Введение к работе
Актуальность темы.
Известно, что прогрессирующий характер роста большинства опухолей тесно связан с наличием первичных и приобретенных иммунодефицитов, которые проявляются в относительной неэффективности механизмов противоопухолевой защиты и в избыточной активации механизмов иммуносупрессии [Кароог Q.S., 1982; North R.J. et al., 1984]. При росте химически индуцированной, спонтанной и перевивной опухоли показана активация иммуносупрессоров костного мозга и их экспансия в селезенку [Subiza J.L. et al., 1989; Кусмарцев C.A., 1990; Young.M.R.I. et al., 1992; Young M.R.I. et al., 1994]. Эти иммуносупрессоры (так называемые естественные супрессорные клетки, ЕСК) имеют нулевой фенотип, способны действовать дистантно через растворимые факторы, неспецифически, без предварительного контакта, не рестриктированно по антигенам гистосовместимости. Кроме ингибиции ответа Т-, В-клеток [Maes L.Y. et al., 1988; Subiza J.L. et. al., 1989], натуральных киллеров [Fu Y.X., 1991; Young M.R., 1992], ЕСК участвуют в регуляции гемопоэза, подавляя колониеобразование стволовых кроветворных клеток (СКК) и выработку стромальными элементами ростовых факторов [Young M.R., 1988; Moore S.C., 1992]. В ряде работ показано наличие цитостатического действия ЕСК на опухолевые клетки in vitro [Sugiura К. et al., 1990; Seledtsov V.I. et al., 1995].
С другой стороны, опухолевые клетки обладают независимостью от контролирующих пролиферацию сигналов и способностью к постоянному автономному росту, в частности, за счет способности продуцировать факторы роста [Блинов М.Н., 1990]. Одной из возможных причин иммунодефицита является активация ростовыми факторами ЕСК костного мозга. Показано, что продуцируемые опухолевой тканью ростовые факторы, такие как, интерлейкин-3 (ИЛ-3), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, активируют ЕСК [Sotomayor Е.М. et al., 1991, Young M.R. et al., 1992, Young M.R. et al., 1994].
Еще одно обстоятельство привлекает внимание к ЕСК: применение химиопрепаратов и гемопоэтических ростовых факторов для лечения больных со злокачественными новообразованиями приводит к глубокому вмешательству в гемопоэз, а соответственно, и к вмешательству в систему, регулирующую пролиферацию кроветворных клеток. Данные о результатах
применения в клинике рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчТМ-КСФ) для устранения миелосупрессии, развившейся после лечения высокими дозами цитостатиков, неоднозначны: одни авторы показывают неэффективность и даже токсичность препарата [Hoekman К. et al., 1991; Bajorin D.F. et al., 1995], другие, напротив, рекомендуют его для ускорения восстановления количества нейтрофилов и снижения частоты связанных с нейтропенией инфекционных осложнений [Buchner Т. et al., 1991]. Использование ИЛ-3 и рчГМ-КСФ илирчГ-КСФ (гранулоцитарного) в качестве индуцирующих дифференцировку факторов при миелоидных лейкемиях до химиотерапии не было успешным IDexter М., 1992]. Показана эффективность применения рчГМ-КСФ при подготовке больных к аутологической трансплантации костного мозга, препарат значительно увеличивает количество СКК в периферической крови больных после высокодозовой химиотерапии [Но A.D. et al., 1991]. Описано успешное лечение анемии, развивающейся после аллогенной трансплантации костного мозга, а также у больных со злокачественными новообразованиями разной локализации при помощи эритропоэтина (ЭП) [Platanias L.C. et al., 1991, Symann M., 1992].
Таким образом, в ситуации экспериментального бласто-могенеза и в клинике показано, что сама опухоль индуцирует нарушения гомеостаза кроветворной ткани, ведущие к актива-ции естественных супрессоров, которые, в свою очередь, способны подавлять как противоопухолевый ответ, так и ингибировать гемопоэз. Применение цитостатических пре-паратов и ростовых факторов может также усиливать генерацию естественных супрессоров, приводя к снижению эффективности лечения. В связи с вышеизложенным приобретают актуальность вопросы, касающиеся механизмов регуляции активности ЕСК при использовании химиотерапевтнческих и гемопоэз-стимулирующих препаратов.
Цель и задачи исследования:
Целью данной работы является изучение регуляции активности естественных супрессорных клеток ростовыми факторами in vivo и in vitro, внутриклеточных механизмов их активации, а также влияния цитостатиков на костномозговую
популяцию супрессорных клеток. В рамках этой цели решались следующие задачи:
-
Изучить влияние на ЕСК колониестимулирующего фактора ГМ-КСФ и эритропоэтина in vivo и in vitro.
-
Исследовать взаимосвязь клеточного метаболизма, синтеза ДНК, РНК и активности ЕСК. Оценить роль ионов водорода в регуляции активности естественных супрессорных клеток in vitro.
-
Охарактеризовать влияние актиномицина Д на супрес-сорную активность костного мозга, её зависимость от дозы препарата и генотипа животных.
-
Изучить механизм действия индуцированных актиноми-циномД супрессоров на клетки-мишени, охарактеризовать растворимую супрессорную активность (зависимость от цикло-оксигеназы, видоспецифичность, чувствительность к нагреванию, кипячению, заморозке и оттаиванию).
-
Охарактеризовать клетки-продуценты растворимой су-прессорной активности, реагирующие на актиномицин Д.
-
Сравнить действие актиномицина Д оливомишша и вин-кристина на естественные супрессорные клетки костного мозга.
Положения, выносимые на защиту:
1. Стимуляция гемопоэза in vivo на уровне
гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных предшествен
ников ростовыми факторами (ГМ-КСФ и ЭП) сопровождается
усилением как иммуносупрессорной, так и противоопухолевой
активности естественных супрессорных клеток.
2. Противоопухолевые цитостатические препараты с раз
ным механизмом действия (актиномицин Д оливомицин и вин-
кристин) способны in vitro усиливать естественную супрес
сорную активность через усиление продукции супрессорного
фактора (ов), который имеет небелковую природу, не принад
лежит к простагландинам, не обладает видоспецифичностью.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований получены новые данные о влиянии ростовых факторов на активность ЕСК, определены некоторые аспекты внутриклеточного механизма активации ЕСК, а также показано действие противоопухолевых препаратов на естественносупрессорную активность (ЕСА).
Впервые показано, что ГМ-КСФ, вводимый in vivo, влияет не только на иммуносупрессорную, но и на противоопухолевую активность естественных супрессорных клеток костного мозга. Экзогенный эритропоэтин усиливает имиуносупрессорную и противоопухолевую активность костного мозга и индуцирует появление ЕСА в селезенке.
Установлено, что противоопухолевая и иммуносупрессорная активность ЕСК несколько снижалась при блокировании цитохромоксидазного комплекса азидом натркя, в то время как ингибирование синтеза ДНК митомицином С не влияло как на противоопухолевое, так и на иммуносупрессорное действие ЕСК.
Впервые показано, что актиномишш Д способен значительно усиливать ЕСА костного мозга. Эффект зависит от дозы препарата и не зависит от генотипа экспериментального животного. Подобное действие, хотя и в значительно меньшей степени, оказывают оливомицин и винкристин. Антипролифера-тивное действие активированных актиномицином Д супрессоров проявляется как при контакте с клетками-мишенями, так и дистантно через растворимый супрессорный фактор(ы). Охарактеризована природа растворимой супрессорной активности: фактор(ы) обладает видонеспецифичностью, не принадлежит к простагландинам и не является белком. Под влиянием актино-мицина Д появляется растворимая иммуносупрессорная активность у спленоцитов и в тимусе, хотя и не столь значительная, как в костном мозге. Индуцируемая актиномицином Д иммуносупрессорная активность частично связана со зрелыми Т-клетка-ми, поскольку удаление Тпу-1.2-позитивных клеток из костного мозга несколько понижало уровень супрессии.
Теоретическое и практическое значение работы.
Теоретическое значение полученных результатов состоит в расширении представлений о механизмах иммунодефицита и снижения противоопухолевой резистентности, что имеет место при опухолевом росте. Проведенные исследования позволяют глубже понять возможные пути развития устойчивости к противоопухолевым антибиотикам и причины неоднозначных результатов применения ростовых факторов в целях восстановления гемопоэза после химиотерапии. Изучение способов воздействия на активность естественных супрессорных клеток может служить основой для создания новых методов лечения
злокачественных заболеваний системы крови, для предупреждения РТПХ при аллогенной трансплантации костного мозга, а также для предотвращения контаминации опухолевыми клетками аутологического трансплантата костного мозга при его восстановлении после высокодозовой химиотерапии.
Апробация работы.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на расширенном заседании Томского общества иммунологов (Томск, 1993), 12 Европейской иммунологической конференции (Барселона, 1994), ежегодном Конгрессе иммунологов Великобритании (Брайтон, 1995).
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками, 15 таблицами и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы из 167 наименований.
