Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций [Электронный ресурс] Гришина Виктория Валерьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы. 10

1.1 Источники стволовых клеток, используемых для трансплантации . 10

1.2 История трансплантаций ПК. 12

1.3 Преимущества и недостатки ПК. 13

1.4 Сбор пуповинной крови. 15

1.4.1. Обследование беременной. 15

1.4.2. Методы забора ПК. 16

1.5. Краткосрочное хранение ПК. 18

1.6. Предварительное обследование ПК. 19

1.7. Оценка потенциала стволовых клеток. Сравнительная характеристика с КМ и ПСК. 20

1.7.1. Клеточность. 22

1.7.2. CD34+. 23

1.73. КОЕ-ГМ. 23

1.8. Выделение стволовых клеток из ПК. 25

1.9. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. 26

1.9.1. Криопротекторы. 27

1.9.2. Замораживание. 29

1.9.3. Долгосрочное хранение. 30

1.9.4. Размораживание. 31

1.10. Архивирование биоматериала. 32

Глава П. Объекты, материалы и методы. 34

2.1. Объект и материалы исследования. 34

2.2. Методика сбора пуповинной крови. 34

2.3. Методика фракционирования пуповинной крови. 36

2.4. Методика криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. 37

2.5. Лабораторные методы исследования. 39

2.5.1. Определение содержания форменных элементов. 39

2.5.2. Подсчет лейкоцитарной формулы. 40

2.5.3. Определение клеток с имунофенотнпом CD34+. 40

2.5.4. Определение гранулоцитарно-моноцитарных клеток-предшественниц. 40

2.5.5. Определение жизнеспособности клеток. 41

2.5.6. Определение бактериального загрязнения крови. 41

25.7. Выявление ДНК возбудителей Neisseria gonorrhoeae, Toxplasma gondii и цитомегаловируса. 42

2.5.8. Определение наличия антител к ВИЧ-1/2,, HbsAg, антител к вирусу гепатита С. 43

2.5.9. Определение наличия антител к бледной трепонеме (серодиагностика сифилиса). 43

2.5.10. Компьютерная морфометрия форменных элементов ПК. 43

2.6. Измерение температуры биоматериала и крнобокса. 44

2.7. Методика создания компьютерной базы данных для архивирования пуповинной крови, находящейся на длительном хранении. 44

2.8. Методы статистической обработки результатов. 45

Глава III. Результаты исследования и их обсуждение. 47

3.1. Сбор пуповинной крови. 47

3.2. Краткосрочное хранение пуповинной крови. 58

3.3. Выделение клеточной фракции. 59

3.4. Криоконсервнрование пуповинной крови . 67

3.5. Динамика показателей ПК в процессе её сбора, сепарации икриоконсервации. 78

3.6. Арживирование пуповинной крови. 79

Глава IV. Заключение. 87

Выводы. 90

Приложение 1 93

Приложение 2 98

Библиография. 103

• Источники стволовых клеток, используемых для трансплантации
• Методика сбора пуповинной крови.
• Сбор пуповинной крови.
• Криоконсервнрование пуповинной крови

Введение к работе

Актуальность работы.

В последние годы для лечения злокачественных новообразований (как
солидных, так и гематологических) и ряда неопухолевых заболеваний
(наследственные болезни, болезни обмена, системные заболевания
соединительной ткани) стали достаточно широко использоваться
сверхинтенсивные курсы химиотерапии (высокодозная химиотерапия) с
последующим восстановлением кроветворения трансплантацией

гемопоэтических стволовых клеток.

Гемопоэтические клетки для трансплантации могут быть получены у однояйцового HLA-идентичного близнеца (сингенная трансплантация), родственного или неродственного донора, совместимого по основным антигенам HLA (аллогенная трансплантация) или у самого больного (аутологичная трансплантация). До недавнего времени во всех вышеперечисленных случаях гемопоэтические клетки получали из костного мозга и/или периферической крови [14], однако данные методики не лишены существенных недостатков. В связи с риском развития смертельно опасной реакции «трансплантат против хозяина при проведении аллогеннои трансплантации необходимо наличие HLA-совместимого донора. В этом отношении идеальными донорами гемопоэтических стволовых клеток являются HLA-идентичные доноры-близнецы. Однако такая возможность имеется лишь у единичных больных и в данном случае отсутствует реакция «трансплантат против опухоли». Совместимого по основным локусам HLA-системы родственного донора имеют лишь 30-40% больных, а шанс на подбор неродственного донора еще более ограничен. Использование аутологичных стволовых клеток, полученных в период уже существующей болезни, несет в себе потенциальную опасность - возможную контаминацию опухолевыми клетками при ретрансфузии. Кроме того, получение гемопоэтических клеток из

костного мозга и из периферической крови требует проведения инвазивных манипуляций и введение лекарственных веществ, представляющих потенциальную опасность для жизни и здоровья донора.

Альтернативным источником репопулирующих гемопоэтических клеток пригодным для трансплантации является пуповинная кровь. Использование пуповинной крови имеет целый ряд преимуществ перед другими источниками кроветворных клеток:

1 .Отсутствует риск для здоровья матери и ребенка (донора). 2. Увеличивается возможность использования не полностью совместимых по HLA-системе (от 1 до 3 антигенов) трансплантатов[40,47]. 3.Увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов.

4. Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем [71].

5. Появляется относительно недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.

В тоже время по принятым стандартам для адекватного восстановления гемопоэза требуется определенное количество гемопоэтических клеток на килограмм веса реципиента. В связи с этим принципиальным недостатком пуповинной крови можно считать малое абсолютное количество гемопоэтических клеток и невозможность повторного получения их от того же донора. По данным литературы из 2100 заготовленных образцов пуповинной крови для реципиентов с массой тела 50-70 кг. потенциальными трансплантатами могли считаться лишь 25%, для реципиентов с массой тела до 35 кг. - 67% и лишь для больных с массой тела ниже 10кг. —100% [49].

В связи с выше сказанным основной задачей при заготовке пуповинной крови является обеспечение наименьшей потери стволовых клеток. В настоящее время в мире существует несколько методик получения, фракционирования и криоконсервирования пуповинной крови. Актуальностью

данного исследования является поиск методов фракционирования, концентрации и состава криопротектора, а так же режима замораживания, способных обеспечить наименьшие потери клеточной массы и её функциональной активности.

Цель исследования.

Разработать единый технологический процесс, включающий в себя сбор, фракционирование, тестирование, криоконсервирование и архивирование пуповиннои крови, подлежащей длительному хранению при ультранизких температурах, способный обеспечить минимальные потери клеточной массы, используя опыт криоконсервации костного мозга и периферических стволовых клеток в банке криоконсервированных биоматериалов ГУ РОНЦ им. Н.Н. БлохинаРАМН.

Задачи исследования.

1. Изучить закрытый способ сбора пуповиннои крови.

2. Модифицировать методику закрытого способа сбора пуповиннои крови в соответствии с условиями и средствами отечественного здравоохранения.

3. Разработать оптимальную методику фракционирования пуповиннои крови.

4. Определить сроки и условия хранения ПК до момента ее обработки.

5. Подобрать оптимальный состав и концентрацию криопротектора.

6. Провести оценку потерь стволовых клеток на этапах фракционирования и криоконсервирования ПК.

7. Разработать оптимальную методику замораживания.

8. Создать компьютерную базу данных для исключения ошибок при архивировании хранящегося биоматериала.

Научная новизна.

Модифицирован закрытый способ сбора пуповинной крови в соответствии с условиями и средствами отечественного здравоохранения. Впервые применены: метод фракционирования ПК в полиглгокине, использование низких концентраций диметилсульфоксида в качестве криопротектора в сочетании с полиглюкином, оригинальная методика замораживания, а также произведена тщательная оценка количественного и качественного состава пуповинной крови на всех этапах обработки биоматериала. Впервые создана компьютерная база данных для архивирования пуповинной крови.

Практическая значимость работы.

Разработан легко осуществимый и эффективный единый технологический
процесс заготовки пуповинной крови, подлежащей длительному хранению при
ультранизких температурах, не требующий дорогостоящего оборудования и
особой подготовки медицинского персонала. Модифицирована методика
закрытого способа забора пуповинной крови. Разработаны методы сепарации
и криоконсервирования пуповинной крови с использованием

общедоступных реактивов и оборудования, обладающих высокой эффективностью и небольшой себестоимостью.

Проведенные исследования позволили оценить необходимость
использования различных лабораторных исследований на всех этапах
криоконсервания пуповинной крови. Все это в комплексе с компьютерной
базой данных позволило создать банк пуповинной крови (300 образцов).
Получено решение о выдаче патента на изобретение «Способ

криоконсервирования пуповинной крови» (заявка № 2004116209).

Источники стволовых клеток, используемых для трансплантации

Трансплантация стволовых гемопоэтических клеток нашла применение в различных областях медициньї. Во-первых, эти клетки используются после высокодозной химиотерапии для снижения длительности депрессии костного мозга и сокращения риска инфекционных и геморрагических осложнений. Во -вторых, в случае использования донорских стволовых клеток, для восстановления иммунного противоопухолевого ответа. Третьим направлением применения долгоживущих кроветворных предшественников является генотерапия.

Гемопоэтические клетки для трансплантации могут быть получены у однояйцового HLA-идентичного близнеца (сингенная трансплантация), родственного или неродственного донора, совместимого по основным антигенам HLA (аллогенная трансплантация) или у самого больного (аутологичная трансплантация). До недавнего времени во всех вышеперечисленных случаях гемопоэтические клетки получали из костного мозга и/или периферической крови [14], однако данные методики не лишены существенных недостатков. В связи с риском развития смертельно опасной реакции «трансплантат против хозяина при проведении аллогенной трансплантации необходимо наличие HLA-совместимого донора. В этом отношении идеальными донорами гемопоэтических стволовых клеток являются HLA-идентичные доноры-близнецы. Однако такая возможность имеется лишь у единичных больных и в данном случае отсутствует реакция «трансплантат против опухоли». Совместимого по основным локусам HLA-системы родственного донора имеют лишь 30-40% больных, а шанс на подбор неродственного донора еще более ограничен. Однако, из-за большой полиморфности HLA-системы вероятность того, что неродственный донор окажется HLA-совместимым, очень мала. В Европе и США созданы регистры добровольных HLA-типированных доноров костного мозга для лечения больных, нуждающихся в трансплантации [31, 44]. По данным Национальной программы доноров костного мозга (NMDP) в США к 1997 году зарегистрировано более 2,7 млн. таких доноров [31]. Но, несмотря на такое количество потенциальных доноров из-за чрезвьлайного полиморфизма системы HLA только не более 1/3 из всех больных, нуждающихся в аллотрансплантации, возможно, подобрать неродственного донора [42]. Для этнических меньшинств вероятность нахождения HLA-совместимого не родственного донора чрезвычайна мала - менее 10% [69]. Поиск донора представляет собой длительный процесс, поскольку требует различных клинических, иммунологических и вирусных тестирований, как самого донора, так и полученного биоматериала. В среднем, поиск нужного донора занимает от 3, 7 [72] месяцев до 4 месяцев [81, 46] и иногда, в случае агрессивного течения опухолевого процесса, пациент не доживает до трансплантации. Кроме того, поиск донора костного мозга дорогостоящий процесс: стоимость поиска, эксфузии и подготовки материала к трансплантации костного мозга составляет от 25000 до 50000$ [41]. Аутологичная трансплантация КМ и ПСК — возможная альтернатива для больных, у которых нет гистосовместимого донора, так как не требует HLA подбора. Использование аутологичных стволовых клеток, полученных в период уже существующей болезни, несет в себе потенциальную опасность - возможную контаминацию опухолевыми клетками при ретрансфузии. Кроме того, отсутствует реакция «трансплантат против опухоли», что ограничивает использование аутотрансплантата при ряде опухолей. Вышеупомянутые трудности и ограничения использования стволовых гемопоэтических клеток, полученных из костного мозга и периферической крови, диктуют необходимость поиска новых источников гемопоэтических стволовых клеток, пригодных для проведения трансплантации.

В настоящее время значительно возрос интерес к пуповиннои крови (ПК), как к альтернативному источнику репопулирующих гемопоэтических клеток [69,89,70]. Данные клинических исследований, на сегодняшний день, показали, что пуповинную кровь, можно эффективно использовать для трансплантаций после проведения высокодозной химиотерапии (ВХТ) по поводу многих тяжелых заболеваниях крови и наследственных нарушениях метаболизма [2, 3, 24,85,89].

В 70-х годах было показано, что пуповинная кровь содержит значительное количество клеток-предшественников кроветворения по сравнению с обычной кровью детей и взрослых [89], а уже в начале 80-х годов были успешно проведены первые экспериментальные модели трансплантаций ПК на животных [28].

Первая трансплантация стволовых клеток, полученных из пуповиннои крови сестры (сиблинга), была произведена в 1988 году шестилетнему ребенку, страдающему анемией Фанкони [48]. В 1993 году была осуществлена первая успешная трансплантация пуповиннои крови от неродственного донора [68]. К настоящему времени по всему миру произведено более 2000 неродственных и более 400 родственных трансплантаций стволовых клеток пуповиннои крови, как детям, так и взрослым [45,49, 68,78].

В литературе в основном приводятся данные о проведенных аллогеных трансплантациях [45,49, 63]. Не смотря на то, что некоторые авторы рассматривают аутологичную трансплантацию стволовых клеток пуповиннои крови лишь как теоретически возможную [89], уже существуют единичные клинические наблюдения об эффективном ее применении [53]. По мнению большинства авторов [38, 45, 46, 85] заготовка и хранение стволовых клеток пуповинной крови непосредственно для самого донора является обоснованной при наличии отягощенного семейного анамнеза по заболеваниям кроветворной системы, иммунным и обменным нарушениям.

Методика сбора пуповинной крови.

Сбор ПК производился акушерами из вены пуповинного канатика после рождения доношенного ребенка (38-42 недели гестации) при естественных родах с соблюдением условий стерильности. Все роженицы еще до родов были обследованы на носительство вирусного гепатита В (Hbs антиген), ВИЧ-инфекцию и сифилис (реакция Вассермана - RW). В случае выявления даже одной из перечисленных инфекций сбор крови не осуществляли. Сбор ПК производился в стандартный строенный контейнер для забора донорской крови(500/300/300) с антикоагулянтом путем дренирования пупочной вены. Для сбора ПК использовали 2 вида закрытых систем: фирмы «Baxter» с антикоагулянтом CPDA 63 мл и пункционной иглой; отечественные контейнеры типа «Гемакон» с антикоагулянтом глюгицир 100 мл и пункционной иглой; Сбор ПК проводился в родильном зале при физиологических родах. После рожденияребенкапуповину клеммировали двумя зажимами на расстоянии 7-10 см от пупочного кольца и пересекали. До отделения плаценты после двукратной обработки раствором 70G этилового спирта пунктировали вену пуповины: в-пупочном канатике. Пупочную вену пунктировали иглой входящей в состав стандартной системы для забора донорской крови; Иглу вводили в дистальный конец пупочного канатика» Сама система располагалась на 70 см ниже уровня роженицы. Кровь самопроизвольно стекалав больший мешок(500) строенной системы для забора донорской крови; содержащий антикоагулянт. Заканчивали сбор пуповинной крови после полного спадения пупочной вены; После этого трубку, соединяющую иглу с; мешком герметизировали с помощью металлической клеммы. Полученный материал доставляли; для дальнейшей обработки в банк криоконсервированных биоматериалов ГУ РОНЦ им ШН: Блохивд; Для; определения: массы полученной ПК, биоматериал . взвешивали. Проводили пересчет массы на объем крови. Пробы для тестирования брали из мешка, содержащего ПК и антикоагулянт. 6:.В? пробах исходного материала определяли: ? количество лейкоцитов,.тромбоцитов, эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит; ? лейкоцитарную формулу; ? количество клеток симмунофенотипом CD344-; ? количество КОЕ-ГМ; ? морфометрию форменных элементов (компьютерная); ? жизнеспособность клеток. 2.3. Методика фракционирования пуповиннои крови. Для выделения ядросодержащих клеток и удаления эритроцитов из пуповиннои крови был использован полиглюкин (декстран 60000) в соотношениях к ПК 1:1 и 1:2:: 1. Полиглюкин в равном или 1А объеме пуповиной крови переводили из заводского флакона (400мл) в одинарный мешок «компопласт». Трубку, соединяющую флакон и мешок отпаивали при помощи диэлектрического запаивателя трубок. 2. Полиглюкин из «компопласта» при помощи двуигольной пластиковой системы (трубка.; имеющая на обоих концах иглы) переводили в мешок с ПК (больший мешок строенного контейнера для забора донорской крови). полиглюкин, ПК Затем пустой мешок («компопласт») отпаивали. 3. Тщательно перемешивали ПК с полиглюкином, а затем вертикально подвешивали контейнер, содержащий раствор (ПК с полиглюкином). 4.Седиментация эритроцитов длилась 30-120минут (до появления четкой границы), после чего супернатант при помощи плазмоэкстрактора переводили в один из меньших контейнеров (второй пережимали). После этого мешок с осадком запаивали и отсекали. осадок X Надоса док Оставпшйся осадок использовали в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования пуповиннои крови,, а именно: определение бактериального загрязнения крови, наличие антител к ВИЧ-1/2, бледной трепонеме, HbsAg, антител к вирусу гепатита С, выявление ДНК возбудителей Neisseria gonorrhoeae, Toxplasma gondii и цитомегаловируса. 6. Для оценки эффективности полиглюкина, как седиментирующего вещества, а также для выявления оптимальных соотношений полиглюкина к пуповинной крови в осадке и надосадке определяли:

Сбор пуповинной крови.

Нами проведено исследование закрытого способа получения пуповинной крови. Всего было выполнено 278 сборов. Из 278 образцов, полученной пуповинной крови , 11 собрано в систему для забора крови типа «Гемакон» с антикоагулянтом глюгицир 100 мл (2 мешка из них лопнули при дальнейших стандартных манипуляциях), и 267 в систему для забора крови фирмы «Baxter» с антикоагулянтом CPDA 63 мл. Рисунок 1: строенная система для забора донорской крови фирмы «Baxter» с антикоагулянтом CPDA 63 мли пункционной иглой; Рисунок 2: строенная система для забора донорской крови типа «Гемакон» с антикоагулянтом глюгицир 100 мли пункционной иглой. Акушерами, которые проводили сбор ПК, отмечено, что системы для забора крови фирмы «Baxter» более удобны в применении. При опросе акушеров было выяснено, что системы типа «Гемакон» обладают следующими недостатками: Иі Вес системы с антикоагулянтом нестандартизован (± 5 мл от среднего значения), поэтому для того, чтобы определить точный вес ПК, необходимо каждую систему взвешивать перед началом процедуры; Колпачок, закрывающий иглу в системе, не фиксируется плотно на игле после процедуры. Поэтому во избежании прокола контейнера колпачок необходимо фиксировать лейкопластырем либо отрезать иглу. Системы для забора крови фирмы «Baxter» лишены этих недостатков, а так же более надежны в применении, так как при дальнейших манипуляциях не один мешок не был поврежден. Однако системы «Гемакон» экономически более выгодны (стоимость 1 системы фирмы «Baxter» я 177 руб., стоимость 1 системы фирмы «Гемакон» «15 руб.). Исходя из выше сказанного, мы рекомендуем для сбора ПК использовать строенные системы для забора крови фирмы «Baxter» с антикоагулянтом GPDA 63 мл. При отсутствии данного вида систем можно использовать строенные системы для забора донорской крови типа «Гемакон» с антикоагулянтом глюгицир 100 мл. Антикоагулянт, содержащийся в системах использовался полностью, так как: 1. удаление части антикоагулянта приводит к разгерметизации контейнера, что увеличивает потенциальный риск микробной контаминации; 2. объем пуповинной крови невозможно точно знать заранее. Если даже объем собранной ПК минимален ( 60мл), то избыток антикоагулянта все равно удаляется при. дальнейших манипуляциях (фракционировании, центрифугировании). Оценка объемов, собранных образцов пуповинной крови.

Объемы собранных образцов ПК Средний объем полученной пуповинной крови составил (п=278) 69,7±31,1мл. (от 15 до 199 мл). В нашем исследовании 80мл 32% количество образцов ПК, имеющих объем 40 мл. составило 18% от общего количества (п=278). Процент образцов ПК, имеющих объем 80 мл., составил 32%. Остальные Диаграмма 1: Объемы собранных образцов ПК образцы (50%) имели объемы от 40 до 80 мл. Мы попытались проанализировать зависимость объема, собранной пуповинной крови от массы плода. Количество наблюдений составило 80 (сведения о массе новорожденного представлены акушерами только в 80 случаях, анализировались только образцы ПК, собранные в систему «Baxter»). Данные этого анализа представлены на гистограмме 1. самость объема, собранной ПК от массы пло с 120 в 100 О О О О ОО оо CD ю in ооооооооооо 1ПОО00О ЧО1-»СЧОС0 ООт-СЧСО-Ч- -ЮЮЮСОГ ООСО смсмсчсоосоососооооосососососо Вес ребенка в г. Гистограмма 1. I объем ПК Не смотря на то, что масса новорожденных в литературе рассматривается как прогностический фактор предполагаемого объема ПК [41], в нашем исследовании достоверной прямой зависимости этих параметров не наблюдалось, что подтверждено корреляционным анализом (п=80; г=0,19, рХ),05; rs=0,192, р=0,088). Из этого следует, что судить о предполагаемом сборе ПК только по данному критерию невозможно. По всей видимости, зависимость объема пуповинной крови от массы плода действует только в совокупности с другими факторами: временем пересечения пуповины, сроком беременности, длиной пуповины [41].

Криоконсервнрование пуповинной крови

Наиболее опасным для жизнеспособности стволовых гемопоэтических клеток при их заготовке является этап замораживания. Для устранения разрушающего воздействия на клетки ультранизких температур в настоящее время используется криопротектор ДМСО, который в высоких концентрациях ( 10%) сам может оказывать токсическое действие на клетки крови. Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении ДМСО к клеточной суспензии в конечной концентрации 10% и замораживании со средней скоростью 1-2 градуса Цельсия в минуту с использованием электронного программного замораживателя и хранением в жидком азоте или парах жидкого азота. Мы разработали метод криоконсервирования стволовых клеток пуповиннои крови с уменьшением концентрации ДМСО и без использования программного замораживателя. Добавление криофилактика. В качестве криопротектора кроветворных клеток мы предлагаем использовать высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5 % в сочетании с полиглюкином. Использование данного криофилактика соответствует тенденции последних лет - разработке оптимальных методов криоконсервирования костного мозга и клеток пуповиннои крови путем сочетания в одном растворе нескольких ограждающих веществ различного механизма действия в низких концентрациях (интрацеллюлярного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) и экстрацеллюлярного раствора гидроксиэтилкрахмала, альбумина) [92] . Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое, с 10% до 5-6% конечной концентрации, так как полиглюкин обладает следующими свойствами: во первых - способностью дезагрегировать клетки и тем самым улучшать проникновение криофилактика в клетки, во вторых - полиглюкин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком (имеет свойство связывать воду). Заранее приготовленный 10-12% ДМСО раствор в полиглюкине (25-30мл.) мы смешивали с концентрированным при помощи центрифугирования надосадком (25-30мл.) и смесь переводили в криомешок (DF200). Все действия производили одновременно благодаря разработанной нами и выполненной ЗАО «Мепотекс» трехигольной системе (рисунок 14,15), которая позволила: ? не разгерметизировать мешки, содержащие биоматериал и раствор; ? уменьшить потенциальный риск микробной контаминации ПК (по сравнению с использованием шприцов); ? упростить технологический процесс (по сравнению с использованием шприцов). ? Обеспечить наиболее равномерное смешивание стволовых; гемопоэтических клеток и криофилактика за счет смешивания в трубке. Рисунок 14: трехигольная система криофилактик концентрат стволовых клеток трехигольная система криомешок Рисунок 15: смешивание концентрата стволовых клеток и криофилактика с одновременным переводом в криомешок После перевода биоматериала криомешок запаивали. Для исключения возможной контаминации криохранилища мы предлагаем порт с иглой отсекать по верхнему шву запаивания (рисунок 16,17). Рисунок 16: запаивание криомешка Рисунок 17: отсекание порта с иглой Данный прием позволил: ? удалить ворота возможной контаминации криохранилищ; ? уменьшить размер криомешка, что позволяет экономить места в криохранилищах.

Замораживание гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. Мы поставили перед собой задачу разработать наиболее надежный метод замораживания пуповинной крови, который бы исключал использование программируемой аппаратуры. Основным критерием являлась скорость охлаждения биоматериала. Она должна была быть оптимальной - от 1С до 2,5C/min и не превышать 5C/min при охлаждении пуповинной крови от 0С до 40С. В результате экспериментов (использование пластиковых, деревянных контейнеров различной толщины) оказалось, что при замораживании биоматериала, помещенного в контейнер, выполненный из многослойной фанеры (толщина стенок 10мм, размер соответствует размеру 2 криомешков DF200) в парах жидкого азота скорость охлаждения ПК соответствует, заданным нам параметрам. Был проведен ежеминутный замер температуры в течение 60 минут как самого криобокса, так и биоматериала. Результаты данного эксперимента

Похожие диссертации на Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций [Электронный ресурс]

Разработка метода низкочастотной ультразвуковой терапии рака кожи и губы в сочетании с химиопрепаратамиГончарова, Елена Геннадьевна

Разработка методов лечения локализованной формы саркомы ЮингаТайлаков, Балтабай Бейшеевич

Разработка количественного метода определения метаболитов бенз(а)пирена в экскретах животных и изучение индивидуальных и видовых особенностей их экскрецииСавочкина, Ирина Витальевна

Разработка комплексного метода оценки канцерогенной опасности процессов коксования каменного и скоростного пиролиза бурого угля на предприятиях РоссииКосой, Георгий Хаимович

Разработка оптимальных методов лечения локальных и локально-регионарных форм мелономы кожиДемидов, Лев Вадимович

Разработка консервативных методов лечения десмоидных фибромМорозова Светлана Вячеславовна

Разработка адекватных методов экстракорпоральной детоксикации организма при модифицированной терапии злокачественных опухолейХудайбердиев, Ахрор Насирович

Разработка хирургических методов лечения больных раком гортани после неэффективного курса лучевой терапииАхундов, Азер Али Рамиз оглы

Экспериментальное обоснование и совершенствование методов лечения рака яичников на основе разработки технологий пролонгированной лекарственной и локальной физической циторедукцииХамитова Гульшат Валиевна

Исследование взаимодействия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток с опухолями методами флуоресцентного имиджингаМелешина Александра Викторовна