Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 8
ГЛАВА 1. Морфологические и биохимические характеристики апоптоза 8
Индукция апоптоза. 9
Эффекторная стадия , 10
Стадия деградации 11
ГЛАВА 2. Белки, процесс апоптоза в клетке 12
Семейство Bcl-2 подобных белков . 12
Р53. 17
CD95 (Fas/APO-1) 19
ГЛАВА 3. Экспрессия онкомаркеров прив-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях 21
Стадии дифферепцировки В-лимфогпшюв и связяпные с ними заболевания человека. 21
Экспрессия апоптотическах биомаркеров на ранних стадиях дифферепцировки В-клеток . 22
Экспрессия апоптотических биомаркеров на зрелых клетках. 25
ЧАСТЬ II. Результаты собственных исследовании 38
ГЛАВА 1. Материалы и методы 38
1.1 Моиоклоналъпые и политональные антитела (МКА) 38
1.2 Реактивы 39
1.3 Общая характеристика использованного в работе материала 40
1.4 Пробоподготовка 42
1.5 Окрашивание клеток 42
1.6 Проточи Цитометрическгш анализ 46
1.7.Микроскопический анализ 47
1.8 Программное обеспечение 47
ГЛАВА 2. Исследование экспрессии лпоптотических белков при лимфопролиферативных заболеваниях 49
Изучение экспрессии белков группы Bcl-2 51
Изучение экспрессии р53 68
Изучение экспрессии CD95 77
ГЛАВА 3. Обсуждение результатов 83
Выводы 95
Список литературы 96
- Семейство Bcl-2 подобных белков
- Экспрессия апоптотическах биомаркеров на ранних стадиях дифферепцировки В-клеток
- Общая характеристика использованного в работе материала
- Изучение экспрессии белков группы Bcl-2
Введение к работе
Актуальность темы.
Устойчивость опухоли к проводимой терапии - одна из проблем, наиболее остро стоящих перед современной онкологией. Причин возникновения подобной резистентности множество, и одна из них - неспособность клсток активировать программу клеточной гибели (апоптоз).
Программированная клеточная гибель - нормальный физиологический процесс, происходящий, в частности, при дифференцировке клеток различной природы, в том числе лимфоцитов. Как известно, все клетки крови развиваются из штіорипотентной стволовой клетки; при развитии лимфоцитарного ростка гемопоэза до момента получения зрелых лимфоцитов происходит гибель до 90% предшественников и сохраняются только клетки с функционально-активными рецепторами. Несмотря на существование данных о том, что гибель клеток происходит путем апоптоза, нет точных сведений, на какой стадии дифференцировки задействован тот или иной механизм индукции апоптоза.
Нарушения в программе дифференцировки клеток крови приводит к развитию гематологических заболеваний, в том числе лейкозов. Четкое понимание механизмов клеточного и молекулярного контроля нормального развития клеток крови может дать ключ к ответу на вопрос о происхождении и лечении этих заболеваний.
Лимфопролнферативные заболевания представляют собой накопление или пролиферацию клеток лимфоидного ряда на определенной стадии дифференцировки. Поэтому мы использовали эти заболевания в качестве модельной системы для изучения механизмов индукции апоптоза на этапах дифференцировки лимфоидных клеток.
Многие формы гемобластозов, в том числе В-клеточного происхождения, достаточно тяжело поддаются лечению. И хотя в последние годы достигнуты значительные успехи в терапии неходжкинских лимфом (НХЛ), у большого
количества больных все же ие удается достичь ремиссии при применении современных режимов химиотерапии. Исходя из этого, возникает необходимость в определении тех критериев, которые помогли бы выявить больных, требующих других, возможно более агрессивных, типов лечения.
К распространению опухолевых клеток могут приводить мутации онкогенов и генов - опухолевых супрессоров. Эти изменения могут снижать эффективность противоопухолевых агентов, так как действие многих цитотоксических препаратов и радиоактивного облучения приводит к гибели клеток путем апоптоза. Таким образом, изучение путей, задействованных в регуляции апоптоза нормальных и опухолевых гемопоэтических клеток, может способствовать разработке усовершенствованных методов терапии при лечении лейкозов и лимфом.
Цель работы.
Целью работы было исследовать экспрессию регуляторов апоптоза, таких как CD95, ВсІ-2, р53т Вах, а также их соотношение на различных стадиях дифференцировки В-лимфоцитов человека.
Задачи исследования.
Исследовать экспрессию регулирующих апоптоз онкобелков Вс1-2 и Вах и их соотношение в лейкозных В-клетках разных степеней дифференцировки;
Исследовать экспрессию про-апоптотического белка р53 на примере различных лимфопролиферативных заболеваний.
Исследовать экспрессию CD95 на стадиях дифференцировки В-клеток.
Изучить взаимное соотношение экспрессии Вс1-2, Вах, р53 и CD95 в клетках и корреляционные связи между ними.
Научная новизна
С помощью одних и тех же моноклопальных антител была изучена экспрессия апоптотических белков на широком спектре гемобластозов.
Выявлены различия в экспрессии Вс1-2 па этапах дифференцировки В-лимфоцитов человека: высокая экспрессия белка обнаружена на стадиях периферических В-клеток при гемобластозах. Вс1-2 отсутствовал при заболеваниях, соответствующих стадиям ранних и активированных В-клеток, и на стадии плазматических клеток.
Выявлена зависимость экспрессии Вс1-2 от цитологического типа фолликулярной лимфомы.
Обнаружено большое количество экспрессирующих Вс1-2 клеток при хроническом лимфолейкозе. Их число значительно снижалось в случае достижения клшшко-гематологической ремиссии. Одновременно с этим наблюдалось снижение значения соотношения Bct-2/Bax.
НАУЧ НО-П РАКТИ ЧЕСКАЯ 3 ЫАЧ И М О СТЬ.
Выбранные нами методы определения экспрессии внутриклеточных онкомаркеров могут быть использованы в клинической практике.
Выявление экспрессии Вс1-2 при острых лимфобластных лейкозах может быть признаком быстрого рецидивирования и может требовать более агрессивного лечения.
Исследование Вс1-2 и соотношения ВсІ-2/Вах при хроническом лимфолейкозе может использоваться как дополнительный фактор, подтверждающий достижение или не достижение клшшко-гематологической ремиссии на молекулярном уровне.
Члсть і. Обзор литературы.
Семейство Bcl-2 подобных белков
Представители семейства Всі-2-подобных белков регулируют ответ клеток на специфические и неспецифические сигналы, действуя на эффекторной стадии апоптоза (Meijerink et al, 1998; Yang and Korsmeyer, 1996). Впервые Bcl-2 был обнаружен при фолликулярной лимфоме на хромосоме 18 человека в месте транслокации t(14;18) гена bcl-2 с локусом гена тяжелых цепей иммуноглобулинов (Kroemer, 1997; Meijerink, 1998).
К семейству Bcl-2-подобных белков относятся как ингибиторы апоптоза (Bcl-2, BC1-XL, ВСІ-W, MCL-1), так и его активаторы (Вах, Bak, Bad), различающиеся по структуре, механизмам активации и локализации в тканях (Рис.1) (HSU et al, 1997; Kroemer, 1997; Wickremasinghe and Hoffbrand, 1999, Wolter et al, 1997; Yang and Korsmeyer, 1996). Представители семейства различаются также по количеству Bcl-2-гомологичных участков (от ВН1 до BH4), что определяет их способность взаимодействовать друг с другом и с другими, не родственными белками.
Практически все известные белки семейства Вс1-2 содержат два консервативных домена - ВН1 и ВН2. Все анти-апоптотические представители семейства содержат также дополнительный домен около N-конца - ВН4 (Adams and Cory, 1998; Zha et al, 1996). Этот домен не является необходимым для димеризации in vivo, но его удаление ослабляет функции Вс1-2 как ингибитора апоптоза (Hanada et al, 1995; Zha et al, 1996). Домен BH4 необходим для гомодимеризации Bcl-2, ВНЗ - для гомодимеризации Вах, и за счет этих доменов происходит гетеродимеризация Bcl-2 и ВСІ-XL с индукторами апоптоза (Huang et ai, 1998; Kroemer, 1997; Sattler and Liang, 1997; Simonian et al, 1996; Zha et al, 1996).
Большинство Bcl-2-подобных белков заякорено в мембране митохондрий, ядерной мембране и эндогишматическом ретикулуме за счет С-концевого трансмембранного участка (ТМ) [Adams and Cory, 1998; Capello and Gaidano, 2000; Chao and Korsmeyer, 1998; Hockenbery et al, 1993; Hsu et al, 1997; Krajevvski et al, 1993; Kroemer, 1997; Yang and Korsmeyer, 1996; Zamzami et al, 1998]. Для Bcl-2 показано, что удаление такой ТМ области или отменяет, или ослабляет анти-апоптотический эффект белка (Kroemer, 1997). В митохондриях Bcl-2 распределен неравномерно, главным образом в местах контакта внутренней и внешней митохондриальных мембран.
Независимо от сходства аминокислотной последовательности, структурные характеристики, позволяющие ингибиторам и индукторам апоптоза гомо- и гетеродимеризоваться, весьма различны. Гомодимеры Bcl-2 формируются антипараллельно, «голова-к-хвосту», и в этом процессе задействована область Bcl-2, в которой расположены домены ВН1 и ВН2 (Sato et al, 1994; Zha et al, 1996). Гомодимеры Вах, также как гетеродимеры Bcl-2/Вах, образуются взаимодействием «хвост-к-хвосту», в котором не задействованы домены на N-конце (Zha et al, 1996),. Экспрессия Bcl-2 в нормальных лимфоидных тканях существенно различается. Так, Вс1-2 практически полностью отсутствует в короткоживущих В-клетках зародышевых центров (ЗЦ) лимфоузлов, но широко представлен в долгоживущих клетках зоны мантии (Ohta et aL, 1995).
Вах - это активирующий апоптоз гомолог Вс1-2 размером 21 кДа. Точных данных относительно локализации Вах в клетке нет, но имеются указания о его расположении в тех же компартментах, что и Bcl-2 (Hsu et aL, 1997; Oltvai et aL, 1993). Существуют также данные, что в покоящемся состоянии Вах находится в цитозоле в растворимой форме, но после индукции апоптоза быстро перемещается в митохондрии и, возможно, другие органеллы (Hsu et aL, 1997; Jia et aL, 1999; Wolter et aL, 1997). Предполагается, что в покоящемся состоянии ТМ область Вах спрятана внутри белка или задействована в связывании Вах с другими цитозольными факторами.
Вах экспрессирован во многих тканях, особенно в тех, где при нормальном созревании наблюдается гибель клеток. Его высокая экспрессия наблюдается при раке желудка и остром лимфобластном лейкозе, а его мутации выявлены во множестве человеческих гематопоэтических клеточных линий (Knudson et at, 2001). Сама по себе высокая экспрессия Вах не легальна: стабильно экспрессирующие его клетки успешно пролиферируют. Вах усиливает гибель клеток после получения внешнего сигнала, хотя концентрация самого белка в процессе апоптоза не изменяется (Chao and Korsmeyer, 1998; Hsu et aL, 1997; Wolter et aL, 1997; Oltvai etaL, 1993).
Чувствительность клеток к апоптозу частично определяется соотношением про- и антиапоптотических белков (Bairey et aL, 1999; Capello and Gaidano, 2000; Hsu et aL, 1997; Kroemer, 1997; Reed (2), 1997; Sedlak et aL, 1995; Simonian et aL, 1996; Yang et aL, 1995). В том числе это показано для гибели лейкозных клеток, вызванной действием химио- и иммунотерапевтических агентов (Decaudin et aL, 1997; Jia et aL, 1999; Meijerink et aL, 1998).
Возможно также, что при регуляции апоптоза Вс1-2 и Вах действуют независимо друг от друга, поскольку удаление ВН4 у Вс1-2 ослабляет его функции, не влияя на способность образовывать димеры, а удаление ВНЗ у Вах не ослабляет его способности усиливать гибель. Таким образом, влияние на апоптоз про- и антиапоптотических представителей Bcl-2-семейства может быть связано с взаимодействием с общей мишенью, а не с образованием димеров (Knudson and Korsmeyer, 1997; Simonian et al, 1996; Wickremasinghe and Hofibrand, 1999).
Регуляция апоптоза представителями семейства Bcl-2 осуществляется с помощью механизма, в котором задействован выход Cyt с из межмембранного пространства митохондрий (Green and Reed, 1998). Так, Bcl-2 и Bcl-xL могут предотвращать апоптоз, ингибируя выход Cyt с из митохондрий, тогда как Вах содействует перемещению Cyt с в цитозоль (Jurgensmeier et al, 1998; Kluck et al, 1997; Vander Heiden et al, 1997; Wickremasinghe and Hoffbrand, 1999; Yang etat., 1997).
Существует две модели функционирования Bcl-2 и участия в этом процессе Cyt с. Первая модель была названа моделью "швейцарского армейского ножа" и предполагает непосредственное участие антиапоптотических представителей Bcl-2 семейства в активации каспаз (Ни et al, 1998; Reed (2), 1997 Rosse et al., 1998; Zhivotovsky et at., 1998). Другая модель предполагает, что Bcl-2 может действовать как до, так и после выхода Cyt с благодаря круговому пути. Cyt с стимулирует активацию каспаз, но активные каспазы, в свою очередь, способствуют выходу Cyt с из митохондрий (Hengartner, 1998).
Экспрессия апоптотическах биомаркеров на ранних стадиях дифферепцировки В-клеток
Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ) составляют 80-85% всех острых лейкозов у детей. У взрослых это соотношение радикально меняется, и на долю ОЛЛ у них приходится всего 15-20% от всех лейкозов. Различаются В- и Т-линейные лейкозы, и приблизительно в 75% случаев первичных детских острых лимфобластных лейкозов заболевание классифицируется как В-клеточное. Несмотря на различные иммунологические подварианты, все детские ОЛЛ имеют костномозговое происхождение (Jennings and Foon, 1997; LeBien, 2000).
При ОЛЛ наблюдается множество генных изменений. Тем не менее, до сих пор не выяснено, каким образом это приводит к нарушению нормальной программы развития предшественников В-клеток. (LeBien, 2000).
In vitro установлена корреляция между устойчивостью лейкозных клеточных линий к химиопрепаратам и гиперэкспрессией анти-апоптотических представителей семейства Вс1-2, однако данные о корреляции экспрессии этих белков с клиническим прогнозом in vivo весьма противоречивы (Chauncey, 2001).
По одним данным, процент BcI-2-положительных клеток и интенсивность экспрессии белка выше при рецидиве острого лейкоза по сравнению с первичным заболеванием, а также в устойчивых к химиотерапии случаях (Karawajew et al, 1997; Maung et al, 1994; Yang and Korsmeyer, 1996). По другим сведениям, корреляций между уровнем экспрессии Вс1-2 и чувствительностью лейкозных клеток к химиопрепаратам in vitro или исходом лечения больных нет (Coustan-Smith et al, 1996; Wuchter et al, 2000). В то же время клетки больных, хорошо отвечающих на первичную терапию преднизолоном, экспрессируют большее количество Вс1-2 по сравнению с клетками детей, плохо отвечающих на эту терапию (Wuchter et al, 2000). Существуют также данные, что клинические и лабораторные показатели, обычно ассоциирующиеся с плохим прогнозом заболевания, коррелируют с низким уровнем экспрессии Bcl-2 (Uckun et al., 1997). Вместе взятое, все это говорит о том, что уровень экспрессии Вс1-2 при детских ОЛЛ имеет малое прогностическое значение (Wuchter et al, 2000).
По литературным данным корреляций между соотношением Bcl-2/Bax при детских ОЛЛ и прогностическими характеристиками (возраст установления диагноза, пол, кариотип, лейкоцитоз), нет. Тем не менее, по некоторым данным высокая экспрессия Вах коррелирует с повышенной вероятностью рецидивирования (Hogarth and Hall, 1999).
Мутации р53 при ОЛЛ у детей не являются типичными для этого заболевания. В одном из ретроспективных исследований, в котором участвовало 330 детей, мутации р53 выявились менее чем в 3% случаев (Wada et al, 1993). Однако выявление ряда мутаций этого гена на ранней стадии заболевания может служить благоприятным прогностическим признаком (Nomdedeu et al, 1997). Возможно, это связано с тем, что р53 обладает способностью нейтрализовать все характерные для острых лейкозов признаки: блок дифференцировки, преимущественный рост опухолевых клеток и ингибирование апоптоза (Chylicki et al, 2000). В то же время, мутации этого гена, наряду с мутациями еще одного онкогена mdm-l, наблюдаются у большинства детей, у которых трудно получить полную ремиссию, или у которых наступает рецидив вскоре после ее достижения (Marks et al, 1996).
Отмечено, что клетки большинства детей с В-клеточным ОЛЛ экспрессируют CD95 на уровне 30-40%, при этом одни авторы указывают на отсутствие различий между про-В, пре-В и пре-npe-B формами (Karawajew et al, 1997; Wuchter et al, 2000), тогда как другие исследователи наблюдали повышение экспрессии Fas-антигена при клинически более благоприятном пре-пре-В-клеточном варианте ОЛЛ (Барышников и др., 1998). Необходимо отметать, что низкая экспрессия CD95 при детских ОЛЛ не означает функциональную неактивность рецептора. На клеточных линиях ОЛЛ показано, что высокая чувствительность к С095-опосредованному апоптозу зависит от мутаций р53 и низкой экспрессии Вс1-2 на лейкозных клетках (Wuchter et al, 2000).
Клиническое течение заболевания у взрослых и детей весьма различно. Тогда как 70-75% детей с ОЛЛ поддаются излечению, у взрослых больных подобный эффект достигается только у 30-35%. По сравнению с детскими, взрослые ОЛЛ более рефрактерны к первичной химиотерапии и у них больше вероятность развития резистентности к последующему лечению. Это означает, что патогенез ОЛЛ у детей и взрослых регулируется различными событиями (Stock et ai, 2000).
У взрослых при ОЛЛ чаще всего наблюдаются изменения генов ріб1 4 4, р15 4 , гена репшобластомы Rb и р53. Изменения этих генов универсальны, и у взрослых больных ОЛЛ наблюдаются изменения одного и более таких генов. У больных с de novo установленным диагнозом нарушения р53 встречаются редко, но у больных с рецидивом частота мутаций р53 возрастает в два раза (Stock et alt 2000).
Таким образом, данные об экспрессии Вс1-2 и Вах при ОЛЛ у детей весьма неоднозначны, а сведений об их участии в развитии ОЛЛ у взрослых крайне мало. Мутации р53 при ОЛЛ у детей не являются характерным для этого заболевания генетическим изменением, и могут встречаться у больных с повышенным риском рецидивирования. У взрослых мутации р53 также чаще встречаются при рецидиве болезни.
Общая характеристика использованного в работе материала
Прячет реакция. Для выявления экспрессии внутриклеточных маркеров Вс1-2, Вах и мутантной формы р53 1х106 в50 мкл клеток фиксировали в 0,25% растворе формалина в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, после чего клетки осаждали в течение 5 мин при 200g. К клеткам добавляли 1 мл 70% раствора этилового спирта (4С) и инкубировали не менее 1 часа при 4С. Клетки осаждали, добавляли 1мл 0,1% раствора Тритона-ХЮО и инкубировали 5 мин при 4С. По окончании инкубации клетки осаждали и дважды отмывали PBS, к осадку добавляли необходимое количество прямо меченых антител и инкубировали в течение 30 мин при 4С. После этого дважды отмывали в PBS, содержащем 2% сыворотки крупного рогатого скота, ресуспендировати в 1% растворе формалина и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Непрямая реакция иммупофлуоресцепции. Подготовительные этапы проводили таким же образом, как и в случае прямой реакции иммунофлуоресценции. После добавлення МКЛ клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и отмывали 1 раз в 2 мл 2% раствора сыворотки крупного рогатого скота в PBS. После чего к осадку клеток добавляли 20 мкл вторичных антител, конъюгированных с FITC и инкубировали в течение 30 мин при 4С. Затем клетки дважды отмывали в 2% растворе сыворотки в PBS, ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора формалина и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Реакция двойного окрашивания для одновременного определения поверхностных и внутриклеточных маркеров.
Этот метод считается более щадящим для клеток и наиболее подходящим для постановки реакций двойного окрашивания для определения коэкспрессии внутриклеточных и поверхностных маркеров. К сожалению, этот метод был обнаружен в литературе уже после того, как была набрана большая часть материала, и был испробован только на заключительных этапах исследования (Eynon et а/., 1999; Kim et а!., 1998; Zheng et al, 2000). мкл клеток окрашивали конъюгированными с фикоэритрином (РЕ) антителами к поверхностным маркерам (МКА анти-CDI9), в течение 30 мин при 4С, после чего дважды отмывали в 1 мл PBS. К осадку клеток добавляли 500 мкл 0,1% раствора сапонина и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки осаждали 7 мин при 200g, к осадку клеток одновременно добавляли 70 мкл 0,1% раствора сапонина и необходимое количество требуемых антител к внутриклеточным маркерам, после чего инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. После окончания инкубации в каждую пробирку добавляли 2 мл 0,1% раствора сапонина, содержащего 2% сыворотки крупного рогатого скота и осаждали в течение 7 мин при 1000 об/мин. После этого к осадку клеток добавляли 70 мкл 0,1% раствора сапонина и вторичные антитела, конъюгированные с F1TC, и инкубировали в течение 30 мин при 4С. Затем клетки дважды отмывали в 1 мл 0,1% растворе сапонина, содержащего 2% сыворотки крупного рогатого скота, и один раз в 1 мл 0,1% раствора сапонина, ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора формалина и анализировали на проточном цитофлуориметре. остановка реакции иммунофлуоуесценшш для нмл і уноцитохими ческого метода.
Оценку экспрессии биомаркеров на отпечатках лимфатических узлов проводили методом непрямой реакции иммунофлуоресценции в модификации для определения поверхностных маркеров (CD95) и внутриклеточных белков (Вс1-2, р53пан, р53мут). В качестве негативного контроля использовали пробы, окрашенные вторичными антителами, меченными FITC, без добавления первичных антител. Все этапы работы проводили во влажной камере.
Фиксированные отпечатки лимфоузлов инкубировали с 1% раствором БСЛ в течение 20 мин при комнатной температуре для блокирования участков неспецифического связывания иммуноглобулинов. Затем удаляли избыток раствора, добавляли 20 мкл первичных анти-С095 МКА (при этом в лунку, соответствующую негативному контролю, добавляли соответствующее количество PBS) и инкубировали при комнатной температуре в течение I часа. По окончании инкубации препараты дважды промывали в течение 10 мин в PBS, наносили по 20мкл F(ab -фрагмента в поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с FITC, инкубировали в течение 30 минут при 4С. Затем образцы трижды промывали в PBS в течение 10 мин, заключали в раствор глицерина и накрывали покровным стеклом. Реакцию анализировали в течение 24 часов на флуоресцентном микроскопе "Opton" (Германия), при этом оценивали не менее 200 клеток в 5 полях зрения.
Реакция иммунофлуоресценцші для определения внутриклеточных маркеров иммуноцитохимическим методом.
Фиксированные отпечатки лимфоузлов обрабатывали охлажденным (4С) 1% раствором Тритона Х-100 в цитратном буфере в течение 1 мин, после чего препараты трижды промывали в PBS в течение 10 мин. Далее реакцию проводили аналогично методике постановки эксперимента по определению поверхностных маркеров.
Фиксированные отпечатки лимфоузлов обрабатывали охлажденным (4С) 1% раствором Тритона Х-100 в цитратном буфере в течение 1 мин. После этого препараты обрабатывали 3% раствором перекиси водорода в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте для блокирования активности эндогенной пероксидазы. Стекла с образцами промывали 2 раза в PBS в течение 10 мин и инкубировали с 1% раствором БСА в течение 20 мин при комнатной температуре для блокирования участков неспецифического связывания иммуноглобулинов. Удалив избыток раствора, но не промывая образцы, наносили первичные антитела и инкубировали в течение ночи на холоде (4С), после чего стекла промывали 3 раза в PBS. Для визуализации реакции применяли систему LSAB+Detection System согласно инструкции. Для выявления пероксидазной активности на образцы наносили 20 мкл свежеприготовленного раствора ДАБ и инкубировали в темноте в течение 5-7 мин, после чего образцы промывали 4 раза в дистиллированной воде. После этого образца докрашивали раствором гематоксилина, при этом на образцы наносили 20 мкл раствора, инкубировали в течение 1-2 мин. Образцы четырежды промывали в дистиллированной воде и заключали в канадский бальзам. Анализ проводили в областях максимального окрашивания на 200-300 опухолевых клеток, используя микроскоп "Axiolab" (ZEISS, Германия).
Изучение экспрессии белков группы Bcl-2
Литературные данные относительно экспрессии белков семейства Вс1-2 на лимфоцитах периферической крови здоровых доноров существенно различаются (Ghia et at., 1998; Yokoyama et aL„ 2002). По данным вестерн-блота с использованием поликлопальных анти-Вс1-2 и анти-Вах-сывороток, Вс1-2 и Вах в норме присутствуют в лимфоцитах периферической крови. При этом высокая экспрессия Вс1-2 наблюдается в В-, Т- и NK-клетках, а в моноцитах Вс1-2 практически не экспрессируется. Высокая экспрессия Вах отмечается в В-, NK-клетках и моноцитах, и практически полностью отсутствует в Т-клетках (Iwai et al., 1994; Molica et at., 1996; Ohta et a!., 1995). Та же группа ученых показала, что клетки зародышевых центров лимфоузлов экспрессируют высокий уровень Вах и низкий - Вс1-2. Методом иммунофлуоресценшш с использованием моноклональных антител к Вс1-2 и Вах были получены анаюгичные результаты (Yokoyama et al, 2002). При этом авторы вышеуказанных статей чаще всего оперируют понятиями «низкая» и «высокая» экспрессия, не давая точных указаний на то, какие именно значения экспрессии относить к тому или иному критерию.Именно с отсутствием численного выражения этих понятий были связаны сложности с интерпретацией полученных данных, так как использующееся повсеместно понятие «гиперэкспрессия» может быть интуитивно понятно для групп с экспрессией, предположим, 80% положительных клеток относительно 20%. Однако, сложным для понимания представляется понятие «гиперэкспрессия», характеризующее почти 90% положительных клеток при хроническом лимфолейкозе, если среди лимфоцитов здоровых доноров определяется около 85% положительных клеток.
С другой стороны, «гиперэкспрессия» может означать значительное увеличение количества антигена в клетке, что будет выражаться в увеличении интенсивности флуоресценции. Но и в этом случае исследователи редко используют численные характеристики, возможно потому, что здесь вдвойне актуальным становится вопрос адекватных контролен и используемых концентраций антител, поскольку все это будет отражаться на интенсивности свечения, особенно при использовании метода цитофлуоримертии.
В нашем исследовании показано, что, используя применявшуюся нами методику окрашивания клеток для выявления внутриклеточных маркеров, в норме около 85% лимфоцитов периферической крови экспрессируют Вс1-2. При этом, хотя доля В-клеток среди всей популяции лимфоцитов весьма невелика, более 90% В-лимфоцитов экспрессируют этот маркер. Достаточно удивительным для нас стало выявленное отсутствие экспрессии Вах в норме: всего 7% лимфоцитов, и только 6% В-клеток были положительны. Таким образом, по нашим данным, получается, что в нормальных зрелых В-клетках экспрессируется большое количество Вс1-2 и практически полностью отсутствует Вах. Преобладание экспрессии первого вполне логично, поскольку циркулирующая в крови зрелая В-клетка должна обеспечить распознавание чужеродного антигена, после чего она должна отправиться во вторичные лимфоидные органы, где пройдет негативную селекцию по аффинности. По одной из версий, выживание В-клеток с высокой аффинностью к антигену при прохождении селекции обеспечивает экспрессия белка Вс1-2 (Ройт, Бростофф и Мейл, 2000).
Обнаруженное нами отсутствие экспрессии Вс1-2 в нормальном костном мозге не согласуется с рядом литературных данных, согласно которым все популяции клеток костного мозга в норме экспрессируют этот маркер (Hsu et al.t 1994). В то же время, другие авторы упоминают, что высокая экспрессия Вс1-2 в костном мозге наблюдается лишь на стадии про-В-клеток, а в незрелых В-клетках и пре-В-клетках, подвергающихся перестройке генов иммуноглобулинов, экспрессия этого маркера практически отсутствует (Ото and Korsmeyer, 1998; Merino et a/., 1994). По одной из теорий, именно на стадии пре-В-клетки в костном мозге происходит гибель огромного количества бластов, то есть «положительная селекция» В-клеток, и здесь скорее должны экспрессироваться антигены, вызывающие гибель клетки (РоЙг, Бростофф и Мейл, 2000).
К сожалению, в силу малой доступности нормального костного мозга, экспрессию Вах мы исследовали всего в двух случаях и получили-положительную экспрессию маркера в одном из них, и отрицательную - в другом. Так что для проверки этого предположения необходимы дополнительные исследования.
Выявленное в ходе исследования отсутствие экспрессии Вс1-2 и Вах в мазках-отпечатках лимфатических узлов можно объяснить неоднородностью клеток, попавших в мазок. В нормальном лимфоузле присутствуют В-клетки нескольких этапов дифференцировки, которые имеют равные шансы попасть на стекло при выполнении мазка-отпечатка. Более достоверным будет считаться либо исследование клонлов В-клеток из различных зон лимфоузла, которые наблюдаются при ряде лимфопролиферативных заболеваний, либо гистологическое исследование интактного лимфоузла.
Мутации р53 мы обнаружили только в 21% исследованных отпечатков лимфоузлов, составлявших контрольную группу. При этом количество положительных по мутантному р53 клеток в реактивных лимфоузлах и в реактивной компоненте л/у при ЛГМ было практически одинаково, что подчеркивает адекватность выбранного нами контроля. Таким образом, в нормальных тканях наблюдаются следовые количества мутантного р53.
По литературным данным, при дифференцировке В-клеток CD95 экспрессируется, в основном, на стадии ЗЦ (Martinez-Valdez et ai, 1996; Muschen et at., 2000). В ПК здоровых доноров CD95 выявляется в основном на Т-клетках, на В-клетках этот маркер экспрессирован слабо (Molica et а/., 1996). Редкая встречаемость CD95 на отпечатках лимфоузлов, также как и в случае Вс1-2, можно объяснить неоднородностью клеточного состава на мазках-отпечатках лимфоузлов. И, как и в предыдущем случае, для получения достоверных сведений требуется исследование клеток из отдельных зон лимфоузлов.
