Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 12
Глава 1. Характеристика видов клеточной гибели 12
Глава 2. Белки, контролирующие процесс апоптоза в клетке 15
Мембранные белки:
CD95(Fas/APO-l) 15
CD243(MDR1) 24
Внутриклеточные белки: белки семейства Вс1~2 30
Р53 44
Глава 3. Фрагментация ДНК 49
ЧАСТЬ II. Результаты собственных исследований 60
Глава 1. Материалы и методы 60
Глава 2. Исследование экспрессии поверхностного рецептора CD95 на нормальных и лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки 78
Глава 3. Исследование экспрессии белка CD243 при гемобластозах и в норме 106
Глава 4. Исследование экспрессии белков семейства Bcl-2 в норме и на лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки 123
Глава 5. Изучение экспрессии Р53 в норме и на лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки 147
Глава 6. Изучение экспрессии Кі-67 в норме и на лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки 157
Глава 7. Исследование спонтанной и индуцированной фрагментации ДНК лейкозных клеток 163
Глава 8. Обсуждение результатов 188
Выводы 228
Список литературы 230
- Характеристика видов клеточной гибели
- Белки, контролирующие процесс апоптоза в клетке
- Исследование экспрессии поверхностного рецептора CD95 на нормальных и лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки
- Исследование экспрессии белков семейства Bcl-2 в норме и на лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки
Введение к работе
Актуальность темы
Гемопоэтические клетки развиваются из заложенных в онтогенезе стволовых кроветворных клеток и в процессе созревания проходят длинный путь дифференцировки. Процесс этот не хаотичен. В норме созревает ровно столько клеток, сколько их необходимо для поддержания гомеостаза (Погорелов В.М. и Козинец Г.И., 1995; Ярилин А.А., 2004). Поддержание гомеостаза в многоклеточном организме контролируется не только клеточной пролиферацией и дифференцировкой, но также клеточной смертью. Воспринимая различные сигналы, клетка или продолжает дифференцировку, или останавливается на некоторое время в процессе дифференцировки, или погибает (Grossi СЕ. etal., 2000; Opferman J.Т. et.al., 2003; Ярилин А.А., 2004). Программированная клеточная смерть (апоптоз) является важным механизмом поддержания корректного числа клеток в многоклеточном организме, обеспечивая его гомеостаз, а так же элиминацию клеток с генетическими повреждениями и клеток в терминальной стадии дифференцировки (Krammer Р.Н., 2000).
Нормальная дифференцировка гемопоэтических клеток представляет собой перманентный процесс, в ходе которого отдельные этапы протекают очень быстро, и, соответствующие типы клеток представлены в ничтожно малых количествах. При гемобластозах клеточная дифференцировка может быть «заморожена» на отдельных этапах и количество клеток, находящихся на определенном этапе созревания непропорционально велико в результате дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом.
В норме клетки миелоидного ряда проходят полное созревание в костном мозге, затем попадают в периферическую кровь в виде гранулоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, моноцитов. Клетки лимфоидного направления дифференцировки в незрелом состоянии покидают костный мозг и мигрируют в лимфатические узлы, селезенку (В-клетки), тимус (Т-клетки), где осуществляется их дальнейшая селекция и дифференцировка и
7 лишь, затем начинают циркуляцию в периферической крови. В периферических лимфоидных органах на антигензависимой стадии дифференцировки В-лимфоцитов большинство клонов погибают по механизму апоптоза. В процессе созревания кортикальных и медулярных тимоцитов, селекция Т-клеток так же осуществляется с помощью апоптоза.
При этом узловые точки кроветворения находятся под контролем так называемых «мастер-генов». Для миелоидного и лимфоидного дифференцировочных направлений функционируют либо свои, специфичные, либо сочетание «мастер-генов» более общего характера. При активации или инактивации «мастер-гена», обычно стоящего в самом начале дифференцировки клеточной линии, возникает острый лейкоз, в то время как активация гена, контролирующего пролиферацию или апоптоз, приводит к хронической форме лимфопролиферативного заболевания (Абелев Г.И., 2000). В процессе дифференцировки выделяются дискретные этапы созревания клеток, которые четко отделяются друг от друга по генетическим, морфологическим, цитохимическим и иммунологическим характеристикам. Иммунологические методы позволяют определить гетерогенность в пределах морфологически однородных популяциях клеток, относящихся к разветвленной иерархии гемопоэтических клеток (Глузман Д.Ф., 1998).
Опухоли гемопоэтической системы представляют собой уникальный
пример сохранения клетками нормального дифференцировочного статуса в
сочетании с опухолевой трансформацией, для которой характерны
блокирование специфической дифференцировки, стимуляция пролиферации,
подавление апоптоза. Одной из причин возникновения
лимфопролиферативных заболеваний, является нарушение реализации программы апоптотической гибели, начиная от клеток-предшественников в костном мозге до зрелых клеток периферической крови.
Клетки системы кроветворения определенного дифференцировочного статуса различаются по степени чувствительности к химиопрепаратам, и, соответственно, происходящие из них новообразования имеют различную
8 лекарственную устойчивость. До недавнего времени диагностика, и прогноз течения заболевания основывались только на выяснении линейной принадлежности и уровня дифференцировки лейкозных клеток, т.е. на иммунофенотипировании с помощью моноклинальных антител, однако сегодня этих данных уже недостаточно. Для выявления агрессивности лейкоза и назначения адекватных схем терапии проводится оценка экспрессии и функциональной активности молекулярно-биологических параметров опухолевых клеток. К ним относятся маркеры, локализованные на цитоплазматической мембране - CD95 и CD243, а также внутриклеточные белки, локализованные на митохондриях и ядре клеток - Вс1-2, Вах, р53, Ki-67.
Молекулярные механизмы апоптоза стали в последние годы предметом интенсивных исследований, однако большинство этих исследований выполнено in vitro на клеточных моделях, где отсутствуют регуляторные механизмы, характерные для целостного организма in vivo. Актуальность данной проблемы определяется также взаимосвязью нарушений регуляции процессов программированной гибели клеток с патогенезом целого ряда заболеваний (Shimazaki К. et.al., 2000).
Феномен апоптоза рассматривают как специфическую реакцию клеток на действие различных факторов экзо- и эндогенной природы. Первыми могут выступать различного рода воздействия (радиация, токсические агенты, гипер- и гипотермия, образование свободных радикалов и др.), вызывающие «генетический стресс» клеток. К регуляторным факторам эндогенной природы относят факторы роста, цитокины, гормоны, белки из семейства TNF со своими специфическими рецепторами (Schulze-Osthoff К. et al, 1998; Peter М.Е and Krammer P-H. 1998). Установлено, что многие противоопухолевые агенты, такие как ингибиторы топоизомераз I и II, ДНК-активные препараты, гормоны действуют, индуцируя апоптоз клеток-мишеней. (Dive С. et al., 1991; Hannun Y. 1997; Makin G. et al., 2000).
Открытие трансмембранного CD95 рецептора и его лиганда (CD95L) позволило по-новому взглянуть на молекулярные механизмы лекарственно-индуцированного апоптоза. Взаимоотношения компонентов сигнальных путей CD95/CD95L- и лекарстведно-индуцированного апоптоза может иметь не только фундаментальное, но и практическое значение в разрешении проблемы резистентности опухолевых клеток. Поэтому изучение роли CD95 - рецепторно-лигандной системы является актуальной и перспективной задачей в поиске новых методов и средств противоопухолевой терапии.
С другой стороны, к возникновению и распространению опухолевого процесса могут приводить мутации онкогенов и генов опухолевых супрессоров. Эти изменения могут также снижать эффективность противоопухолевой терапии.
Современные методы лабораторных исследований позволяют не только регистрировать апоптоз опухолевых клеток, вызванный действием противоопухолевых препаратов, но и получать данные о молекулярных механизмах внутриклеточной трансдукции апоптотического сигнала, и, таким образом, способствовать более глубокому пониманию патогенеза заболеваний, совершенствованию дифференциальной и молекулярной диагностики для выбора наиболее эффективной стратегии противоопухолевой терапии.
Цель работы
Цель работы: исследовать и оценить прогностическое значение экспрессии белков, регулирующих апоптоз, на различных этапах дифференцировки нормальных и злокачественных гемопоэтических клеток человека.
10 Задачи исследования
Исследовать экспрессию мембранных белков CD95, CD243 на лимфоидных и миелоидных клетках различных этапов созревания.
Исследовать экспрессию внутриклеточных белков Bcl-2, р53, КІ-67 на лимфоидных и миелоидных клетках различных этапов созревания.
Изучить коэкспрессию онкобелков и дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека на лейкозных клетках и в норме.
Изучить уровень спонтанной и индуцированной фрагментации ДНК клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки.
Определить клинико-диагностическую значимость экспрессии гликопротеидов, регулирующих апоптоз.
Научная новизна
Впервые проведена субпопуляционная оценка экспрессии белков-регуляторов апоптоза на различных этапах созревания нормальных и опухолевых клеток лимфоидного и миелоидного направлений дифференцировки с применением модельной системы злокачественных заболеваний гемопоэтической природы.
Получены данные, указывающие на то, что экспрессия CD95 является маркером определенного этапа дифференцировки гемопоэтических клеток. Выявлены различия экспрессии антигена CD95 в процессе дифференцировки В-клеток: на ранних этапах созревания (ОЛЛ) белок экспрессируется, при ХЛЛ он отсутствует. CD95 коэкспресирован с антигеном CD34 и антигенами ранних этапов миелоидной дифференцировки.
Дана оценка роли CD243 в процессе развития ХМЛ и при созревании лимфоидных клеток.
Выявлены различия в экспрессии Вс1-2 на этапах лимфоидной дифференцировки. Белок Вс1-2 отсутствовал при заболеваниях, соответствующим стадиям ранних В-клеток, и на стадии плазматических клеток. Высокая экспрессия Вс1-2 обнаружена в лейкозных клетках
11 периферической крови больных В-ХЛЛ независимо от стадии развития заболевания.
Определены количественные показатели фрагментации ДНК лейкозных клеток периферической крови и костного мозга in vivo до лечения и в процессе терапии.
Сформулировано представление о значении и месте различных механизмов апоптоза в процессе дифференцировки кроветворных клеток человека.
Научно-практическая значимость
В ходе работы показано прогностическое значение экспрессии поверхностных и внутриклеточных онкомаркеров при ряде гемобластозов человека, что свидетельствует о целесообразности их определения при проведении иммунофенотипирования в комплексе с существующими параметрами. Разработанные подходы определения субпопуляционной экспрессии маркеров апоптоза могут быть использованы в клинической практике при выборе тактики лечения и назначения адекватных схем терапии. Предлагаемые проточно-цитофлуориметрические методы идентификации апоптоза клеток крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями могут быть рекомендованы для мониторинга качественной и количественной оценки эффективности назначаемой терапии. Исследование открывает перспективы изучения регуляции апоптоза при различных заболеваниях гемопоэтической природы в научных учреждениях системы РАМН и МЗ РФ.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Характеристика видов клеточной гибели
Молекулярные механизмы гибели клеток исследуются уже более 30 лет. Одной из причин такого внимания является причинно-следственная взаимосвязь тяжелых заболеваний с нарушениями программы клеточной гибели, при которых клетки либо перестают погибать и тогда возможно возникновение опухолей, либо гибель захватывает избыточное число клеток, что, в свою очередь, приводит к патологической дегенерации тканей (атеросклероз, болезнь Альцгеймера, аутоиммунные заболевания, СПИД).
На сегодняшний день принято различать понятия «клетка погибающая» или «клетка угасающая» и «клетка мертвая». Для обозначения этих различий используется несколько терминов, которые характеризуют морфологические и биохимические изменения клетки и представлены в таблице 1.
Более того, для обозначения биологических процессов, ассоциированных с различными морфологическими, биохимическими и молекулярными изменениями, которые предрасполагают, предшествуют и сопровождают клеточную смерть, а также определяют последствия и реакцию ткани на клеточную смерть, предложили новый термин «некробиология клетки» (Darzynkiewicz Z. et.al., 1997).
Аутофагия или лизосомная клеточная смерть - это деградация клеточных компонентов в пределах интактных умирающих клеток с формированием аутофагических вакуолей (аутофагосом).
Морфологическими характеристиками аутофагии являются вакуолизация, а так же деградация цитоплазматических компонентов с незначительной конденсацией хроматина (Bursch W., 2001). В аутофагосомах и лизосомах перевариваются практически все мембранные органеллы. Активированные нуклеазы фрагментируют ДНК ядра, но не на олигонуклеосомные фрагменты, как при апоптозе. В конечном итоге остается клеточный дебрис -остаток клетки, окруженный цитоплазматической мембраной, который в условиях in vivo фагоцитируется макрофагами и соседними эпителиальными клетками. Аутофагическая гибель развивается преимущественно в непролиферирующих клетках (Go-фаза и терминальная дифференцировка) (Gozuacik D. and Kirachi А., 2004).
Онкоз - представляет собой предетальный путь, сопровождающийся разбуханием самой клетки и клеточных органеля, а так же повышением пермебиализации мембраны. Это «набухание» приводит клетку к гибели с последующим разрушением цитоплазматической мембраны и выходом содержимого клетки во внеклеточное пространство с воспалительной реакцией (Levin S., 1998). ДНК при этом может остаться неповрежденной. Онкоз сегодня называют также «программированный некроз», а фактической его причиной является несовместимое с жизнью снижение содержания АТФ в клетке. «Энергетическая катастрофа» может быть вызвана, например, токсинами или физическими повреждениями.
Пироптоз - путь гибели клетки, опосредованный активацией каспазы-1 (Cookson В. Т. and Brennan М. А., 2001). Эта протеаза также активирует провоспалительные цитокины TL-1 и IL-18, что предопределяет провоспалительный характер этого процесса. ДНК клетки претерпевает фрагментацию, как при апоптозе.
Апоптоз - гибель клетки в результате последовательной активации инициаторных (8, 2, 10, 9) и эффекторных (3, 7, 6) каспаз с последующим расщеплением белков-мишеней и фрагментацией ДНК. В итоге происходит разрушение множества белков, участвующих в поддержании гомеостаза и в репарации компонентов клетки, белков - регуляторов клеточного цикла, структурных белков и др. Конечными этапами апоптоза является уплотнение цитоплазмы, фрагментация ядер и самих клеток с образованием апоптотических телец, которые экспонируют на поверхности адгезивные и сигнальные молекулы, распознаваемые фагоцитами. В условиях длительного отсутствия фагоцитоза, апоптотические тельца могут лизироваться с последующим вторичным апоптозом или некрозом.
Программу апоптотической гибели условно можно разделить на три этапа: индукция, эффекторная стадия и деградация. В запуске апоптоза участвуют различные органеллы, но, прежде всего это плазматическая мембрана и митохондрии. В этой связи принято различать два основных пути активации апоптотической программы в клетке, это внешний путь и внутренний путь. Внешний или рецепторно-оносредованный путь реализуется через «рецепторы смерти» поверхностной мембраны клетки, в частности через рецепторно-лигандную систему CD95. Внутренний или рецепторно-независимый (митохондриальный) путь контролируется белками семейства Bcl-2 (Ghobrial I.M. et.al., 2005). Эти пути могут быть как независимыми друг от друга, так и взаимосвязанны (Gross A. et al., 1999b; Yin X.M.,etal., 1999).
Белки, контролирующие процесс апоптоза в клетке
К факторам экзогенного происхождения, индуцирующих апоптоз, принадлежат белки семейства TNP (tumor necrosis factor), в числе которых наиболее изученным является поверхностный антиген цитоплазматической клеточной мембраны CD95 (Trauth B.C. et al., 1989; Yonehara S. et al., 1989; Ttoh N. et al., 1991; Nagata S. and Golstein P. 1995). При связывании CD95 с его лигандом (CD95L/FasL/APO-lL) или соответствующими моноклональными антителами происходит индукция алоптоза в CD95-позитивных клетках, и является триггерным моментом для активации процесса апоптоза (CD95-рецепторно-лигандный механизм) (Peter М.Е and Krammer Р.Н. 1998; Krammer Р.Н. 1999; 2000). Установлено, что именно CD95 участвует в периферическом устранении аутоиммунных клеток, гибели зрелых активированных Т-клеток после завершения иммунного ответа, уничтожении Т-клетками вирус-инфицированных и опухолевых клеток, а также устранении воспалительных клеток в отдельных тканях (French L.E. et.al., 1996; Nguyen J.T. and Wells J.A., 2003). Кроме того, показано, что, по CD95-рецепторно-лигандному механизму осуществляется негативная селекция В-клеток в зародышевых центрах лимфоузлов, а нарушения CD95/CD95L пути апоптоза ассоциируется со злокачественной лимфопролиферацией, рядом системных аутоиммунных заболеваний и гипергаммаглобулинемией (Plumas J. et.al., 1998; GronbaekK. et.al., 1998; Muschen M. etal, 2000).
Восемь белков образуют семейство рецепторних DR (death receptor) молекул в состав которого входят следующие белки, это - рецептор опухоленекротического фактора TNFR1 (синонимы: DR1, CD120a, р55 и р60), рецептор TRAILR1 (синонимы: DR4 и АР02), рецептор TRA1L (синонимы: DR5, KILLER и TRICK2), рецептор DR3 (синонимы: АРОЗ, LARD, TRAMP и WSL1), рецептор DR6, рецептор EDAR, рецептор фактора роста нервов (NGF) и рецептор CD95 (синонимы DR2, АРО-1, Fas) (French L. Е. and Tschopp J., 2003; Wajant H., 2003). Для всех перечисленных белков характерно наличие цитоплазматического региона, состоящего приблизительно из 80 аминокислотных остатков, формирующих «домен смерти» (DD), однако для передачи сигнала смерти необходимо и достаточно 70 аминокислот. Мутационный анализ подтвердил, что эта консервативная область или «домен смерти» DD является существенной для CD95 при передаче сигнала гибели. Удаление 15-ти С-терминальных аминокислот в цитоплазматической части молекулы CD95 приводит к усилению цитотоксической активности. По-видимому, эта область молекулы действует как ингибиторный домен (Itoh N. et al., 1993). При взаимодействии поверхностных рецепторов с соответствующими лигандами целый ряд молекул рекрутируют DD и, как следствие, происходит активация передачи сигнала. Одновременно молекулы лигандов гибели взаимодействуют с рецепторами-ловушками (DcRs), которые не имеют собственных «доменов смерти», в связи, с чем не происходит формирования сигнальных комплексов. На сегодняшний день охарактеризованы 4 вида DcRs рецепторов: TRAILR3 или DcRl, TRAILR4 или DcR2, DcR3 и OPG.
Выделяют два типа DR-сигнальных комплексов. Первый тип включает гибель-индуцирующие сигнальные комплексы (DISCs), формирующиеся сходным образом при активации рецепторов CD95, TRAILR1 и TRAILR2. Дальнейшим центральным событием передачи сигнала апоптоза является активация каспазы-8. Второй тип охватывает рецепторы TNFR1, DR3, DR6 и EDAR, которые различным образом формируют сигнальные комплексы, участвующие как в передаче сигнала апоптоза, так и в активации программы выживания (Danial N,N. and Korsmeyer S J., 2004).
В CD95 и TRAILRI/TRAILR2 DISCs комплексы входят олигомеризованные (тримеризованные) рецепторы, DD-домен адапторной молекулы FADD/MORTl (Fas-Associated Death Domain), две изоформы прокаспазы-8 (прокаспаза-8а [FLTCE, MACHal, Mch5] и прокаспаза-8Ь [Macha2]), прокаспаза-10 и внутриклеточный FLICE-ингибиторный белок (FLIPL/S/R) (Peter М.Е. and Krammer Р.Н., 2003). Формирование DISC -комплекса возможно благодаря гомотипическому контакту молекул. Так, DD рецептора связывается с DD на С-конце адапторного внутриклеточного белка FADD, тогда как N-концевой регион FADD, названный эффекторным доменом смерти DED (death effector domain), взаимодействует с N-концом одного из DEDs прокаспазы-8, прокаспазы-10 и FLIPL/S/R. Активация прокаспазы-8 соответствует модели, названной «индуцированная близость», при которой высокая локальная концентрация прокаспазы-8 в сигнальном комплексе DISC приводит к ее аутопротеолитической активации. В результате многоступенчатого процесса расщепления образуется гетеротетрамерная структура молекулы каспазы-8, состоящая из двух больших субъединиц (р18) и двух малых субъединиц (р10), которые высвобождаются в цитозоль для передачи апоптотического сигнала (Martin D.A. etal., 1998; Muzio М. etal., 1998; Boatright K.M. et al, 2003; Chang D.W. et.al., 2003).
Установлено, что прокаспаза-10 также активируется с образованием гетеротетрамерной формы. Однако остается неясным вопрос, в отсутствии каспазы-8 является ли каспаза-10 триггерной молекулой в ответ на CD95 или TRAIER1/R2 стимуляцию или нет (Kischkel F.C. et.al, 2001; Sprick М. etal., 2002).
Есть данные, что белки FLIPL и FEIPS функционируют как ингибиторы активации прокаспазы-8 и, тем самым, блокируют формирование DISC-комплекса. Доказательством является факт, что белок FLIPL способен к расщеплению прокаспазы-8 из DISC-комплекса с последующим образованием гетеродимеров FLIPL-npOKacna3a 8 (Micheau О. etal., 2002; Chang D.W. etal, 2003).
Помимо вышеупомянутых участников, формирующих гибель-индуцирующий сигнальный комплекс (DISC), возможна активация добавочных или альтернативных путей клеточной смерти с участием белков Daxx, FAP-1, FLASH, RJP, FAF-1 и других, однако окончательная роль этих белков неясна (Peter М.Е. and Krammer Р.Н., 2003).
Существует два возможных варианта развития С095-опосредуемого сигнала гибели клеток (Krammer Р.Н. and Peter М.Е., 1998). Первый тип клеток характеризуется высоким уровнем DISC комплекса и высоким содержанием активированной каспазы-8. Далее напрямую происходит протеолитическая активация других ICE-подобных протеаз ( эффекторные каспазы 3 и 7) и, тем самым, запускается каскад каспаз, приводящих к заключительной стадии программы апоптоза (Danial N.N. and Korsmeyer S.J., 2004).
Другой тип клеток имеет низкий уровень DISC комплекса и, соответственно, низкий уровень активированной каспазы-8 (Scaffidi С. etal., 1998). В этом случае, клетка нуждается в «добавочной петле», которая включает в себя расщепление каспазой-8 Bcl-2-подобного белка Bid, его транслокацию в митохондриальную мемебрану, выход цитохрома С, формирование апоптосомы, активацию каспазы-9, а далее, как и в первом случае, запуск каспазного каскада, приводящего к заключительной стадии программы апоптоза (Korsmeyer SJ. et.al., 2000). Этот тип CD95-опосредуемого пути передачи сигнала может блокироваться белками семейства Вс1-2, как самим Вс1-2, так и Вс1-Хь однако в ряде случаев полное его блокирование возможно только в случае совместной экспрессии в клетке Вс1-2 и какого-либо другого ингибитора апоптоза из этого семейства, например, Bag-1 (Zhivotovsky В. et.al, 1997; Willis S. et.al, 2003).
Исследование экспрессии поверхностного рецептора CD95 на нормальных и лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки
Наиболее изученным механизмом физиологической гибели клеток является рецепторно-лигандный путь передачи сигнала апоптоза с участием рецепторов суперсемейства TNF, в состав которого входит CD95. Взаимодействие CD95 с его лигандом (CD95L/FasL/APO-lL) или с моноклональными антителами против CD95 является триггерным моментом для активации процесса апоптоза (Li J.H., et.al., 1998; Laouar Y., etal, 2000; Krammer P.H., 2000; Барышников А.Ю., 2001; Askenasy N., et.al. 2005). Установлено, что именно CD95 участвует в периферической элиминации аутоиммунных клеток, гибели зрелых активированных Т-клеток после завершения иммунного ответа, уничтожении Т-клетками вирус-инфицированных и опухолевых клеток, а также устранении воспалительных клеток в отдельных тканях (French L.E., etal, 1996).
CD95 экспрессируется на опухолевых клетках как гематологической, так и негематологической природы. Интересно, что первыми новообразованиями, при которых была выявлена экспрессия С095-лиганда, были гемобластозы. Высокая экспрессия CD95L обнаружена в опухолевых клетках лимфомы из NK-клеток, лейкоза больших гранулосодержащих лимфоцитов Т- или NK-типа, миеломной болезни, острого монобластного или миелоидного лейкоза (TanakaM. et al., 1996; Vollunger A. et al., 1997).
Нарушение реализации программы апоптоза лежит в основе патогенеза многих гематологических заболеваний, в том числе при лимфомах, миелодиспластическом синдроме, множественной миеломе, а также Т- и В-клеточных лейкозах (Thompson СВ. 1995; Sun E.W., Shi Y.F, 2001).
CD95 рецепторно-лигандная система является критическим компонентом лекарственно индуцированного апоптоза, а нарушения функционирования этой системы могут приводить к лекарственной устойчивости. Кроме того, установлено, что большинство химиопрепаратов, применяемых в терапии гемобластозов, оказывают свое воздействие на опухолевую популяцию путем индукции апоптоза (Los М. etal., 1997; Friesen С. et.al., 1997; Fulda S. etal., 1998).
CD95 является дифференцировочным антигеном, следовательно, его экспрессия связана с определенными этапами созревания гемопоэтических клеток. С целью сопоставления нормальных стадий дифференцировки кроветворных клеток в качестве биологической модели мы использовали образцы периферической крови и костного мозга больных гемобластозами.
Нами была изучена экспрессия дифференцировочного антигена CD95(Fas/APO-l) на лейкозных клетках больных ОЛЛ, ХМЛ в хронической фазе и в стадии БК, ХЛЛ, ММ, МДС и на нормальных клетках периферической крови доноров и тимуса.
Среди острых лейкозов у детей на долю острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) приходится 80-85%, а в структуре опухолевых заболеваний детского возраста он составляет около 30%. У взрослых это соотношение сильно меняется и на долю ОЛЛ приходится уже не более 15-20% от всех лейкозов. Несмотря на различные иммунологические подварианты, все ОЛЛ у детей имеют костномозговое происхождение, поэтому в наших исследованиях в качестве источника опухолевых клеток использовался только костный мозг.
Нами проведено исследование экспрессии CD95(Fas/APO-l) антигена на бластных клетках костного мозга 54 детей больных ОЛЛ. Сравнение частоты встречаемости экспрессии CD95(Fas/APO-l) антигена на клетках костного мозга при различных иммунологических подвариантах ОЛЛ выявило, что наиболее часто (63,6%) его экспрессия определялась при клинически наиболее благоприятном пре-пре-В подварианте ОЛЛ.
Проведенный корреляционный анализ показал зависимость между экспрессией CD 10 и экспрессией CD95 антигенов в группе больных с пре-пре-В ОЛЛ (г=0,54, р 0,05). В связи с наличием или отсутствием на бластных клетках костного мозга мембранного антигена CD95 группа исследуемых больных разделена на 2 подгруппы С095-позитивные и CD95-негативные. Анализ 10-летней выживаемости больных показал, что медиану продолжительности жизни в CD95 группе больных на момент проведения сопоставлений определить не удалось в связи с тем, что общая выживаемость в этой группе была выше 50%, в то время как в CD95" группе медиана общей выживаемости составила 24 месяца. Медиана безрецидивной выживаемости у больных в CD95 группе составила 115 месяцев, в CD95" группе - 13,2 месяцев.
С помощью двухцветного окрашивания мы провели проточно-цитофлуориметрический анализ коэкспрессии дифференцировочных антигенов на бластных клетках больных ОЛЛ. В качестве примера на рисунке показано, что все CD19 В-бласты экспрессируют на своей поверхности антиген CD95 (рисунок 4).
Исследование экспрессии белков семейства Bcl-2 в норме и на лейкозных клетках лимфоидной и миелоидной дифференцировки
Изучение экспрессии белка Вс1-2 в лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров (п=18) показало, что он представлен на мембранах митохондрий лимфоцитов практически в 100% случаев, при этом, интенсивность экспрессии крайне слабая и имеет гомогенный характер. Уровень положительных клеток составил 13,5±5,8%. Анализ среднего канала интенсивности флюоресценции окрашенных образцов (MFI) практически не отличался от изотипического внутриклеточного контроля - 33 и 28 соответственно. Однако сравнительный анализ гистограмм с применением коммерческого пакета статистической обработки данных (Kolmogorov-Smirnov Statistics (K-S) «Becton Dickinson») указал на достоверные различия анализируемых образцов. Индекс различия гистограмм (D) составил 0.21, р 0,001.
С помощью метода трехцветного субпопуляционного проточно-цитометрического анализа была изучена коэкспрессия внутриклеточного белка Вс1-2 на Т- и В-лимфоцитах периферической крови доноров. Анализировали только CD45T лимфоциты ПК. Как видно на рисунке 29, как СЭ5+Т-клетки, так и СО20тВ-клетки позитивны по экспрессии Вс1-2.
DotPlot цитограммы коэкспрессии внутриклеточного белка Bcl-2 на субпопуляциях CD45+ лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.
Экспрессию белка Вах на лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров наблюдали в 15 из 18 образцов (83,3%). Как и в случае исследований Вс1-2, положительная реакция отмечалась в виде сдвига «пика» окрашенных клеток вправо по шкале интенсивности флюоресценции. Уровень клеток, его экспрессирующих, варьировал от 1,2% до 14,1%, а среднее значение по группе составило 6,4±5,7%. Соотношение экспрессии белков семейства Bcl-2/Bax на лимфоидных клетках периферической крови доноров (п=15) составило 1.5-2.6.
Среди общего пула СБ45+-лимфоидных клеток костного мозга здоровых доноров (п=4) экспрессия Вс1-2 не выявлена ни в одном из тестируемых образцов, экспрессия белка составила от 0,44 до 4,35% (среднее 2,2±1,7%) положительных клеток.
Экспрессию белка Вах на клетках нормального костного мозга изучали только в двух случаях, при этом один образец был отрицательным - 0,91%, а в другом - 63% положительных клеток. Соотношение экспрессии белков группы Bcl-2/Bax в донорском костном мозге составило 2.6 и 0.002 соответственно.
Нельзя не заметить, что в процессе выполнения этих исследований мы столкнулись с трудностями оценки положительной экспрессии внутриклеточных белков в клетках. Практически всегда положительная реакция фиксировалась по смещению гистограммы окрашенных клеток на оси интенсивности флюоресценции относительно контрольного образца. Отсутствовали четкие границы (бимодальность) между отрицательными клетками изотопического внутриклеточного контроля и клетками со слабой экспрессией внутриклеточных маркеров. Возможно, что именно низкие пороговые уровни экспрессии этих белков в нормальных зрелых клетках периферической крови не позволили выявить видимых различий в анализируемых образцах. В связи с этим, в дальнейшей работе наряду с определением количества положительных клеток, мы проводили анализ уровня внутриклеточных биомаркеров (окрашенных образцов) по оценке среднего канала интенсивности флюоресценции или MFI относительно контрольного изотипического образца.
Исследование экспрессии Вс1-2 в тимоцитах проводилось с применением трехцветного окрашивания. В качестве примера на Dotplot цитограмме показан способ выделения субпопуляций тимоцитов в зависимости от экспрессии поверхностных антигенов. На основании коэкспрессии на мембранах тимоцитов дифференцировочных антигенов были выделены 4 гейта клеток: 1-ый - зрелые CD4+ тимоциты, 2 -ой -незрелые CD4+CD8+ тимоциты, 3-ий - зрелые CD8+ тимоциты, 4-ый -негативные тимоциты по экспрессии обоих маркеров. В дальнейшем был использован гистограммный анализ для изучения содержания внутриклеточного митохондриального Вс1-2 белка в каждой из субпопуляций тимоцитов (рисунок 30).
Было установлено что, Вс1-2 экспрессировался в CD4 CD8 дубль-негативных тимоцитах, а также в CD4+ (1-ый и 2-ой квандранты) и CD8+ (2-ой и 3-ий квандранты) популяциях тимоцитов. Абсолютное большинство CD4+CD8+ дубль-позитивных тимоцитов также экспрессировали Вс1-2, однако, его экспрессия (MFI) была значительно ниже, чем в других субпопуляциях. Средний канал интенсивности флюоресценции (MFI) клеток, окрашенных FITC-конъюгированными anti-Bcl-2 МКА, составил от 68 до 74 для субпопуляций CD4 CD8 , CD4+CD8 CD4 CD8+ тимоцитов и 46 для CD4+CD8+ тимоцитов. Надо заметить, что среди тимоцитов с фенотипом CD4+CD8+ часть клеток оказалась отрицательной по связыванию с anti-Bcl-2 МКА.
![Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций [Электронный ресурс]](/i/i/4404/192487.png "Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций [Электронный ресурс] Гришина Виктория Валерьевна")
