Введение к работе
Актуальность темы
В последние годы в молекулярной биологии все больший интерес исследователей вызывает изучение липидных рафтов - микродоменов клеточных мембран, богатых холестеролом, сфинголипидами и различными сигнальными белковыми молекулами. Липидные рафты могут представлять собой чрезвычайно маленькие, лабильные и короткоживущие структуры, но наряду с такими существуют также и более крупные и стабильные микродомены, которые поддерживаются особыми рафт-образующими белками. Наиболее значимой функцией рафт-образующих белков является их способность формировать «сигнальные платформы», и тем самым регулировать передачу клеточных сигналов. В настоящее время известно большое количество рафт-образующих белков, но наиболее изученными среди них являются белки семейства кавеолинов, основным представителем которых является кавеолин-1. Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью влиять на пролиферацию, клеточную миграцию, программируемую гибель клеток, ангиогенез и другие процессы, которые важны при опухолевой трансформации и профессии, а изменения его экспрессии фиксируются во многих типах опухолей человека. Исследования показали, что экспрессия кавеолина-1 имеет характер двухфазной кривой и, в зависимости от гистогенеза опухоли, может как стимулировать опухолевую прогрессию, так и подавлять ее.
До настоящего времени изучению других семейств рафт-образующих белков, среди которых наибольший интерес представляет группа SPFH (Stomatitis, Prohibitins, Flotillins, НПКУС), уделялось значительно меньше внимания. Одними из представителей этой группы являются белки семейства флотиллинов, широко экспрессирующиеся в тканях человека. Данные белки локализуются в клетках преимущественно на плазматической мембране, способны к олигомеризации и принимают участие в регуляции многих сигнальных путей, часто пересекаясь в своих функциях с кавеолинами. Существуют лишь скудные и разрозненные данные об участии флотиллинов в процессах канцерогенеза, и их роль при развитии злокачественных новообразований различного происхождения на сегодняшний день остается неизученной. Следует отметить, что исследований об изменении экспрессии стоматина в аспекте канцерогенеза ранее вовсе не проводилось. Кроме
того, различные рафт-образующие белки могут являться функциональными аналогами друг друга, что наводит на мысль об их возможном взаимодействии или взаимозаменяемости. Однако до сих пор совместных скрининговых исследований экспрессии различных рафт-образующих белков как в опухолях человека, так и на модельных системах клеточных линий не существует.
В качестве объекта исследования экспрессии некоторых представителей группы SPFH белков нами был выбран немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Исследование молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолевого роста на модели рака легкого, как одного из самых распространенных, неблагоприятно текущих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний, предоставляет возможность в полной мере оценить значимость изменения тех или иных факторов, ассоциированных с канцерогенезом. На сегодняшний день важнейшими факторами прогноза для больных НМРЛ остаются клинические параметры, и в первую очередь, степень дифференцировки опухолевых клеток и статус метастазирования. Некоторые успехи достигнуты и в изучении молекулярных маркеров, однако поиск дополнительных факторов опухолевой прогрессии представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы явилось изучение экспрессии флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и исследование возможных механизмов влияния данных рафт-образующих белков на свойства опухолевых клеток.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Оценить продукцию флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в образцах первичных опухолей НМРЛ.
-
Сопоставить изменения продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина с клинико-морфологическими показателями, такими как гистологический тип опухолей, степень дифференцировки опухолевых клеток, статус метастазирования.
-
Исследовать влияние гиперэкспрессии генов FLOT-1, FLOT-2 и STOM, а также подавления экспрессии генов FLOT-I и FLOT-2 на характеристики клеточных линий А549 (АК легкого) и Н460 (крупноклеточная карцинома легкого) человека.
-
Изучить влияние изменения экспрессии генов FLOT-I, FLOT-2 и STOM на уровень продукции и статус фосфорилирования некоторых белков, участвующих в передаче клеточных сигналов.
-
Оценить взаимное влияние изменения экспрессии различных рафт-образующих белков в клеточных линиях А549 и Н460.
Научная новизна и практическая значимость исследования В данной работе проведено скрининговое исследование продукции флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина при НМРЛ, которое впервые показало, что содержание стоматина снижается в большинстве исследованных случаев НМРЛ человека.
Анализ полученных результатов позволил выявить корреляционные связи между уровнем продукции рафт-образующих белков и клинико-морфологическими показателями опухолевого роста при НМРЛ человека. Так, обнаруженная в исследуемой выборке НМРЛ корреляционная связь между уровнем продукции флотиллина-2 и степенью дифференцировки опухолевых клеток позволяет использовать этот белок в качестве маркера дифференцировки при данном онкологическом заболевании.
На модельных системах клеточных линий РЛ обнаружено влияние флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина на такие важнейшие свойства клеток, как пролиферация, миграция, способность к деградации внеклеточного матрикса. При совместном исследовании экспрессии рафт-образующих белков получены приоритетные данные об их взаимовлиянии, т.е. изменение экспрессии одного из рафт-образующих белков может сопровождаться изменением эндогенного уровня других представителей этой группы белков, что, очевидно, изменяет структуру и функционирование мембранных рафтов. Данная работа расширяет фундаментальные представления о функционировании различных мембранных микродоменов и взаимодействии белков, регулирующих важнейшие пути передачи сигналов, ассоциированных с опухолевой трансформацией и прогрессией.
Исследование экспрессии рафт-образующих белков флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина, а также выяснение молекулярных механизмов их участия в
процессах, определяющих опухолевую трансформацию и прогрессию, на модельных системах клеточных линий открывает новые перспективы для поиска дополнительных маркеров одного из самых прогностически неблагоприятных онкологических заболеваний - рака легкого.
Публикации и апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 20 июня 2012 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, онкогеномики, механизмов канцерогенеза и генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Материалы работы неоднократно докладывались на конференциях, в том числе автором лично на International Life Sciences Students Conference (2010, Nijmegen, The Netherlands) и Евразийском форуме по диагностике злокачественных новообразований (2011, Киев, Украина). По результатам диссертационной работы опубликованы 4 научные статьи и 7 тезисов докладов. Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 29
рисунков, 12 таблиц. Состоит из глав: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы
и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список
литературы», «Приложение». Список литературы содержит 163 источника.
