Введение к работе
Актуальность проблемы
Латентный мембранный белок 1 (LMP1), являясь онкогеном вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), представляет собой интегральный мембранный белок, кодируемый одноименным геном LMP1, экспрессия которого приводит к трансформации клеток крысиных фибробластов и В-лимофцитов in vitro [Кауе et ah, 1993]. LMP1 играет также ключевую роль в развитии лимфом у трансгенных мышей [Kulwichit et ah, 1998]. В состав белка входят два терминальных цитоплазматических и шесть трансмембранных доменов [Fennewald et ah, 1984]. Длинный С-терминальный цитоплазматический домен ответственен за индукцию множества клеточных сигнальных каскадов, приводящих к активации NF-kB, c-Jun N-терминальной киназы (JNK), STAT 1/3, р38 МАРК [Wu et ah, 2006, Eliopoulos et ah, 1998, 1999, Dawson et ah, 2003, Lam et ah, 2003]. Основной функцией короткого N-терминального, а также трансмембранных доменов, является интеграция молекул LMP1 в клеточную мембрану и их агрегация между собой [Coffin et ah, 2001].
Филогенетический анализ вариантов LMP1, выделенных из опухолевой ткани больных ВЭБ-ассоциированными патологиями в различных географических регионах, выявил аккумуляцию ряда мутаций в этом гене, что свидетельствует о высокой степени его полиморфизма. В настоящее время рассматривается три основных механизма изменчивости LMP1 - это возникновение точечных мутаций, ведущих к замене отдельных аминокислот; образование делеций и дупликаций; и гомологичная рекомбинация как следствие ко-инфекции лимфоидных или эпителиальных клеток двумя различными штаммами ВЭБ [Walling et ah, 1999]. Исследование отдельных мутаций этого гена выявило способность некоторых из них влиять на биологические свойства молекулы LMP1, что, вероятно, играет важную роль в этиопатогенезе заболеваний, вызываемых ВЭБ. Наибольший интерес представляют мутации С-терминального цитоплазматического домена, которые, как показано ранее, влияют на иммуногенность и время полужизни LMP1, что в конечном итоге способствует усилению его трансформирующего воздействия на клетку [Ни et ah, 1991, Edwards et ah, 1999, Павлиш и др., 2008]. Не менее
4 важную роль в изменениях свойств белка играют и точечные мутации, локализованные в трансмембранном домене LMP1, при этом показано, что некоторые из них приводят к значительному снижению цитотоксического действия вирусного белка на клетку, что, возможно, влияет на трансформирующий потенциал этого онкобелка [Nitta et al., 2004].
Генетические перестройки гена LMP1 характеризуют изоляты ВЭБ, полученные от больных различными лимфопролиферативными заболеваниями в различных странах мира. Поиск и молекулярно-генетический анализ таких изолятов в неэндемичной зоне, а именно на территории России, представляется а к туальной научной и практической задачей, которая позволит получить новые экспериментальные данные о трансформирующих свойствах гена LMP1 и выяснить роль новых изолятов ВЭБ в возникновении различных лимфопролиферативных заболеваний, как доброкачественных, так и злокачественных.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей диссертационной работы заключалась в изучении основных функциональных характеристик доминирующих вариантов LMP1 ВЭБ, персистирующих среди больных лимфопролиферативными заболеваниями в России.
Для решения поставленных целей определены следующие задачи:
1. Провести секвенирование и филогенетический анализ вариантов LMP1,
амплифицированных из клинических образцов, полученных от больных
различными лимфопролиферативными заболеваниями;
2. Клонировать наиболее распространенные среди населения России
минимально дивергентные варианты LMP1 в ретровирусный вектор;
3. Получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие варианты LMP1,
на основе клеточной линии Rat-І (крысиных фибробластов), трансфицированной
LMP1 -реторовирусными плазмидами;
4. Изучить морфологические изменения полученных клеточных линий,
экспрессирующих варианты LMP1 российского происхождения;
5 5. Оценить активацию/супрессию основных сигнальных путей (NF-kB и АР-1), а также выявить влияние на накопление активных форм азота, в клеточных линиях, экспрессирующих низкодивергентные варианты LMP1.
Научная новизна и практическая значимость исследования
В представленной работе с помощью секвенирования и филогенетического анализа вариантов LMP1, изолированных из тканей российских больных ВЭБ-ассоциированными лимфопролиферативными заболеваниями, в частности инфекционным мононуклеозом (ИМ), лимфомой Ходжкина (ЛХ) и неходжкинскими лимфомами (НХЛ), доказано преобладание монофилетической группы, относящейся к низкодивергентному штамму LMP1-B95.8b. Учитывая происхождение изучаемых вариантов LMP1 из тканей больных доброкачественными (ИМ) и злокачественными (ЛХ и НХЛ) заболеваниями, представляло интерес сравнить их функциональные свойства с таковыми для высокодивергентного варианта LMPl-Cao, обладающего выраженным трансформирующим потенциалом, а также прототипного варианта LMP1-B95.8 с невысокой трансформирующей активностью. С этой целью нами впервые проведен анализ активации ключевых транскрипционных факторов NF-kB и АР-1, а также индукции iNOS и уровня внутриклеточного накопления N0, вариантами LMP1 с, минимальным набором мутаций с одной стороны, и указанными контрольными вариантами белка с другой.
Практическое значение заключается в том, что проведенный анализ нуклеотидных последовательностей вариантов полноразмерного гена LMP1 ВЭБ выявил конкретные генетические отличия между изолятами LMP1, амплифицированными из тканей больных различными злокачественными и доброкачественными лимфопролиферативными заболеваниями. Обнаруженные функциональные отличия низкодивергентных вариантов LMP1 помогут расширить понимание сложного комплекса молекулярно-биологических, вирусологических и иммунологических закономерностей, которые лежат в основе патогенеза ВЭБ-ассоциированных заболеваний, а также в разработке новых подходов для ранней диагностики неоплазий человека.
Апробация работы
Диссертация апробирована 18 июня 2009 года на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, биохимии опухолей, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на 16-ой и 17-ой международных конференциях "AIDS, Cancer and Public Health" 2007, 2008 (Санкт-Петербург, Россия), Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" 2007, 2008, 2009 (Москва, Россия), 8-ой международной школе-конференции "Immunology and viral infection" 2007 (Москва, Россия), 5-ой Российско-немецкой конференции "Human herpesviras infections" 2008 (Москва, Россия), третьем европейском конгрессе по вирусологии 2007 (Нюрнберг, Германия), 20-ом симпозиуме Европейской ассоциации по изучению рака (EACR) 2008 (Лион, Франция), пятой конференции «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» 2009 (Санкт-Петербург, Россия).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи и 13 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 4 таблицы. Состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования, Обсуждение, Выводы, Список литературы. Список используемой литературы содержит 248 литературных источников, из них 7 отечественных и 241 зарубежных.
![Генетический полиморфизм тиопуринметилтрансферазы у детей с гемобластозами, хроническими заболеваниями, здоровых детей и взрослых, жителей России [Электронный ресурс]](/i/i/4601/208361.png "Генетический полиморфизм тиопуринметилтрансферазы у детей с гемобластозами, хроническими заболеваниями, здоровых детей и взрослых, жителей России [Электронный ресурс] Руднева Анастасия Евгеньевна")
