunology and viral infection” 2007 (Москва, Россия), 5-ой Российско-немецкой конференции “Human herpesvirus infections” 2008 (Москва, Россия), третьем европейском конгрессе по вирусологии 2007 (Нюрнберг, Германия), 20-ом симпозиуме Европейской ассоциации по изучению рака (EACR) 2008 (Лион, Франция).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи и 11 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 рисунков и 1 таблицу. Состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список используемой литературы содержит 230 литературных источников, из них 1 отечественный и 229 зарубежных.
