Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность темы 6
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы 9
1.4. Основные положения, выносимые на защиту 10
1.5. Апробация работы 11
2. Обзор литературы 11
2.1. Канцерогенез и опухолевая прогрессия 11
2.1.1. Особенности опухолевой клетки 11
2.1.2. Эпителиально-мезенхимальный переход 13
2.2. Поджелудочная железа 15
2.2.1. Поджелудочная железа: строение и функции 15
2.2.2. Эмбриональное развитие поджелудочной железы 18
2.2.3. Патологии поджелудочной железы 20
2.3. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ) 22
2.3.1. Патогенез и этапы развития ПАКПЖ 22
2.3.2. Биомаркеры ПАКПЖ 24
2.4. Основные регуляторы дифференцировки клеток поджелудочной железы 26
2.4.1. PDX1 27
2.4.2. PTF1 29
2.4.3. Гепатоцитарные ядерные факторы 30
2.5. Транскрипционный фактор HNF4 37
2.5.1. Строение гена HNF4A и его изоформы 37
2.5.2. Транскрипционная активность HNF4 39
2.5.3. HNF4 в развитии и функционировании эпителиальных органов и тканей 40
2.5.4. Другие представители семейства HNF4 43
2.5.5. Механизмы регуляции экспрессии HNF4 44
2.6. Роль HNF4 в канцерогенезе 46
2.6.1. HNF4 в развитии гепатоцеллюлярной карциномы 46
2.6.2. HNF4 в опухолях других органов 48
2.7. Заключение обзора литературы 50
3. Материалы и методы 51
3.1. Растворы, среды и реактивы 51
3.2. Олигонуклеотидные праймеры 53
3.3. Ферменты 55
3.4. Плазмидные векторы 55
3.5. Клеточные линии 56
3.6. Клинические образцы ткани 56
3.7. Наращивание и выделение плазмид 57
3.8. Лентивирусная инфекция клеток линий ПАКПЖ 57
3.9. Выделение суммарной клеточной РНК 58
3.10. Обратная транскрипция 59
3.11. Полимеразная цепная реакция 59
3.12. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени 60
3.13. Белковый ДСН-электрофорез в ПААГ 61
3.14 Электроперенос белков из ПААГ на PVDF-мембрану 62
3.15. Иммуноблоттинг 62
3.16. Фиксация клеток 63
3.17. Иммунофлюоресцентная окраска клеток на HNF4TOT и E-кадхерин 63
3.18. Определение интенсивности синтеза ДНК 64
3.19. Клоногенный тест 64
3.20. Измерение кинетики роста клеточных культур in vitro 65
3.21. Миграционный тест 65
3.22. Статистическая обработка данных 66
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Выбор модельной системы для исследования роли изменения экспрессии
HNF4 в клетках ПАКПЖ 67
4.2. Выбор исследуемых тканеспецифических генов, связанных с уровнем дифференцировки и функциями поджелудочной железы 70
4.3. Характеристика экспрессии генов в культурах клеток ПАКПЖ с различным уровнем дифференцировки 72
4.4. Исследование влияния экзогенной экспрессии HNF4 на злокачественный потенциал культур низкодифференцированных клеток ПАКПЖ Panc1 и
MiaPaCa 74 4.4.1. Получение клеточных культур Panc1 и MiaPaCa2, экзогенно экспрессирующих изоформы HNF41 и HNF47 74
4.4.2. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4 в клетках Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 74
4.4.3. Определение уровней синтеза белка HNF4 в клетках Panc1-HNF4 и
4.4.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в клетках Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 78
4.4.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках Pancl-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 83
4.4.6. Влияние экзогенной экспрессии HNF4 на биологические характеристики
4.4.6.1. Определение скорости роста клеточных культур Panc1-HNF4 и
4.4.6.2. Исследование интенсивности синтеза ДНК в клетках Panc1-HNF4
4.4.6.3. Снижение колониеобразующей способности клеток Panc1 и
MiaPaCa2 при экзогенной экспрессии HNF4 91
4.4.6.4. Усиление способности клеток Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 к
4.5. Исследование влияния подавления синтеза HNF4 на злокачественный потенциал культуры высокодифференцированных клеток ПАКПЖ СаРап2 99
4.5.1. Получение клеточных культур CaPan2 с подавленным синтезом HNF4 99
4.5.2. Определение уровней синтеза белка HNF4 в клетках CaPan2-shHNF4 100
4.5.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4 в
4.5.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в
4.5.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках
4.5.6. Влияние подавления синтеза HNF4 на биологические характеристики
4.5.6.1. Повышение скорости роста клеточных культур CaPan2-shHNF4 109
4.5.6.2. Усиление интенсивности синтеза ДНК в клетках CaPan2-shHNF4 110 4.5.6.3. Увеличение колониеобразующего потенциала клеток CaPan2 при
подавлении синтеза HNF4 111
4.5.6.4. Повышение способности клеток CaPan2-shHNF4 к направленной миграции 112
4.6. Исследование влияния подавления синтеза HNF4 на злокачественнй потенциал культуры умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ AsPC1 116
4.6.1. Получение клеточных культур AsPC1 с подавленным синтезом HNF4 116
4.6.2. Определение уровней синтеза белка HNF4 в клетках AsPC1-shHNF4 117
4.6.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4 в
клетках AsPC1-shHNF4 118
4.6.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в клетках AsPC1-shHNF4 120
4.6.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках AsPC1-shHNF4 123
4.6.6. Влияние подавления синтеза HNF4 на биологические характеристики клеток AsPC1 126
4.6.6.1. Замедление роста культур AsPC1-shHNF4 in vitro 126
4.6.6.2. Ослабление ДНК-синтетической активности клеток AsPC1 при подавлении синтеза HNF4 127
4.6.6.3. Снижение колониеобразующего потенциала клеток AsPC1 shHNF4 128
4.6.6.4. Усиление способности клеток AsPC1 к направленной миграции при подавлении синтеза HNF4 129
4.7. Исследование уровней экспрессии HNF4 и других тканеспецифических генов в клинических образцах ткани ПАКПЖ человека 132
4.7.1. Анализ уровней экспрессии HNF4 и групп его изоформ в панели клинических образцов ПАКПЖ 132
4.7.2. Исследование корреляции между экспрессией изоформ HNF4 и панкреа специфических генов в клинических образцах ПАКПЖ 136
5. Заключение 140
6. Выводы 143
7. Список сокращений 144
8. Список литературы
- Цели и задачи исследования
- Поджелудочная железа: строение и функции
- Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени
- Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках Pancl-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4
Введение к работе
Актуальность темы
Опухоли поджелудочной железы (ПЖ) относятся к наиболее злокачественным онкологическим заболеваниям. Самая распространенная форма опухолей ПЖ – протоковая аденокарцинома (ПАКПЖ), доля которой достигает 90% среди всех опухолей ПЖ. ПАКПЖ развивается из протоковых клеток и характеризуется крайне агрессивным фенотипом и высокой скоростью прогрессии, ей свойственны раннее метастазирование и устойчивость к современным методам терапии. Дополнительной проблемой является отсутствие четко выраженных симптомов и эффективных методов ранней диагностики таких опухолей. Пятилетняя выживаемость среди пациентов с ПАКПЖ не превышает 5-6%. Поэтому поиск ключевых механизмов развития, способов ранней диагностики и прогнозирования ПАКПЖ остается актуальной областью исследований. Одним из наиболее перспективных направлений на сегодняшний день представляется исследование молекулярных механизмов, вовлеченных в процессы трансформации протоковых клеток.
Возникновение и прогрессия ПАКПЖ связаны с нарушениями дифференцировки ткани ПЖ. Дифференцировочный статус ткани регулируется «ключевыми» тканеспецифическими транскрипционными факторами (ТФ), контролирующими процессы дифференцировки и функционирования клеток. В случае ПЖ наибольшее значение имеет активность факторов PDX1 (регулирует развитие эндокринных клеток) и PTF1 (отвечает за дифференцировку ациноцитов). В последнее время появляется все больше сведений о том, что важную роль в регуляции дифференцировки клеток ПЖ играют гепатоцитарные ядерные факторы (ГЯФ).
ГЯФ – одна из наиболее полно охарактеризованных на сегодняшний день систем тканеспецифической регуляции активности генов. Эта группа включает в себя 5 неродственных семейств ТФ: HNF1, FOXA, HNF4, ONECUT и C/EBP. Экспрессия различных ГЯФ необходима для правильного развития и функционирования печени, ПЖ, желудка, кишечника, почек и ряда других органов. При этом для каждой ткани на определенных этапах развития характерен специфический спектр активности представителей ГЯФ. Центральное место в регуляторной сети ГЯФ в гепатоцитах занимает ядерный рецептор HNF4, его значение в других типах тканей также велико.
Для гена HNF4 описано два независимо регулируемых промотора, P1 и P2. С этих промоторов в результате альтернативного сплайсинга экспрессируется 12 изоформ фактора HNF4, которые делятся на 2 группы: HNF4P1 (изоформы 1-6) и HNF4P2 (изоформы 7-12). Эти группы изоформ отличаются по своим транс-активирующим свойствам и могут по-разному экспрессироваться в различных тканях и на разных стадиях их развития. Так, для ПЖ в нормальном состоянии характерна активная экспрессия изоформ группы HNF4P2 и очень слабая – HNF4P1, в то время как во время эмбриогенеза в панкреатических клетках экспрессируются обе группы изоформ.
Фактор HNF4 играет критическую роль в развитии гепатоцеллюлярной карциномы (ГК) – наиболее распространенной формы опухолей печени. Ранние стадии развития ГК характеризуются активацией экспрессии HNF4P2, а более поздние – подавлением всех изоформ HNF4. Реэкспрессия HNF4 в культурах клеток ГК сопровождается их частичной редифференцировкой и ослаблением злокачественного потенциала. Ряд работ описывает опухоле-супрессорную функцию HNF4 в клетках почки, толстой и тонкой кишки, однако роль HNF4 в прогрессии ПАКПЖ на
сегодняшний день остается мало исследованной.
В данной работе исследуется влияние изменений экспрессии изоформ HNF4 на уровень дифференцировки и биологические свойства клеток ПАКПЖ, отвечающие за развитие их злокачественного фенотипа. В качестве модельной системы использована панель из четырех клеточных линий ПАКПЖ человека, отличающихся уровнями дифференцировки и спектрами экспрессии изоформ HNF4. В исследуемых культурах клеток, в зависимости от первоначального уровня экспрессии HNF4, либо экзогенно экспрессировали изоформы HNF41 или HNF47, либо подавляли эндогенную экспрессию HNF4 с помощью малых шпилечных РНК (мшРНК). Анализ изменений экспрессии панкреа-специфических генов и биологических параметров этих клеток позволил установить основные закономерности влияния HNF4 на дифференцировочный статус и злокачественный потенциал клеток ПАКПЖ. Обнаруженные изменения активности генов были верифицированы на панели клинических образцов ткани ПАКПЖ человека.
Цель исследования
Анализ роли изменений экспрессии изоформ фактора HNF4 в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и исследование влияния этого фактора на экспрессию генов и основные биологические характеристики опухолевых клеток, определяющие выраженность их злокачественного фенотипа.
Задачи исследования
-
С помощью лентивирусных конструкций получить культуры низкодифференцированных клеток ПАКПЖ человека, экзогенно экспрессирующие изоформы HNF41 и HNF47.
-
Исследовать влияние экзогенного повышения уровней экспрессии изоформ HNF4 в низкодифференцированных клетках ПАКПЖ на уровни экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ, а также на биологические свойства этих клеток.
-
С помощью мшРНК, комплементарных к последовательности мРНК HNF4, получить культуры высоко- и умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ с подавленной экспрессией HNF4.
-
Исследовать влияние подавления синтеза HNF4 в высоко- и умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ на уровни экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ, а также на биологические свойства этих клеток.
-
Провести верификацию обнаруженных закономерностей экспрессии панкреа-специфических генов на панели клинических образцов ткани ПАКПЖ и неопухолевой панкреатической ткани тех же пациентов.
Научная новизна исследования
Научная новизна исследования определяется тем, что в представленной работе впервые произведен анализ роли изменения экспрессии изоформ HNF4 в клетках ПАКПЖ человека. Ранее роль нарушения экспрессии HNF4 в канцерогенезе была исследована в опухолях печени, кишечника и клетках инсулиномы. Антипролиферативное действие HNF4 описано также в клетках почки и эмбриональной карциномы. Однако на сегодняшний день ни одной работы,
направленной на исследование нарушений экспрессии HNF4 в клетках ПАКПЖ, в научной литературе не опубликовано.
В работе исследованы изменения экспрессии важнейших регуляторов дифференцировки панкреатических клеток (PDX1, PTF1, факторов семейств HNF1, FOXA, HNF4, ONECUT), которые наблюдаются при повышении или понижении уровней экспрессии изоформ HNF4 в клеточных линиях ПАКПЖ человека. Параллельно исследованы изменения экспрессии секретируемых белков ПЖ (-амилаза-2a, эластаза-2a), регулятора клеточного цикла p21CIP1/WAF1 и белков межклеточных контактов E- и N-кадхерина. Показано, что изменения экспрессии HNF4 могут оказывать значительное влияние на уровень дифференцировки клеток ПАКПЖ.
Кроме того, в работе исследовано влияния изменения экспрессии HNF4 на биологические характеристики клеток ПАКПЖ, определяющие их злокачественный фенотип: пролиферативную активность, способность к колониеобразованию и миграционный потенциал. В результате исследований обнаружено, что в клетках ПАКПЖ фактор HNF4 может выполнять функции опухолевого супрессора и оказывать ингибирующий эффект на их пролиферативную и колониеобразующую активность, а также регулировать способность этих клеток к миграции. Более того, впервые описано ослабление пролиферативного и клоногенного потенциала при подавлении гиперэкспрессированного HNF4 в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ.
Обнаруженные при исследовании клеточных культур закономерности экспрессии HNF4 и других тканеспецифических генов верифицированы на панели клинических образцов ПАКПЖ человека. Впервые произведен анализ нарушений экспрессии изоформ HNF4 в ткани ПАКПЖ и корреляций этих нарушений с экспрессией маркеров дифференцировки клеток ПЖ.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическое значение работы заключается в описании новых взаимосвязей между экспрессией тканеспецифических ТФ и опухолевой прогрессией ПАКПЖ. Исследование зависимости между изменениями экспрессии HNF4 и регуляторов дифференцировки клеток ПЖ является важным шагом в направлении установления механизмов, опосредующих прогрессию ПАКПЖ. Анализ корреляций между экспрессией тканеспецифических генов и биологическими свойствами клеток позволит лучше понять причины высокой агрессивности ПАКПЖ.
Практическое значение работы определяется описанием нового важного регулятора прогрессии ПАКПЖ – HNF4. Исследование его функций в ПАКПЖ может выявить новые биологические маркеры этого типа опухолей и молекулярные механизмы, играющие критическую роль в развитии ПАКПЖ. Эта информация может быть использована для создания новых методов диагностики и разработки новых подходов к терапии ПАКПЖ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Нарушения экспрессии изоформ ядерного рецептора HNF4 играют важную роль в формировании злокачественного фенотипа ПАКПЖ;
-
Получены и охарактеризованы культуры низкодифференцированных клеток ПАКПЖ человека, экзогенно экспрессирующие изоформы HNF41 и
HNF47, а также культуры высоко- и умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ человека с подавленной экспрессией HNF4;
-
Экзогенная экспрессия изоформ HNF4 в низкодифференцированных клетках ПАКПЖ приводит к их частичной редифференцировке и снижению злокачественного потенциала;
-
При подавлении синтеза HNF4 в высокодифференцированных клетках ПАКПЖ снижается уровень дифференцировки и усиливается злокачественный потенциал;
-
Подавление синтеза HNF4 в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ приводит к неоднозначным изменениям их дифференцировочного статуса и биологических свойств;
-
Нарушение экспрессии изоформ HNF4 является частым сбытием в клинических образцах ПАКПЖ человека;
-
Закономерности экспрессии HNF4 и ряда других панкреа-специфических генов в клинических образцах ПАКПЖ человека сходны с наблюдаемыми in vitro.
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась 26 сентября 2013 на объединенной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, механизмов гибели опухолевых клеток, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов и механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 сообщение на российской конференции, 2 сообщения на международных конференциях, 1 работа в сборнике научных трудов конкурса молодых ученых.
Объем и структура диссертации
Цели и задачи исследования
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ) является наиболее распространенной формой опухолевых заболеваний поджелудочной железы (ПЖ). Она отличается чрезвычайно высокой агрессивностью, высокой скоростью прогрессии, бессимптомным течением ранних стадий заболевания. Из-за этих особенностей ПАКПЖ, как правило, диагностируется на поздних стадиях развития и плохо поддается лечению с использованием большинства современных терапевтических подходов. На сегодняшний день молекулярные механизмы развития этого типа опухолей остаются плохо исследованными, достаточно эффективных диагностических и предиктивных биомаркеров этого типа опухолей также не описано. Ввиду перечисленных фактов исследование механизмов возникновения и прогрессии ПАКПЖ является одной из наиболее актуальных проблем современной фундаментальной онкологии.
Закладка и формирование ПЖ в ходе эмбрионального развития регулируется сложным каскадом транскрипционных факторов, среди которых важную роль играет группа гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ). Эта группа включает 5 неродственных семейств транскрипционных факторов (HNF1, FOXA, HNF4, ONECUT, C/EBP), экспрессирующихся в различных сочетаниях в клетках печени, ПЖ, кишечника, желудка, почки и ряда других эпителиальных органов. Факторы этих пяти семейств образуют в клетках комплексную регуляторную сеть, контролирующую различные этапы развития тканей и их функции. Ряд исследований показал, что в гепатоцитах центральную роль в регуляции этой сети играет фактор HNF4. Транскрипция гена HNF4A происходит с двух альтернативных промоторов (P1 и P2), в результате чего образуется две группы изоформ, HNF4P1 и HNF4P2, отличающихся транс-активирующей способностью, что позволяет им регулировать различные наборы генов. Соотношение уровней экспрессии изоформ групп HNF4P1 и HNF4P2 имеет определяющее значение для дифференцировки гепатоцитов и может влиять на дифференцировку других клеток; для разных органов характерны специфические спектры экспрессии изоформ HNF4.
Нарушения экспрессии изоформ HNF4 тесно связаны с возникновением и прогрессией гепатоцеллюлярной карциномы – самой распространенной формы первичных опухолей печени. HNF4 в гепатоцитах выполняет роль опухолевого супрессора, восстановление утраченной экспрессии HNF4P1 в дедифференцированных клетках гепатоцеллюлярной карциномы приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа этих клеток. Противоопухолевая функция HNF4 описана также в клетках кишечного эпителия, почки, эмбриональной карциномы, инсулиномы. Роль HNF4 в возникновении и прогрессии ПАКПЖ на сегодняшний день остается практически не исследованной.
Данная работа посвящена исследованию возможного влияния изменений экспрессии изоформ HNF4 в ПАКПЖ на уровень дифференцировки и биологические свойства клеток, отвечающие за развитие их злокачественного фенотипа. В качестве модельной системы для исследования функций HNF4 в клетках ПАКПЖ мы использовали панель из четырех клеточных линий ПАКПЖ человека, отличающихся друг от друга уровнями дифференцировки и спектрами экспрессии изоформ HNF4. В зависимости от исходных уровней экспрессии HNF4 в исследуемых клеточных культурах, в них либо экзогенно экспрессировали изоформы HNF41 или HNF47, либо подавляли эндогенную экспрессию HNF4 с помощью малых шпилечных РНК (мшРНК). Анализ изменений спектров экспрессии панкреа-специфических генов и биологических параметров клеток при изменениях в них уровней синтеза изоформ HNF4 позволил установить основные закономерности влияния HNF4 на дифференцировочный статус и злокачественный потенциал клеток ПАКПЖ. Обнаруженные изменения активности тканеспецифических генов, вызванные изменениями экспрессии HNF4, были верифицированы на панели клинических образцов ткани ПАКПЖ, полученных при проведении гастропанкреатодуоденальных резекций в отделении опухолей печени и поджелудочной железы ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. 1.2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью настоящей работы является анализ роли изменений экспрессии изоформ фактора HNF4 в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и исследование влияния этого фактора на экспрессию генов и основные биологические характеристики опухолевых клеток, определяющие выраженность их злокачественного фенотипа.
Научная новизна исследования определяется тем, что в представленной работе впервые произведен анализ роли изменений экспрессии изоформ HNF4 в клетках ПАКПЖ человека. Ранее роль нарушений экспрессии HNF4 в канцерогенезе была исследована в опухолях печени, кишечника и клетках инсулиномы. Антипролиферативное действие HNF4 описано также в клетках почки и эмбриональной карциномы. Однако на сегодняшний день ни одной работы, направленной на исследование нарушений экспрессии HNF4 в клетках ПАКПЖ, в научной литературе не опубликовано.
В работе исследованы изменения уровней экспрессии важнейших регуляторов дифференцировки панкреатических клеток (PDX1, PTF1, факторов семейств HNF1, FOXA, HNF4, ONECUT), которые наблюдаются при активации или подавлении экспрессии изоформ HNF4 в клеточных линиях ПАКПЖ человека. Параллельно в этих же культурах проанализированы изменения экспрессии функциональных генов ПЖ (-амилаза-2a, эластаза-2a), регулятора пролиферации p21CIP1/WAF1 и белков межклеточных адгезионных контактов E-кадхерина и N-кадхерина. Показано, что изменения экспрессии HNF4 могут оказывать значительное влияние на уровень дифференцировки клеток ПАКПЖ.
Другой важной частью работы является исследование влияния изменений экспрессии HNF4 на биологические характеристики клеток ПАКПЖ, определяющие уровень их злокачественности: пролиферативную активность, способность к колониеобразованию и миграционный потенциал. В результате исследований обнаружено, что фактор HNF4 в клетках ПАКПЖ может выполнять функции опухолевого супрессора и оказывать ингибирующий эффект на их пролиферативную и колониеобразующую активность, а также регулировать способность этих клеток к миграции. Более того, впервые описано ослабление пролиферативного и клоногенного потенциала при подавлении гиперэкспрессированного HNF4 в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ.
Обнаруженные при исследовании клеточных культур закономерности экспрессии HNF4 и других тканеспецифических генов верифицированы на панели клинических образцов ПАКПЖ человека. Впервые произведен анализ нарушений экспрессии изоформ HNF4 в ткани ПАКПЖ и корреляций этих нарушений с экспрессией маркеров дифференцировки клеток ПЖ.
Исследование взаимосвязей между экспрессией групп определенных генов и прогрессией ПАКПЖ представляет перспективное направление в современной онкологии. Установление роли отдельных факторов в развитии злокачественного фенотипа опухолевых клеток ПЖ позволит обнаружить новые биомаркеры этого типа опухолей, которые можно будет использовать для разработки новых диагностических и прогностических подходов
Поджелудочная железа: строение и функции
В основе этих процессов лежит изменение активности множества генов и кодируемых ими белков, участвующих в регуляции функций и биологических свойств клетки. По той роли, которую играют эти изменения в формировании злокачественного фенотипа клетки, выделяют следующие типы генов:
Онкогены - клеточные или вирусные гены, активация которых повышает вероятность опухолевого перерождения клеток; Протоонкогены - гены, активность которых свойственна нормальным клеткам, однако изменение их активности или функции в результате мутаций превращает их в онкогены; Опухолевые супрессоры - клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность малигнизации клеток.
Изменения уровней экспрессии или нуклеотидной последовательности этих генов приводят к нарушению нормальных функций кодируемых ими белков, вовлеченных в регуляцию клеточного деления, дифференцировки, подвижности и многих других свойств. Исследование механизмов влияния этих белков на состояние клетки в целом и закономерностей взаимодействия между ними может дать ключ к пониманию общей схемы появления и развития злокачественных опухолей, и, следовательно, указать возможности терапии этих заболеваний. Для опухолей эпителиального происхождения, составляющих большую часть всех злокачественных новообразований, крайне важным комплексом изменений свойств является эпителиально-мезенхимальный переход. 2.1.2. Эпителиально-мезенхимальный переход «Эпителиально-мезенхимальный переход» (ЭМП) – общее совокупное название изменений, при которых эпителиальные клетки утрачивают характерный фенотип и приобретают признаки мезенхимальных. ЭМП характеризуется определенными биохимическими и морфологическими изменениями. Это довольно распространенный процесс, наблюдающийся в ходе нормального эмбриогенеза: превращение эпителиальных клеток в мезенхимальные наблюдается при гаструляции, а также во время закладки мышечной ткани и периферической нервной системы [Thiery, 2002]. В определенных условиях может быть осуществлен и обратный процесс мезенхимально-эпителиального перехода (МЭП) [Locascio and Nieto, 2001]. Схематически цикл
ЭМП наблюдается также при прогрессии эпителиальных опухолей, что приводит к утрате дифференцировки клеток и возникновению более злокачественного фенотипа. Одним из ключевых событий ЭМП является подавление экспрессии белка Е-кадхерина, основного компонента адгезионных межклеточных контактов, наблюдаемое при воздействии на клетки таких факторов, как трансформирующий фактор роста р (TGFp), фактор роста фибробластов, и других [Thiery, 2002; Christofori and Semb, 1999]. Подавление экспрессии E-кадхерина часто опосредуется действием транскрипционного репрессора SNAI1, связывающегося с промоторным участком гена CDH1 [Cano et al, 2000]. Кроме SNAI1, достаточно значимую роль в ЭМП играют такие транскрипционные факторы как SNAI2 (SLUG), ZEB1 и ZEB2, E47. Их связывание с промотором CDH1 подавляет экспрессию не только этого, но и близлежащих генов, что приводит к запуску генетической программы дедифференцировки клеток [De Craene et al, 2005; Moreno-Bueno et al, 2006; Vandewalle et al, 2005]. Сходные эффекты вызывает действие факторов TWIST 1 и FOXC2, хотя прямого связывания этих белков с регуляторными районами гена CDH1 описано не было [Yang et al, 2004; Mani et al, 2007]. Необычным в данной регуляторной схеме является отсутствие какой-либо иерархии среди факторов, репрессирующих экспрессию E-кадхерина: в опухолевых клетках, экспрессирующих одновременно несколько ЭМП-индуцирующих генов, подавление экспрессии только одного из них сопровождается сильным изменением клеточного фенотипа в сторону эпителиального [Casas et al, 2011; Olmeda et al, 2008; Spadema et al, 2008]. В последнее время появляется все больше свидетельств в пользу того, что малые некодирующие РНК (микроРНК) также играют важную роль в индукции ЭМП и МЭП; наиболее значимым является понижение уровней экспрессии семейств miR-200 и miR-34, регулирующих экспрессию Е-кадхерина и SNAI1 [Park et al, 2008; Siemens et al, 2011].
Снижение экспрессии Е-кадхерина приводит к освобождению из адгезионных контактов Р-катенина, который транслоцируется в ядро и изменяет экспрессию ряда генов, связанных с клеточной адгезией и пролиферацией [Morali et al, 2001]. В дальнейшем влияние -катенина опосредуется Wnt-сигнальным каскадом за счет активации экспрессии гена LEF/TCF4 [Korinek et al, 1998]. В результате прекращается экспрессия клаудинов, десмоплакина и цитокератинов-8, -9 и -18, являющихся маркерами эпителиальных клеток; во внеклеточном матриксе появляется фибронектин, а в цитоскелете - виментин и витронектин, характерные для подвижных мезенхимальных клеток [Thiery and Sleeman, 2006]. Частым событием при ЭМП является активация другого представителя семейства кадхеринов, N-кадхерина, однако она наблюдается не во всех случаях ЭМП и не оказывает существенного влияния на морфологию клеток [Maeda et al, 2005].
Для приобретения клетками подвижности необходимо также изменение взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом (ВКМ). Контакты клеток с ВКМ обеспечиваются белками-интегринами клеточной мембраны, изменение спектра экспрессии которых может влиять на специфичность связывания клеток с различными типами ВКМ, а также активировать протеолитические ферменты, воздействующие на белки ВКМ (например, матриксные металлопротеиназы (ММР) -2 и -9) [Hood and Cheresh, 2002]. Таким образом, в результате ЭМП нарушаются межклеточные контакты и контакты с внеклеточным матриксом, формируемые опухолевыми клетками, клетки приобретают подвижность и утрачивают дифференцировку. Эти новые свойства позволяют им перемещаться в соседние ткани (инвазия) или в кровяное русло. Во втором случае трансформированные клетки могут с током крови переноситься в удаленные органы и ткани и локализоваться там, образуя метастазы. Именно инвазия и метастазирование являются наиболее опасными процессами при развитии опухолей; самые злокачественные из всех типов опухолевых новообразований отличаются высоким метастатическим потенциалом. Одним из ярких представителей таких опухолей с очень ранним и агрессивным проявлением метастатической активности является протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ). Для понимания ее характерных свойств и особенностей необходимо детально рассмотреть строение и функции нормальной поджелудочной железы.
Поджелудочная железа (ПЖ) – орган смешанной секреции, вторая по величине железа человеческого организма после печени (у взрослого человека длина ПЖ составляет 14-18 см, масса – до 80 г). Анатомически она подразделяется на четыре отдела: головку, тело, хвост и выводной проток (Рисунок 2). Выводной проток ПЖ проходит через весь орган от хвоста к головке и впадает в просвет двенадцатиперстной кишки, предварительно соединившись с желчным протоком. Утолщение стенки двенадцатиперстной кишки в месте ее соединения с протоком ПЖ носит название фатерова соска [Сапин, 1993].
Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени
Экзогенная экспрессия как HNF41, так и HNF47 в клетках Panc1 и MiaPaCa2 сопровождается повышением уровней экспрессии генов PDX1 и PTF1A по сравнению с контрольными культурами. Степень активации транскрипции PDX1 не зависит от уровня синтеза HNF4 и от того, какая группа изоформ HNF4 экспрессируется в клетках. Ген PTF1A значительно сильнее активируется в клетках MiaPaCa2-HNF47, чем в MiaPaCa2-HNF41, хотя уровни синтеза суммарного HNF4 в них очень близки (Рисунок 14). Да не, навряд ли. В конце концов, 3 – активатор, а в MiaPaCa2-1 его больше. А если дело в том, что остальных изоформ меньше – то Панкам это не мешало В клетках Panc1-HNF4 подобных различий не наблюдается. Активация экспрессии факторов семейства HNF1 в клетках Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4, напротив, носит изоформ-специфический характер. Так, ген HNF1A активируется только в HNF4P2-экспрессирующих культурах Panc1 и MiaPaCa2. Экспрессия HNF1B выявляется только в клетках Panc1-HNF41; под действием HNF4P2 активации этого гена в клетках Panc1 не происходит. В клетках MiaPaCa2 HNF4-зависимой индукции экспрессии HNF1B также не происходит.
Экспрессия генов семейства FOXA в клетках Panc1 и MiaPaCa2 под действием экзогенного HNF4 также усиливается. При этом активация гена FOXA1 происходит только в HNF4P2-экспрессирующих клетках, в то время как экспрессия гена FOXA2 индуцируется в равной степени обеими группами изоформ HNF4.
Фактор HNF6, играющий критическую роль в дифференцировке протоковых клеток, не экспрессируется в дедифференцированных культурах клеток Panc1 и MiaPaCa2. Экзогенной экспрессии изоформ HNF41 и HNF47 недостаточно для восстановления активности гена HNF6. В то же время в клетках Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 наблюдается активация транскрипции его гена-паралога OC2, выполняющего в клетках ПЖ вспомогательную роль.
Значимых HNF4-зависимых изменений экспрессии фактора HNF4 в исследуемых культурах выявлено не было: в клетках Panc1-HNF4 уровни экспрессии HNF4G слабо отличаются от наблюдаемого в контрольной культуре Panc1-ref, а в клетках MiaPaCa2, изначально не экспрессирующих HNF4, его HNF4-зависимой индукции не происходит.
Таким образом, в результате ОТ-ПЦР анализа выявлен целый блок тканеспецифических ТФ, транскрипция которых индуцируется в дедифференцированных культурах ПАКПЖ Panc1 и MiaPaCa2 при экзогенной экспрессии HNF4. Все эти факторы являются регуляторами дифференцировки различных типов клеток ПЖ. Экспрессия PDX1, PTF1, FOXA1 и FOXA2, HNF1, OC-2 характерна для эндокринных и экзокринных дифференцированных панкреатических клеток, в то время как HNF1 наиболее активно экспрессируется в частично дифференцированных клетках-предшественниках ПЖ. Низкодифференцированные клетки Panc1 и MiaPaCa2 отличаются от нормальной ткани ПЖ значительно сниженным уровнем экспрессии всех вышеперечисленных генов (Рисунок 12). Таким образом, описанная HNF4-зависимая индукция экспрессии целого блока регуляторов развития ПЖ в клетках Panc1 и MiaPaCa2 указывает на их частичную редифференцировку. Этот результат является серьезным аргументом в пользу гипотезы об опухоле-супрессорной функции HNF4 в протоковых клетках ПЖ.
Важно отметить, что в культурах Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 выявляется одновременная экспрессия факторов PDX1 и PTF1. Коэкспрессия этих регуляторов транскрипции характерна для эмбриональных панкреатических клеток на стадии частичной дифференцировки [Zhou et al., 2007]. Таким образом, клетки Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 по своим свойствам могут оказаться близки к панкреатическим клеткам-предшественникам. Это предположение подтверждается как минимум двумя наблюдениями:
1) Клетки Panc1 и MiaPaCa2, как и все клетки ПАКПЖ, происходят из протоковых клеток ПЖ; в ряде исследований показано, что клетки, выстилающие протоки ПЖ, способны к контролируемой частичной дедифференцировке и редифференцировке в другие типы клеток ПЖ, то есть являются своеобразным пулом мультипотентных панкреатических клеток [Bonner-Weir and Sharma, 2002; Grapin-Botton, 2005]. При повреждениях ПЖ регенерация происходит за счет протоковых клеток (и в меньшей степени клеток островков), которые начинают активно делиться и мигрировать в место повреждения [Bonner-Weir et al., 1993; Kim and Hebrok, 2001]. В процессе регенерации эндокринной или экзокринной части ПЖ в протоковых клетках повышается экспрессия PDX1 и PTF1, соответственно, и понижается экспрессия HNF6 – маркера протоковых клеток [Li et al., 2010; Criscimanna et al., 2011]. Описанный спектр экспрессии генов близок к наблюдаемому в культурах Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4.
2) Индукция экспрессии PDX1 и PTF1 вызывается экзогенной экспрессией обеих изоформ HNF4. Однако выраженная экспрессия HNF4P1 наблюдается в панкреатических клетках только во время их эмбрионального развития и снижается после окончательной дифференцировки [Tanaka et al., 2006; Harries et al., 2008; Huang et al., 2008]. Таким образом, в клетках Panc1-HNF41 и MiaPaCa2-HNF41 могут активироваться HNF4-зависимые сигнальные пути, характерные именно для частично дифференцированных клеток ПЖ, которые и приводят к индукции PDX1 и PTF1.
Из всех исследованных тканеспецифических ТФ PDX1, PTF1, FOXA2 и OC-2 проявляют общую тенденцию: их экспрессия в клетках Panc1 и MiaPaCa2 может с близкой эффективностью индуцироваться обеими группами изоформ HNF4P1 и HNF4P2. Только для PTF1 наблюдаются различия в HNF41- и HNF47-зависимой индукции его экспрессии в клетках MiaPaCa2-HNF4; в то же время в клетках Panc1-HNF4 подобных различий не выявлено. Группы изоформ HNF4P1 и HNF4P2 обладают разными транс-активационными свойствами, поэтому логично было бы предположить, что они будут дифференциально активировать экспрессию различных блоков генов, характерных для эмбрионального (HNF4P1) или взрослого (HNF4P2) состояния ПЖ, как это показано для гепатоцитов [Torres-Padilla et al., 2002]. Однако полученные результаты показывают, что важнейшие регуляторы дифференцировки панкреатических клеток (PDX1, PTF1, FOXA2) могут быть индуцированы обеими группами изоформ HNF4. Возможно, в клетках ПЖ множества генов-мишеней HNF4P1 и HNF4P2 перекрываются значительно сильнее, чем в гепатоцитах, благодаря чему в эмбриональный период развития ПЖ изоформы групп P1 и P2 действуют скоординировано, а не взаимоисключающе. Эта гипотеза подтверждается исследованием эффектов экзогенной экспрессии изоформ HNF42 и HNF48 в клетках инсулиномы крысы INS-1, в котором показано, что изоформы группы HNF4P1 регулируют уровни экспрессии приблизительно вдвое большего количества генов, чем HNF4P2. При этом 70% HNF4P2-индуцируемых генов также являются и HNF4P1-индуцируемыми [Erdmann et al., 2007].
Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках Pancl-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4
При исследовании влияния экзогенной экспрессии изоформ HNF4 на характеристики низкодифференцированных клеток Рапс1 и МіаРаСа2 мы наблюдали достаточно неожиданный эффект. HNF4-экспрессирующие клетки этих линий, отличающиеся от контрольных культур более высоким уровнем дифференцировки, сниженными скоростью роста и клоногенным потенциалом, обладали достоверно более высокой способностью к направленной миграции. Поэтому возможное влияние подавления экспрессии HNF4 на миграционный потенциал клеток CaPan2 представляло для нас особенно большой интерес. Результаты нескольких независимых экспериментов по исследованию способности клеток Capan2-ref и СаРап2-shHNF4 к направленной миграции в камерах Бойдена приведены на Рисунке 33. Согасно этим результатам, клетки обеих культур CaPan2-shHNF4 достоверно отличаются от контрольных клеток CaPan2-ref повышением способности к направленной миграции.
Усиление миграционного потенциала в культурах CaPan2-shHNF4 согласуется с общей тенденцией к дедифференцировке и повышению злокачественного потенциала клеток CaPan2 при подавлении экспрессии HNF4. Однако этот результат не согласуется с описанной в клетках Рапс1 и МіаРаСа2 способностью HNF4 стимулировать направленную миграцию клеток. Как подавление, так и гиперэкспрессия фактора HNF4 в клетках ПАКПЖ вызвали однонаправленные изменения их миграционной способности. Это сильнейший аргумент в пользу того, что НМЧ-зависимая регуляция миграционных свойств клеток происходит не напрямую, а опосредуется различными клеточными механизмами и сигнальными путями. По всей видимости, направление влияния, оказываемого на миграционную способность клеток этими регуляторными механизмами, зависит от экспрессии генов, дифференцировочного статуса и других свойств конкретных клеток (так называемого «клеточного контекста»). Так, ранее мы уже выдвигали гипотезу о том, что усиление миграции клеток Panc1-HNF4 и MiaPaCa2-HNF4 связано с их частичной редифференцировкой и приобретением свойств, характерных для панкреатических клеток-предшественников. Ниже мы постараемся более детально проанализировать значение повышения миграционного потенциала клеток CaPan2-shHNF4.
Как правило, повышение миграционной способности эпителиальных клеток связано с ЭМП. Однако подавление экспрессии HNF4 в клетках CaPan2 не сопровождается снижением уровня экспрессии E-кадхерина, основного белка адгезионных контактов эпителиальных клеток. Более того, в них наблюдается подавление экспрессии N-кадхерина, активация экспрессии которого может наблюдаться при ЭМП. Неполная дедифференцировка клеток CaPan2-shHNF4 подтверждается и сохранением в них высокой экспрессии ряда тканеспецифических ТФ (HNF1, FOXA2, OC-2). Протоковые клетки ПЖ в норме обладают ограниченной способностью к временной дедифференцировке; таким образом, для объяснения наблюдаемых изменений можно снова обратиться к обсуждавшейся выше теории о том, что протоковые клетки, из которых развивается ПАКПЖ, обладают свойствами панкреатических клеток-предшественников.
В экспериментах по регенерации ПЖ показано, что после повреждения органа очаги усиленной пролиферации панкреатических клеток локализуются в протоках, совпадают с местами экспрессии фактора PDX1 и, по всей видимости, вызваны активным делением протоковых клеток [Bonner-Weir et al., 2008; Li et al., 2010]. В активно делящихся протоковых клетках также наблюдается подавление экспрессии фактора HNF6 и активация HNF1, что указывает на их частичную дедифференцировку [Li et al., 2010]. Частично дифференцированные клетки ПЖ одновременно экспрессируют факторы PDX1 и PTF1 [Burlison et al., 2004; Zhou et al., 2007]. Для них характерно также повышение миграционного потенциала, необходимое для перемещения в места повреждения ПЖ и их репарации [Kim and Hebrok, 2001]. Все вышеперечисленные особенности наблюдаются и в клетках культур CaPAn2-shHNF4 (хотя экспрессия генов PDX1 и PTF1A при подавлении HNF4 падает, но не исчезает совсем). Таким образом, механизмы, отвечающие за усиление миграционной активности клеток CaPan2-shHNF4, могут быть очень близки к механизмам, регулирующим частичную дедифференцировку нормальных протоковых клеток ПЖ. К сожалению, на сегодняшний день детали этого процесса изучены недостаточно, поэтому для более точного выявления роли HNF4 в регуляции миграционной способности панкреатических клеток необходимы дополнительные исследования.
Итак, в процессе регенерации ткани ПЖ протоковые клетки приобретают характеристики, близкие к описанным нами в клетках CaPan2-shHNF4. По всей видимости, высокая вероятность возникновения опухолей из протоковых клеток ПЖ и высочайшая агрессивность этих опухолей вызваны именно этой особенностью протоковых клеток, в результате чего вероятность их неопластической трансформации резко повышается. Подавление экспрессии фактора HNF4 вызывает аналогичные изменения клеточных свойств и экспрессии генов в высокодифференцированных клетках ПАКПЖ человека CaPan2, а именно: снижение уровней экспрессии ряда панкреа-специфических генов, повышение скорости роста, синтеза ДНК, колониеобразующей и миграционной способностей этих клеток. Другими словами, мшРНК-опосредованное подавление синтеза HNF4 в клетках CaPan2 сопровождается усилением их злокачественных характеристик, что указывает на его опухоле-супрессорную роль в этих клетках.
В первой и второй частях данной работы нами была исследована возможная роль изменений экспрессии ядерного рецептора HNF4 в регуляции свойств клеток ПАКПЖ человека. Его экзогенная экспрессия в дедифференцированных клетках Panc1 и MiaPaCa2 вызывает их частичную редифференцировку и ослабление злокачественных свойств. Подавление синтеза HNF4 в высокодифференцированных клетках CaPan2 сопровождается противоположными эффектами – снижением уровней экспрессии дифференцировочных маркеров и усилением злокачественного потенциала этих клеток. Таким образом, транскрипционный фактор HNF4 в перечисленных клеточных линиях проявляет свойства, характерные для опухолевых супрессоров. В выбранную нами для исследований панель клеточных линий ПАКПЖ человека также входит линия AsPC1, которая характеризуется средним уровнем дифференцировки и повышенным по сравнению с нормальной тканью ПЖ уровнем экспрессии обеих групп изоформ HNF4: как свойственной для панкреатических клеток группы HNF4P2, так и нехарактерной для них группы HNF4P1 (Рисунок 12). На сегодняшний день значение усиления экспрессии HNF4 в опухолевых клетках практически не изучено; мы предположили, что гиперэкспрессия HNF4 может оказывать влияние на прогрессию клеток ПАКПЖ. В данной части работы исследуется влияние мшРНК-опосредованного подавления экспрессии HNF4 на свойства клеток AsPC1.
