Роль опухолевого супрессора р53 в регуляции организации цитоскелета и формы нормальных и опухолевых клеток Рубцова Светлана Николаевна

Содержание к диссертации

Список сокращений, принятых в работе 6

Введение 7|

Актуальность проблемы 7

Цели и задачи работы 7

Научная новизна и практическая ценность работы 8

Обзор литературы 10

1. Форма и цитоскелет различных типов клеток 10

Мезенхимальные клетки (фибробласты) 10

Эпителиоциты 10

Трансформированные клетки 11

1.1 Цитоскелет и адгезионные структуры 11

1.1.1 Актиновые микрофиламенты 11

1.1.2. Микротрубочки 16

1. Промежуточные филаменты 19

2. Фокальные контакты 19

3. Межклеточные контакты 21 1.2. Влияние специфических агентов на организацию и

функционирование цитоскелетных структур 23

1. Воздействие цитохалазина на актиновый цитоскелет 23

2. Воздействие колцемида на систему микротрубочек 24

2. Переходы между эпителиоидным и фибробластоподобным
фенотипами 24

3. Эпителиально-мезенхимальная трансформация клеток 25

4. Мезенхимо-эпителиальная трансформация клеток 28

3. Антионкоген р53 и его влияние на морфологию клеток 30

5. Структура и функции р53 30

6. Активация р53 31

7. р53-зависимая остановка клеточного цикла 32

8. р53-зависимый апоптоз 32

9. Регуляция активности р53 33

10. Влияние р53 на морфологию клетки 34

Материалы и методы 38

1. Культуры клеток 38

2. Вестерн-блот анализ 39 * J 3. Определение трансактивационной способности р53 4ф

j 4. Анализ вхождения клеток в S-фазу цикла по включению 5-

бромдезоксиуридина (5-BrdU) в ДНК 40

5. Апоптотическое фрагментирование ДНК 41

6. Флуоресцентная окраска 41

7. Количественный анализ морфологии клеток 43

I Л

Результаты 44

Глава 1. Нарушения цитоскелета ведут к активации р53 44
Раздел 1. Активация р53 при разборке системы актиновых

микрофиламентов 44

1. Обработка цитохалазином ведет к изменениям формы и цитоскелета

клеток 44

2. Обработка цитохалазином приводит к накоплению р53 в клетках 44

1. Вестерн-блот анализ 44

2. Иммунофлуоресцентная окраска Мы

3. Обработка цитохалазином ведет к функциональной активации р53 Ht,

3. Активация репортера хлорамфеникол-ацетил-трансферазы Mi

4. Активация репортера В-галактозидазы 5Ъ

4. р53-зависимое торможение клеточного цикла в ответ на воздействие

цитохалазина 5о

5. р53-зависимое торможение клеточного цикла в | несинхронизированных культурах So

6. р53-зависимое торможение клеточного цикла в синхронизированных культурах 54

5. индукция р53-зависимого апоптоза при обработке цитохалазином 5С

7. Иммунофлуоресцентный анализ 5С

8. Изменение динамики роста клеток при воздействии цитохалазина 5Ь

9. Апоптотическое сегментирование ДНК 5

Раздел 2. Активация р53 при разборке системы микротрубочек (

1. Обработка колцемидом ведет к изменениям формы и цитоскелета

клеток Ц

2. Обработка колцемидом приводит к накоплению р53 в клетках м

3. Обработка колцемидом приводит к функциональной активации р53 Ц-

4. р53-зависимая остановка клеточного цикла в ответ на обработку

колцемидом 63

5. Микроядра, индуцируемые колцемидом, вызывают задержку р53-
зависимую остановку клеточного цикла 5

Глава 2. Влияние р53 на форму и цитоскелетную организацию

клеток («А

1. Форма клеток существенно зависит от статуса р53 (,%

2. Влияние р53 на цитоскелетные системы и адгезионные структуры 1о

2.1 Влияние р53 на актиновые микрофиламенты Зе>

2. Влияние р53 на микротрубочки ^Нэ

3. Влияние р53 на межклеточные адгезионные контакты яо

4. Влияние р53 на фокальные контакты 33

Глава 3. Фенотипическая трансформация клеток при инкубации с

хелатором железа дефероксамином (DFO), имитирующим гипоксию ^Н>

Раздел 1. Действие DFO на клетки карциномы линии НСТ116 %

1. Изменение морфологического фенотипа клеток после воздействия '

DFO Ы

2. Динамика изменений формы и цитоскелета клеток под воздействием

DFO &

1. Изменение морфологии клеток НСТ116 р53+/+ под действием DFO 39

2. Изменение морфологии клеток НСТ116 р53-/- под действием DFO ?о

3. Исследование псевдоподиальной активности клеток НСТ116 р53+/+ ы.

4. Обратимость изменений формы клеток, вызванных DFO SH

5. Изменения цитоскелета и адгезионных структур, вызванные

воздействием DFO at

1. Влияние DFO на актиновые микрофиламенты <3»

2. Влияние DFO на межклеточные адгезионные контакты -в^

3. Влияние DFO на фокальные контакты 30

4. Влияние DFO на микротрубочки 3Q 5.4.1 Влияние DFO на центры организации микротрубочек Q1

5. Обработка DFO не меняет структуру митохондрий 35

6. Обработка DFO не приводит к значительному увеличению плоидности I

КЛеТОК ^la

1. Изменения морфологии ядер под действием DFO д^

2. Изменения динамики синтеза ДНК под действием DFO 3%

Раздел 2. Действие DFO на фибробласты крысы линий REF52 и

REF52/GSE22 э*

1. Изменение морфологического фенотипа клеток после воздействия ,

DFO 3

2. Изменения цитоскелета и адгезионных структур клеток REF52 и

REF52/GSE22, вызванные DFO «3*

3. Влияние DFO на актиновые микрофиламенты *33

4. Влияние DFO на фокальные контакты і-оз

5. Влияние DFO на микротрубочки U>3

3. Обработка DFO не меняет структуру митохондрий loo

Обсуждение результатов (Од

1. Разрушение цитоскелетных систем с помощью специфических агентов

ведет к активации р53 \ок

2. Влияние р53 на морфологический фенотип клеток 1W.

3. р53-независимый механизм мезенхимо-эпителиальной трансформации \\Ъ

Заключение \\f

Выводы V\3

Список литературы И9

Список сокращений, принятых в работе

ЭМТ - эпителио- мезенхимальная трансформация

МЭТ - мезенхимо-эпителиальная трансформация

ROS - активные формы кислорода

GSE - генетический супрессорныи элемент

CAT - хлорамфеникол-ацетил-транфераза

DFO - дефероксамин

5-BrdU - 5-бром-дезоксиуридин

Введение к работе

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач клеточной биологии является изучение механизмов морфогенеза клеток, тканей и органов, а также патологических изменений морфогенеза, происходящих в процессе опухолевых превращений. В настоящее время выяснены многие черты клеточных механизмов морфогенеза и, в особенности, природа динамики цитоскелетных и адгезионных структур клетки, определяющих эти процессы. Вместе с тем, остается малоизученным вопрос контроля этих цитоскелетных изменений основными регуляторными системами клетки.

Особую роль среди таких регуляторных систем играет система гена и белка
р53 - важнейшего регулятора процессов клеточного цикла, апоптоза и
дифференцировки. Несмотря на огромное число исследований, посвященных
структуре и функции р53, вопрос о связи этой системы с функцией цитоскелета
остается неясным. Этот вопрос актуален не только для понимания нормальных
механизмов морфогенеза, но и для понимания основных механизмов і

канцерогенеза, поскольку в динамике канцерогенеза резко нарушаются как функция р53, так и функции цитоскелетных систем, в особенности акто-миозинового контрактильного аппарата. Одним из особых аспектов этой проблемы является изучение связи изменения активности р53 с так называемыми эпителио-мезенхимальными трансформациями, играющими важнейшую роль в морфогенезе многих тканей, а также при злокачественном превращении клеток.

Цели и задачи работы

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение взаимосвязей между изменением морфологического фенотипа клеток различного происхождения, их цитоскелетных систем, и активностью опухолевого супрессора р53.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить, является ли избирательное разрушение цитоскелетных систем -актиновых микрофиламентов или микротрубочек- фактором, достаточным для активации р53 в клетках.

4. Изучить изменения морфологического фенотипа клеток в зависимости от экспрессии р53.

5. Изучить феномен мезенхимо-эпителиальной трансформации при воздействии на клетки хелатора железа дефероксамина и выяснить, является ли этот

фенотипический переход р53-зависимым.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые показано, что нарушение целостности цитоскелетных систем клетки с помощью специфических химических агентов влечет за собой активацию онкосупрессора р53 и остановку клеточного цикла или апоптоз клеток с разрушенным цитоскелетом. Разборка пучков актиновых микрофиламентов с помощью цитохалазина D или микротрубочек с помощью колцемида вела к функциональной активации р53 и, как следствие, к остановке клеточного цикла или апоптозу клеток. В линиях клеток, не содержащих р53 или содержащих функционально неактивный р53, остановка цикла или апоптоз в ответ на разрушение цитоскелетных систем были не выражены. Таким образом, впервые было показано, что патологические изменения морфологии клеток и цитоскелетных систем может приводить к активации р53. Полученные нами данные существенно дополняют и расширяют представления о стрессорных воздействиях, приводящих к активации р53.

Показано, что экспрессия р53 меняет морфологический фенотип клеток. Клетки карциномы, лишенные р53, имели более дисковидную, эпителиоидную морфологию, сопровождающуюся образованием эпителиоидных островков, а также изменениями цитоскелетных систем. Так, в отличие от исходных, р53-содержащих клеток, в клетках с нокаутированным р53 частично восстанавливались краевые пучки актиновых микрофиламентов, отсутствующие у клеток, экспрессирующих р53. Контактные структуры клеток, лишенных р53, также были более ярко выражены. Так, эти клетки образовывали протяженные тангенциальные адгезионные контакты. Фокальные контакты р53-негативных клеток были более многочисленны, чем у р53-позитивных клеток, и располагались по всему периметру клетки. В целом, такая перестройка цитоскелета и изменение морфологического фенотипа клеток говорит о том, что р53 индуцирует переход клетки к более мезенхимальному фенотипу.

Показано также, что переход клеток от фибробластоподобного к і

эпителиоидному фенотипу, т.е. мезенхимо-эпителиальная трансформация, может

быть вызвана добавлением к культурам хелатора железа дефероксамина, и что эта морфологическая трансформация не зависит от экспрессии р53 в клетках. В сравнительных опытах с воздействием дефероксамина на клетки, экспрессирующие р53 дикого типа и клетки, где р53 был так или иначе инактивирован, мы показали, что индукция мезенхимо-эпителиальной трансформации не зависит от экспрессии р53.

Таким образом, установлены многообразные реципрокные связи между
экспрессией р53 и динамическими перестройками цитоскелета, в том числе,
участвующими в мезенхимо-эпителиальной трансформации. Исследование
участия р53 в контроле морфологического фенотипа и цитоскелетной организации
клеток приобретает все большее значение. Понимание роли р53 в этих процессах
может привести к более полному пониманию механизмов канцерогенеза. В »
частности, полученные нами данные о таких взаимодействиях могут оказаться
ценными для разработки новых методов нормализации морфологического
фенотипа и предотвращения процесса инвазии. і

Обзор литературы

В соответствии с задачами работы в обзоре литературы рассмотрены основные данные, касающиеся различной формы клеток и цитоскелетных структур, играющих главную роль в динамике этой морфологической организации. В первой части обзора мы разберем организацию двух типов клеток - эпителия и мезенхимальных клеток (фибробластов). Далее будут рассмотрены данные о механизме взаимных переходов между этими двумя типами организации, а также возможная роль р53 в этих переходах.

1. Форма и цитоскелет различных типов клеток

Мезенхимальные клетки (фибробласты)

Культивируемыми фибробластами называют определенный морфологический тип тканевых клеток, которые сходны по своим характеристикам с фибробластами соединительной ткани in vivo. Происхождение этих культуральных клеток из фибробластов в организме в ряде случаев остается неясным. Поэтому такие культивируемые клетки часто называют также фибробластоподобными или мезенхимальными. Отличительной чертой фибробластов является их поляризованная на плоскости форма и способность одиночных клеток к направленному движению. Форма фибробластов варьирует от полигональной до вытянутой. По направлению движения фибробласта ориентирован широкий и плоский ведущий край, на котором образуются псевдоподии. Прикрепление псевдоподий к субстрату и последующее сокращение тела клетки в направлении движения определяют миграцию фибробласта. На заднем конце клетки находится узкий "хвост", который подтягивается по мере продвижения клетки (Альберте и др., 1994, Bershadsky & Vasiliev, 1988).

Эпителиоциты

Эпителиоциты - клетки, выполняющие в организме барьерную функцию. Они располагаются в виде пластов, покрывающих различные поверхности, клетки в этих пластах располагаются на базальной мембране.

Одиночный эпителиоцит в культуре, в отличие от фибробласта, имеет

дисковидную или полигональную форму и не способен к направленному движению. Псевдоподиальная активность такой клетки не сосредоточена на одном крае, а наоборот, равномерно распределена по всему ее периметру. В|

культуре эпителиоциты образуют островки, постепенно сливающиеся друг с другом и превращающиеся в монослой; клетки в эпителиальном островке плотно соединены межклеточными контактами. При удалении части монослоя эпителиоциты продвигаются в "рану", однако целостность монослоя не нарушается. Следует отметить, что ведущие клетки, непосредственно продвигающиеся в рану, могут приобретать вытянутый фибробластоподобный фенотип (Альберте и др., 1994, Bershadsky & Vasiliev, 1988).

Трансформированные клетки

При неопластической трансформации происходят сложные регуляторные перестройки клетки, направленные на усиление ее автономности. Уменьшается зависимость от внеклеточных факторов таких процессов как пролиферация, дифференцировка и апоптоз. Трансформированные клетки в большинстве своем значительно более поджаты, чем их нормальные предшественники, имеют вытянутый фибробластоподобный фенотип и хуже прикреплены к субстрату, чем нормальные клетки. Такой морфологический фенотип могут приобретать трансформированные клетки и соединительнотканного, и эпителиального происхождения (Альберте и др., 1994, Bershadsky & Vasiliev, 1988, см. Vasiliev, 2004).

1.1 Цитоскелет и адгезионные структуры

Многообразие форм клеток и их способности к миграции обусловлено, главным образом, строением их цитоскелета - совокупности внутриклеточных фибриллярных образований и адгезионных структур. В настоящей главе мы кратко рассмотрим структурную и регуляторную роль различных цитоскелетных компонентов.

1.1.1 Актиновые микрофиламенты

Актиновый цитоскелет представлен в клетке микрофиламентами -нитевидными структурами, состоящими главным образом из белка актина. В них также присутствуют многочисленные актин-связывающие белки, регулирущие динамику филаментов.

Актин - белок с молекулярной массой 42kDa, очень консервативный, существует в клетке как в мономерной (глобулярной), так и в полимеризованной (фибриллярной) формах. Мономеры актина могут встраиваться в полимерную

нить только строго определенным образом. На одном конце микрофиламента скорость связывания мономеров актина выше, чем на другом - такой конец называется быстрым, или "оперенным", в отличие от медленного, или "заостренного" (Bershadsky & Vasiliev, 1988).

В ламелле актиновые микрофиламенты обращены оперенными концами наружу (Small et al, 1995), и продвижение ламеллы вперед обусловлено элонгацией этих микрофиламентов (Theriot & Mitchison 1991, 1992). Однако, полимеризация актиновых мономеров in vitro происходит намного медленнее, чем протрузия ламеллы in vivo, и, следовательно, нужен ряд дополнительных факторов, обеспечивающих необходимую скорость (см. Pollard & Borisy, 2003). В клетке присутствуют различные актин-связывающие белки; однако, in vitro было показано, что для успешной полимеризации актина абсолютно необходимы только некоторые из них: комплекс Агр2/3, ADF/кофилин, кэпирующий белок, активатор комплекса Агр2/3 и профилин (Loisel et al, 1999; см также Small et al, 2002, Pollard & Borisy, 2003).

Комплекс Arp2/3 состоит из двух субъединиц, родственных актину, а также пяти субъединиц с отличной от актина структурой (Welch et al, 1997). Он может вызывать нуклеацию новых актиновых филаментов и, как следствие, образование актинового "дерева" на ведущем крае. Очищенный Агр2/3, однако, неактивен. Требуется присутствие подмембранного белка семейства WASP, чтобы "запустить" полимеризацию актина, обусловленную Arp2/3 (Machesky et al, 1999; Mullins, 2000; о регуляции WASP см. ниже).

На основе этих данных Бориси и Свиткиной была предложена модель разветвленной полимеризации актиновых микрофиламентов, обуславливающей продвижение ламеллы (Borisy & Svitkina, 1999, 2000). Согласно этой модели, комплекс Агр2/3 связывается с боковыми сторонами существующих актиновых микрофиламентов и на них нуклеирует новые микрофиламенты, растущие под углом 70 (Mullins et al, 1998). И исходный, и заново образованный микрофиламенты обращены оперенными концами в сторону ламеллы. Эти оперенные концы через несколько секунд закрываются от дальнейшей полимеризации кэпирующими белками. Слишком длинные актиновые филаменты не будут иметь достаточной жесткости для того, чтобы продвигать плазматическую мембрану вперед. Таким образом, непосредственно под мембраной клетки образуется разветвленная сеть коротких актиновых микрофиламентов, построенная по принципу "хвост к боку".

По мере удаления от ведущего края повышается вероятность гидролиза АТФ, связанного с актиновыми мономерами в составе филамента, до АДФ и неорганического фосфата. Как только неорганический фосфат диссоциирует в цитоплазму, становится возможной посадка на микрофиламенты белка ADF/кофилина, который повышает вероятность диссоциации мономеров актина. Мономеры актина связываются с белком профилином, способствующим замене АДФ на АТФ, и таким образом, могут вновь участвовать в реакции полимеризации (Welch et al, 1997; Borisy and Svitkina, 2000). Длинные актиновые микрофиламенты объединяются в пучки с помощью актин-связывающих белков (а-актинин, тропомиозин, фасцин и другие), и вместо разветвленной сети микрофиламентнов, по мере удаления вглубь клетки, образуются параллельные пучки актиновых филаментов, зачастую длинные, проходящие через все тело клетки. Такие пучки обычно связаны с фокальными контактами - специфическими адгезионными структурами, обеспечивающими прикрепление клетки к субстрату.

Особое место среди актин-связывающих белков занимают миозины, отвечающие за подвижность и сократимость актиновых филаментов. Контрактильность актиновых микрофиламентов необходима для осуществления различных морфогенетических реакций, таких как распластывание, миграция, контактные взаимодействия (Jay etal, 1995). Миозиновое надсемейство включает в себя 13 классов белков, но важнейшее значение для сократимости немышечных клеток играют миозины класса II (Fath & Burgess, 1994). Миозин этого класса соединяется с актиновыми микрофиламентами и определяет их способность к сокращению. Молекула миозина II состоит из двух тяжелых и двух легких цепей; они образуют две "головки", и "хвост". Фосфорилирование легких цепей вызывает соединение молекул миозина в биполярные агрегаты, которые связываются "головками" с боковыми сторонами двух актиновых микрофиламентов противоположной полярности. Присоединившиеся к микрофиламентам "головки" миозина изменяют конформацию и вследствие этого оказывают тянущее воздействие на актиновые микрофиламенты, в результате чего два актиновых микрофиламента скользят в противоположных направлениях (Bershadsky & Vasiliev, 1988). Миозин обладает АТФ-азной активностью, и необходимая энергия освобождается в результате гидролиза АТФ. Миозиновые агрегаты возникают на ведущем краю клетки, и по мере продвижения вглубь тела клетки, сливаются и упорядочиваются, по-видимому, играя важную роль в превращении разветвленной сети актиновых филаментов на краю клетки в параллельные пучки,

видные в центральной части клетки (Verkhovsky et al, 1995,1997). Актин-миозиновое натяжение регулируется с помощью фосфорилирования/дефосфорилирования легкой цепи миозина. Фосфорилирование легкой цепи миозина обеспечивается киназой легкой цепи миозина (MLCK), а дефосфорилирование - соответствующей фосфатазой.

Регуляция динамики актиновых микрофиламентов осуществляется с
помощью белков группы Rho (Hall, 1998). Самыми хорошо известными ее членами
являются Rho, Rac и cdc42. Rac и cdc42 влияют непосредственно на
полимеризацию актина на активном крае клетки. Так, при гиперэкспрессии Rac в
клетках наблюдается повышенная активность образования ламеллоподий.
Неприкрепившиеся к субстрату ламеллоподий заворачиваются наверх клетки и
волнами уходят назад, образуя так называемые раффлы (Ridley et al., 1992). При
повышенной экспрессии cdc42 образуются псевдоподии другого типа, нитевидные
филоподии (Kozma et al., 1995). Rho воздействует на актиновые структуры,
находящиеся в глубине клетки. Под действием Rho происходит усиление
натяжения актиновых филаментов, в состав которых входит миозин. При усилении
г> натяжения, фокальные контакты, находящиеся на концах пучков актиновых

филаментов, удлиняются (Ridley & Hall, 1992). Одновременная инъекция
; * флуоресцентно меченного актина и одного из регуляторных белков показала, что

Rac и Cdc42 индуцируют полимеризацию актина, тогда как Rho вызывает реорганизацию предсуществующих филаментов (Machesky and Hall, 1997).

Rac, Rho и cdc42 относятся к группе малых ГТФ-аз. Это белки, чье взаимодействие с эффекторными белками всецело определяется природой связанного нуклеотида. Малые ГТФ-азы связывают ҐТФ (в этом состоянии они активны) и гидролизуют его до ГДФ. Белок, связанный с ГДФ, не может взаимодействовать с эффектором, пока не обменяет нуклеотид вновь на ГТФ (Mackay and Hall, 1998; Bishop and Hall, 2000).

Rac и cdc42 взаимодействуют с белками WASP и родственным им белком WAVE, которые непосредственно запускают полимеризацию актина на ведущем крае клетки (Mullins, 2000). WASP в клетке находится в неактивном состоянии, а WAVE связан с белками, ингибирующими его активность Связывание с cdc42 или Rac активирует эти белки, и таким образом, инициирует полимеризацию актина, приводящую к выбрасыванию псевдоподий (Higgs & Pollard, 2001; Smith & Li, 2004). Кроме этого, Rac и cdc42 активируют киназы семейства РАК, которые

4*

регулируют сократимость актиновых филаментов, обусловленную встроенными

молекулами миозина II. РАК-киназы фосфорилируют и таким образом ингибируют киназу легкой цепи миозина, что приводит к относительному расслаблению пучков (Bokoch, 2003; Bishop & Hall, 2004). Таким образом, активность Rac и cdc42 направлена в основном на то, чтобы поддерживать высокую скорость полимеризации актина и выбрасывание псевдоподий, подавляя в то же время сократимость клетки.

Rho также изменяет активность миозина, и, как следствие, натяжение актиновых пучков, в состав которых он входит. В числе эффекторов Rho присутствует фермент Rho-киназа (ROCK), фосфорилирующая фосфатазу легкой цепи миозина и инактивирующая ее (Matsui et al, 1996; Amano et al, 1996: Kimura et al, 1996). Уровень фосфорилирования легкой цепи миозина таким образом повышается, и повышается сократимость актиновых филаментов. Активация ROCK также приводит к фосфорилированию и ингибированию ADF/кофилина, что позволяет актиновым филаментам достигнуть большей длины (Maekawa et al, 1999; Bamburg etal, 1999).

Строение актинового цитоскелета определяет способность клетки к миграции. Так, например, различная скорость полимеризации актина в разных частях клетки делает возможной поляризованую морфологию фибробластоподобных клеток. В культуре такие клетки организованы асимметрично: по направлению движения ориентирована ламелла, обычно широкая и плоская. Она заканчивается ведущим краем, где непрерывно образуются псевдоподии. На заднем конце клетки находится узкий "хвост", который подтягивается по мере продвижения клетки. Основная полимеризация актина происходит на ведущем крае клетки, здесь непрерывно выбрасываются псевдоподии, плоские (ламеллоподии) или нитевидные (филоподии). Прикрепление псевдоподий к субстрату и последующее смещение тела клетки в направлении миграции и является основой движения фибробласта. В теле клетки расположены многочисленные пучки актиновых филаментов, ориентированные параллельно длинной оси клетки.

Актиновый цитоскелет неподвижных эпителиоцитов организован иначе. Основной актиновой структурой эпителиоцитов является кольцевой пучок, располагающийся по периметру клетки. За пределами кольцевого пучка происходит выбрасывание и втягивание псевдоподий. В центре клетки обычно находятся прямые актиновые пучки, не имеющие доминантного направления.

Таким образом, актиновые структуры эпителиоцита радиально симметричны, и клетка не имеет ярко выраженной поляризации.

При неопластической трансформации клеток происходит редукция актиновых структур. Частично сохраняются структуры, присущие родительским клеткам -более тонкие прямые актиновые пучки или фрагменты кольцевого пучка -краевые пучки. Также в трансформированных клетках актиновые структуры могут вовсе не выявляться. В таких клетках окрашивание на актин дает картину диффузного распределения.

1.1.2. Микротрубочки

Микротрубочки представляют собой полые цилиндры с диаметром 25 нм. Они состоят из глобулярного белка тубулина, молекулы которого способны к полимеризации и организации в цилиндрические структуры. Как и актиновые микрофиламенты, микротрубочки являются полярными структурами - скорость элонгации на противоположных концах микротрубочки различается. Быстро растущий конец называется плюс-концом, а медленно растущий - минус-концом.

В клетках система микротрубочек имеет радиальную структуру с наибольшей плотностью микротрубочек в околоядерной области. Система микротрубочек в клетке централизована - подавляющее большинство микротрубочек растет из определенного места, называемого центром организации микротрубочек. В интерфазной клетке он располагается в непосредственной близости от ядра и называется центросомой.

В состав центросомы входит пара центриолей (материнская и дочерняя). Центриоли представляют собой цилиндрические структуры, образованные девятью триплетами микротрубочек. Также в состав центросомы входит перицентриолярный матрикс, образованный многими белками, среди которых есть как структурные, так и регуляторные молекулы (Kramer et al, 2004).

Предполагается, что большинство микротрубочек начинает полимеризоваться на центросоме. Белок у-тубулин, входящий в состав перицентриолярного матрикса, играет ключевую роль в полимеризации микротрубочек на центросоме. Кольцевые полимеры у-тубулина служат "сборочной площадкой" для микротрубочки и также защищают ее минус-конец, обращенный к центросоме, от деполимеризации (см. Desai & Mitchison, 1997). Радиально расходящиеся от центросомы микротрубочки могут отделяться от у-тубулиновых затравок и уходить в цитоплазму; как правило, за этим следует

быстрая разборка микротрубочки с минус-конца. На освободившейся таким образом затравке может инициироваться сборка новой микротрубочки.

Помимо сборки на центросоме, во многих типах клеток (эпителиоциты, мышечные клетки), микротрубочки могут полимеризоваться в цитоплазме без участия центросомы. Предполагается, что и в этом случае полимеризация микротрубочек идет с участием у-тубулиновых кольцевых затравок (Keating & Borisy, 1999).

В клетке часть микротрубочек находится в состоянии динамической нестабильности - фаза полимеризации плюс-конца, обращенного в цитоплазму, чередуется с фазой деполимерзации. Часть микротрубочек остается относительно стабильными, т.е. их концы находятся в состоянии паузы. Стабильность микротрубочек различна у разных типов клеток. Так, например, в фибробластах большинство микротрубочек динамичны, со средним временем полураспада, составляющим несколько минут. Наоборот, в эпителиальных клетках большинство микротрубочек стабильны, и их время жизни исчисляется десятками минут (Wadsworth & McGrail, 1990, Shelden & Wadsworth, 1993).

Большинство микротрубочек ассоциироциировано со специфическими белками, регулирующими скорость их полимеризации. К белкам, стабилизирующим микротрубочки, относятся белки семейства MAP (белки, ассоциированные с микротрубочками) и белки тау. Белок Ор18/статмин индуцирует разборку микротрубочек. Кроме факторов, определяющих динамику, с микротрубочками также связаны многочисленные моторные белки семейства кинезинов и динеинов. Одним своим концом молекула моторного белка прикреплена к микротрубочке, а другим - к соседней микротрубочке или органелле. Направление движения определяется природой моторного белка: кинезины перемещают органеллу к плюс-концу, динеины - к минус-концу микротрубочки. Моторный белок, перемещаясь по микротрубочке, развивает тянущее воздействие, результатом которого является скольжение микротрубочек друг относительно друга (как, например, в жгутике) или перемещение органеллы (см. Burgess & Knight, 2004; Yildiz & Selvin, 2005).

Интактная система микротрубочек необходима для нормальной псевдоподиальной активности, а также поляризации и передвижения клетки по субстрату. Было показано, что при разрушении микротрубочек с помощью специфического агента - колцемида - приводит к угнетению псевдоподиальной активности и ингибированию направленного движения (Bershadsky et al, 1991).

Каким образом микротрубочки могут влиять на поляризацию клетки? Во-первых, сама организация микротрубочек является полярной, с одним центром организации. Готлиб и соавторы показали, что для направленно движущихся эндотелиальных клеток характерно расположение центросомы перед ядром, по направлению движения (Gotlieb et al, 1981). Как результат такого положения центросомы, микротрубочки в основном расположены вдоль оси миграции клетки; многие из них, преимущественно стабильные детирозинированные микротрубочки, ориентированы своими плюс-концами по направлению к лидирующему краю (Gundersen and Bulinski, 1988). Однако, в другой работе было показано, что ориентация центросомы при направленном движении различается в различных типах клеток и, таким образом, не является обязательным условием для поляризации и направленного движения (Yvon et al, 2002).

Помимо поляризованной организации системы микротрубочек, наблюдается поляризация динамики микротрубочек. Так, было показано, что рост микротрубочек происходит в основном в районе ведущего края (Wadsworth, 1999; Waterman-Storer et al, 2000; Wittman & Waterman-Storer, 2001), тогда как разборка микротрубочек происходит в основном в центре клетки (Waterman-Storer & Salmon, 1999). Возможно, растущие микротрубочки участвуют в локальной активации псевдоподиальной активности и образовании ведущего края клетки (Waterman-Storer & Salmon, 1997). В фибробластах микротрубочки врастают в псевдоподии на ведущем крае. Следует отметить, что в неполяризованных эпителиоцитах рост микротрубочек, как правило, ограничен кольцевым пучком актиновых филаментов, и проникновения микротрубочек в ламеллу не наблюдается.

Есть данные, свидетельствующие о способности микротрубочек регулировать активность белков семейства Rho, ответственных за сборку и натяжение пучков актиновых филаментов. Так, была показана локализация на микротрубочках белка GEF-H1 - фактора обмена нуклеотида, специфичного для RhoA (Krendel et al, 2002). При разборке микротрубочек этот белок высвобождается в цитоплазму и активирует RhoA. Кроме этого, было показано, что рост микротрубочек после отмывки от деполимеризующего агента ведет к активации белка Rac1, что приводит к усиленной полимеризации актина по периметру клетки (Waterman-Storer et al, 1999).

В других работах было показано, чточто микротрубочки напрямую задействованы в регулировании адгезии клетки. Так, было показано, что

микротрубочки в живых клетках направленно "атакуют" фокальные контакты своими плюс-концами. Повторяющиеся касания микротрубочками фокальных контактов приводит к локальной разборке последних (Kaverina et al, 1998, Kaverina etal.1999).

Система микротрубочек не различается значительно у трех типов клеток, обозначенных нами ранее. У фибробластов, эпителиоцитов и трансформированных клеток микротрубочки образовывают радиальную структуру с одним центром организации, расположенным в непосредственной близости от ядра. Однако в динамике микротрубочек имеются различия между этими типами клеток. В отличие от фибробласта, где большинство микротрубочек динамичны, в эпителиоците большинство микротрубочек стабильны, и время их полуобновления исчисляется десятками минут (Wadsworth and McGrail, 1990).

1.1.3 Промежуточные филаменты

Третью цитоскелетную систему образуют промежуточные филаменты. Промежуточные филаменты - это фибриллярные структуры, состоящие из белков виментина, кератина или десмина в зависимости от типа клеток. Эти структуры в клетке располагаются в виде рыхлой сети в околоядерной области (см. Herrmann & Aebi, 2004). В нашей работе, однако, мы не рассматриваем изменения этого компонента цитоскелета в ходе наших экспериментов.

1.1.4 Фокальные контакты

Для того, чтобы успешно распластываться и передвигаться, клетке необходимы структуры, обеспечивающие прикрепление к субстрату -внеклеточному матриксу. Такие структуры называются фокальными контактами.

Взаимодействие с матриксом за пределами клетки осуществляется с помощью трансмембранных белков - интегринов. Молекула интегрина состоит из двух субъединиц - а и р. Одновременно в клетке экспрессируется по нескольку изоформ каждой субъединицы. Различные комбинации а- и (3- субъединиц определяют специфичность интегриновых молекул по отношению к отдельным белковым компонентам внеклеточного матрикса. Изнутри клетки с цитоплазматическим доменом интегрина взаимодействует целый ряд структурных и регуляторных белков (талин, винкулин, паксиллин, а-актинин, FAK, Src и другие - см. Bershadsky 1996; Burridge & Chrzanowska-Wodnicka, 1996; Sastry & Burridge,

2000). Со стороны центра клетки к фокальному контакту присоединяется пучок актиновых филаментов.

Формирование адгезивных структур начинается на ведущем крае клетки, где происходит интенсивная полимеризация актина. Однако, для продвижения ламеллы вперед необходимо ее прикрепление к субстрату. Это прикрепление обеспечивают фокальные комплексы -точечные структуры 1-2 мкм в диаметре. По мере продвижения фокальных комплексов к центру клетки происходит их созревание - изменение формы (удлинение) и последовательное обогащение их белкового состава. Кластеризация интегринов вызывает присоединение к их цитоплазматической части целого ряда структурных и регуляторных молекул (Miyamoto et al, 1995; Laukaitis et al, 2001). В пучок актиновых филаментов, присоединенный к контакту, встраивается миозин II, который необходим для развития тянущей силы, приложенной к фокальному контакту.

Фокальные контакты - динамические структуры. По мере продвижения клетки по субстрату непрерывно происходит формирование новых фокальных контактов на ведущем крае клетки и разборка предсуществующих фокальных контактов в теле клетки и в хвосте (Wehrle-Haller & Imhof, 2002). В активно движущихся клетках фокальные контакты на переднем крае и в теле клетки остаются неподвижными по отношению к субстрату (Heath & Dunn 1978). В задней же части клетки происходит частичная разборка контактов (Smilenov et al, 1999), что необходимо для миграции клетки. Хвостовые контакты подвижны относительно субстрата, они скользят по направлению к центру клетки, затем происходит их разрежение и, наконец, исчезновение (Ballestrem et al, 2001).

Динамика фокального контакта зависит от величины тянущего воздействия, которое развивает актиновый пучок, присоединенный к контакту (Galbraith et al, 2002). Показано, что если нарушить актин-миозиновые взаимодействия с помощью химических ингибиторов, тянущее воздействие прекращается, и фокальный контакт разбирается (Zamir et al, 1999; Bershadsky et al, 2003). Наоборот, при повышении внутриклеточного натяжения (например, при разборке микротрубочек) происходит увеличение длины фокальных контактов (Pletjushkina et al, 1998). Необходимо отметить, что точечные фокальные комплексы на краю клетки не зависят от сократимости актиновых пучков и не разбираются при добавлении ингибиторов сократимости (см. Geiger & Bershadsky, 2001). Это может быть связано с их ассоциацией с кортикальным актином, а также с повышенной адгезивностью ламеллы на ведущем крае (Nishizaka et al, 2000).

В клетках различных типов фокальные контакты имеют сходную вытянутую форму, однако, их расположение различается. В поляризованных подвижных фибробластах видны многочисленные мелкие фокальные контакты на ведущем крае, длинные фокальные контакты, ассоциированные с пучками актиновых филаментов и расположенные параллельно длинной оси в теле клетки, и, наконец, длинные хвостовые фокальные контакты. В дисковидных эпителиальных клетках фокальные контакты на краю клетки расположены радиально по всему периметру; в теле клетки фокальные контакты расположены на концах центральных актиновых пучков. Трансформированные клетки, как правило, образуют меньше фокальных контактов, чем нормальные клетки; эти фокальные контакты короче и тоньше.

1.1.5 Межклеточные контакты

В зависимости от их функции различают три класса межклеточных контактов. Адгезионные контакты и десмосомы обеспечивают механическое скрепление клеток; плотные контакты выполняют барьерную функцию и, наконец, щелевые контакты обеспечивают метаболическое сопряжение клеток. В этом разделе мы кратко рассмотрим структуру и функцию адгезионных контактов. Адгезионные контакты (adherens junctions) образуются на ранних стадиях межклеточного взаимодействия и играют важнейшую роль при объединении клеток в тканевые структуры (Takeichi, 1995, Gumbiner, 1996). Основными компонентами межклеточных адгезионных контактов являются белки кадхерины, актиновые филаменты и адгезионная бляшка, связывающая кадхерины с актиновым цитоскелетом.

Кадхерины - это семейство трансмембранных белков, осуществляющих Са²⁺-зависимое связывание между двумя соседними клетками (см. Gooding et al, 2004). Несмотря на то, что само по себе взаимодействие внеклеточных доменов молекул кадхерина может обеспечить контакт соседних клеток, важная роль в установлении сильной межклеточной адгезии отводится их цитоплазматическим доменам. Примембранная область регулирует образование цис-димеров молекул кадхерина (Yap et al., 1998). С-концевая часть цитоплазматической области молекулы кадхерина через Р-катенин или плакоглобин взаимодействует с а-катенином, который, в свою очередь, непосредственно или через а-актинин, винкулин или ZO-1 связывает кадхерины с актиновым цитоскелетом; образуется адгезионная бляшка (Rimm et al., 1995; Knudsen et al., 1998). Динамические

изменения актиновых филаментов чрезвычайно важны в процессе образования и поддержания структуры межклеточных контактов (Gloushankova et al, 1997, Krendel et al, 1999).

Межклеточная адгезия является динамическим процессом. Фосфорилирование р-катенина или плакоглобина приводит к их диссоциации от адгезионной бляшки и разрушению межклеточного контакта. Такое фосфорилирование белков адгезионной бляшки наблюдалось при действии ростовых факторов, включая EGF, TGFp, PDGF, HGF/SF (см. Steinberg and McNutt, 1999). Кроме того, показано, что при трансформации клеток онкогенным Ras также наблюдается фосфорилирование Р-катенина и уменьшение количества комплексов Е-кадхерин-Р-катенин (Kinch et al., 1995).

Функции белков межклеточных контактов не ограничены их участием в физическом взаимодействии между клетками. Так, например, кадхерины также задействованы в сигнальных путях, определяющих дифференцировку клеток, их пролиферацию и миграцию (Knudsen et al., 1998). Также к настоящему времени появилось большое количество данных о существовании тесной взаимосвязи между межклеточной адгезией и сигнальными путями в клетке. Важнейшую роль в этой связи отводят р-катенину как регулятору межклеточной адгезии, а также ключевому медиатору сигнальных путей в клетке и, в частности, Wnt/Wg пути (см. Yamada and Geiger.1997, Barth et al., 1997). При активации сигнального каскада Wnt/Wg в конечном счете происходит перемещение Р-катенина в ядро, где он регулирует экспрессию многих генов, в том числе циклина D1 и туе, отвечающих за регуляцию клеточного цикла. (Tetsu and McCormick, 1999, Не at al., 1998).

В клетках эпителиального и мезенхимального происхождения расположение межклеточных контактов различается. Для эпителиоцитов характерны тангенциальные, т.е. параллельные краю клетки, межклеточные контакты, содержащие Е-кадхерин. В фибробластах же межклеточные контакты радиальные, т.е. перпендикулярные краю клетки. Такие контакты содержат N- или Р-кадхерин. В трансформированных клетках обычно сохраняется расположение межклеточных контактов, характерное для их нормальных предшественников.

1.2. Влияние специфических агентов на организацию и функционирование цитоскелетных структур

Существует целый ряд специфических агентов, изменяющих структуру цитоскелета в клетке. Эти агенты различаются в зависимости от того, на какие цитоскелетные системы они воздействуют. Мы рассмотрим действие агентов, изменяющих структуры системы актиновых филаментов и микротрубочек.

1.2.1 Воздействие цитохалазина на актиновый цитоскелет

Цитохалазины являются специфическими ингибиторами полимеризации актина. Известно девять близкородственных цитохалазинов природного происхождения, а также их синтетические аналоги. Наиболее широко используются цитохалазины В и D.

Показано, что цитохалазины специфически связываются с плюс-концом микрофиламента и таким образом блокируют присоединение новых мономеров актина (Cooper, 1987, Walling et al, 1988). Поскольку диссоциация актиновых мономеров на минус-конце продолжается, а полимеризация на плюс-конце оказывается заблокированной, суммарным действием цитохалазина является разрушение системы актиновых микрофиламентов.

Цитохалазин оказывает характерное воздействие на клеточную морфологию. Он подавляет миграцию и псевдоподиальную активность. При воздействии высоких доз цитохалазина ламеллярная цитоплазма разрушается, и клетка приобретает характерную арборизированную форму. При воздействии на клетки более низких доз цитохалазина арборизации не наблюдается - форма клетки становится дисковидной (Domnina et al 1982; Bliokh 1980).

Вместо обычных пучков актиновых филаментов у клеток, культивируемых в присутствии цитохалазина, в цитоплазме наблюдаются короткие игловидные актиновые микрофиламенты, хаотично расположенные и не связанные с фокальными контактами. Основными структурами, заполняющими цитоплазму клеток, являются микротрубочки и промежуточные филаменты.

В митозе цитохалазин препятствует образованию актинового сократительного кольца и разделению клетки на две дочерние, индуцируя таким образом появление многоядерных клеток в культуре. В то же время, показано, что даже низкие дозы цитохалазина оказывают угнетающее воздействие на пролиферацию мышиных эмбриональных фибробластов (Глушанкова, 1982).

1.2.2 Воздействие колцемида на систему микротрубочек

Одним из наиболее распространенных агентов, разрушающих систему микротрубочек, является колхицин. Колхицин, выделенный из растений Colchicum autumnale (Rosenbaum et al., 1969), и синтетический колцемид являются структурными и функциональными аналогами. Они препятствуют полимеризации тубулина in vitro и вызывают деполимеризацию микротрубочек in vivo, которая происходит вследствие блока полимеризации. В результате обработки колцемидом в клетке наблюдается диффузное распределение тубулина, не ассоциированное ни с какими структурами.

Результатом деполимеризации микротрубочек под действием колцемида является нарушение распределения органелл в клетке - стопки аппарата Гольджи, в норме сгруппированные рядом с центросомой, рассеиваются в цитоплазме. Митохондрии и лизосомы, обычно ассоциированные с микротрубочками, исчезают с периферии клетки и заполняют ее околоядерную область.

Воздействие колцемида на клетки приводит к значительным нарушениям формы и псевдоподиальной активности клеток. Клетки теряют поляризацию, и псевдоподиальная активность распределяется по всему периметру клетки (Vasiliev et al., 1970). Остальные цитоскелетные системы тоже претерпевают изменения. Так, актиновые филаменты становятся толще и короче, а ассоциированные с ними фокальные контакты длиннее (Pletjushkina et al, 1998). Система промежуточных филаментов при обработке клеток колцемидом претерпевает коллапс. Все промежуточные филаменты концентрируются в околоядерной области.

Функциональным аналогом колцемида является нокодазол (De Brabander et al, 1977), который подобно колцемиду вызывает деполимеризацию системы микротрубочек, а в меньших концентрациях ингибирует динамическую нестабильность микротрубочек.

2. Переходы между эпителиоидным и фибробластоподобным фенотипами

В главе 1 мы рассмотрели различную организацию и функционирование цитоскелетных систем в фибробластоподобных и эпителиоподобных клетках. Однако, под воздействием различных факторов клетки могут приобретать характерные черты другого морфологического типа. В этой главе мы рассмотрим два примера таких переходов.

2.1 Эпителио-мезенхимальная трансформация клеток

Под воздействием ряда факторов неподвижные эпителиоциты могут приобретать комплекс признаков, характерных для поляризованных и активно движущихся фибробластов. Это явление называется эпителио-мезенхимальной трансформацией (ЭМТ). В ходе ЭМТ происходит диссоциация межклеточных контактов, поддерживающих структуру эпителиального островка. Одновременно с этим дисковидные эпителиоциты приобретают вытянутый поляризованный фенотип с ведущей ламеллой на переднем конце клетки и вытянутым "хвостом", необходимый для направленного движения. Спаянный островок эпителиоцитов превращается в колонию клеток, обладающих фибробластоподобным фенотипом, и эта колония постепенно диссоциирует на отдельные клетки (Stoker, 1989). В ряде клеточных систем ЭМТ приводит к активации мезенхимальных маркеров -виментина (белка промежуточных филаментов клеток мезенхимального происхождения; Gilles et al, 2003), гладкомышечного актина (Masszi et al, 2004), a также компонента фокальных контактов интегрина а5(31, характерного для фибробластов (Maschler et al, 2005).

Для изучения ЭМТ также используются системы культивирования клеток в трехмерном коллагеновом геле. Колонии нормальных эпителиоцитов, посаженных в коллагеновый гель, разрастаются в шарообразные кисты. ЭМТ, индуцированная в такой системе, приводит к образованию системы полых ветвящихся трубок, стенки которых представляют собой слой эпителиальных клеток. На концах трубок располагаются клетки-лидеры, имеющие ярко выраженный поляризованный фенотип (Montesano et al, 1991). ЭМТ может быть индуцирована добавлением к культурам клеток ростовых факторов (HGF/SF, TGFp, EGF), а также активированием некоторых онкогенов.

Фактор роста HGF/SF является наиболее изученным белком, вызывающим ЭМТ. Рассмотрим механизм этой трансформации более детально. Скэттер-фактор (Scatter Factor, SF) - это белок, секретируемый фибробластами, который вызывает диссоциацию эпителиальных островков и миграцию эпителиоцитов из островка. Его воздействие на эпителиоциты вызывает разборку межклеточных контактов островка; клетки приобретают поляризованный подвижный фенотип, таким образом демонстрируя классическую ЭМТ (Stoker, 1989). По данным биохимического анализа, SF представляет собой гликопротеин, состоящий из двух связанных друг с другом субъединиц (Weidner et al, 1990). Было отмечено сходство структуры SF с фактором роста, воздействующим на гепатоциты

(Hepatocyte Growth Factor, HGF - Nakamura et al, 1989). По результатам секвенирования и иммунологических исследований была установлена идентичность этих молекул (Weidner et al, 1991). В настоящее время принято обозначение HGF/SF, объединяющее оба белка.

Действие HGF/SF осуществляется через его рецептор - трансмембранную протеинкиназу, кодируемую протоонкогеном met (Naldini et al, 1991). Рецептор HGF/SF состоит из двух ковалентно связанных субъединиц: аир. а-субъединица содержит один внеклеточный домен, отвечающий за связывание лиганда. (3-субъединица содержит несколько доменов, из которых наиболее важными являются лиганд-связывающий, трансмембранный и подмембранный тирозинкиназный домены (см. Birchmeier et al, 2003). На С-конце рецептора HGF/SF находятся два тирозиновых остатка. Фосфорилирование этих остатков после связывания лиганда способствует связыванию рецептора HGF/SF с белком-адаптером GaM (Sachs et al, 2000). GaM обеспечивает связывание и активацию белков-эффекторов met: фосфолипазы PLCy, что активирует протеинкиназу С, фосфатидилинозитол-3-киназу, а также комплекс Grb2-Sos, активирующий белок ras (Ponzetto et al, 1994). Кроме этого, под действием HGF/SF происходит активация малых ГТФ-аз семейства Rho, регулирующих динамику цитоскелетных структур. Исследование активности Rac и Rho при стимуляции эпителиальных клеток HGF/SF показало, что уже через 5 минут наблюдается кратковременная активация Rac, после чего активируется Rho (Zondag et al, 2000). При экспрессии в клетках доминантно-негативных мутантов этих белков приобретения подвижного фенотипа эпителиоцитами MDCK под действием HGF/SF не происходило (Royal et al, 2000).

В течение первых 4-6 часов действия HGF/SF происходит стимуляция псевдоподиальной активности, сопровождающаяся образованием раффлов и распластыванием клеток (Dowrick et al, 1990, 1991). Такая реакция клеток обусловлена активацией белков Cdc42 и Rac (Royal et al, 2000). После этого начинается стадия разборки межклеточных контактов и приобретение клетками подвижного фенотипа. Показано, что для этой стадии необходима активация белка гас, а также МАР-киназного каскада и фосфатидилинозитол-3-киназы. Активация этих компонентов сигнальных каскадов приводит к диссоциации белков межклеточных контактов Е-кадхерина и (3-катенина из контактных структур в цитоплазму клеток (Potempa & Ridley, 1998; Van Aelst & Symons, 2002). Диссоциация межклеточных контактов является одним из ключевых событий в

ЭМТ, однако в нашей лаборатории было показано, что гигантские многоядерные клетки, полученные с помощью инкубации в присутствии цитохалазина, под действием HGF/SF также распадаются на несколько подвижных цитопластов, соединенных друг с другом цитоплазматическими жгутами, содержащими пучки микротрубочек (Alexandrova et al, 1998).

Приобретение и поддержание подвижного фенотипа клеток определяется балансом активности малых ГТФ-аз семейства Rho. Показано, что относительно высокий уровень активности Rho и низкий уровень активности Rac определяет подвижный фенотип, в то время как обратное соотношение активностей приводит к неполяризованному дисковидному фенотипу (Sander et al, 1999, Zondag et al, 2000).

По данным иммунофлуоресцентного анализа, в эпителиальных клетках линий MDCK и PtK2, инкубируемых в течение 24 часов в среде, содержащей HGF/SF, сокращается количество стресс-фибрилл, а периферический пучок актиновых филаментов, характерный для контрольных клеток, полностью исчезает (Dowrick et al., 1991). В отростках, формируемых клетками линий MDCK и PtK2, инкубируемыми в течение 24 часов в среде, содержащей HGF/SF, выявляются микротрубочки и промежуточные филаменты. После 3 часов действия нокодазола у клеток, инкубируемых в среде, содержащей HGF/SF, почти все отростки исчезают (Prescott et al., 1992).

ЭМТ является мощным механизмом органогенеза в течение эмбрионального развития. Так, например, гаструляция раннего эмбриона сопровождается ЭМТ клеток эндодермы и их миграцией, ведущей к образованию мезодермы. Впоследствии ЭМТ обуславливает формирование скелетной мускулатуры, сердечных клапанов и периферической нервной системы позвоночных из нервного гребня (см. Thiery, 2002). Также во взрослом организме, при исследовании нормальной ткани молочной железы человека Met был выявлен в эпителиальных клетках, выстилающих протоки молочных желез (Tsarfaty et al., 1992).

HGF/SF является фактором роста для клеток печени, а также регулирует подвижный фенотип эпителиальных клеток других органов. Показано, что HGF/SF и его рецептор Met играют роль в канцерогенезе. При анализе экспрессии рецептора Met в неопластической ткани человека было показано, что Met экспрессируется в ткани гепатом, карциномах легкого, желудка, поджелудочной железы, ободочной и прямой кишки, почки, яичника, клетках рака кожи (Prat et al.,

1991). Было показано, что протоонкоген met активируется в результате хромосомной транслокации, при которой ген met, локализованный на хромосоме 7, попадает под контроль транслоцированного промотора tpr с хромосомы 1. Подобная транслокация trp-met часто обнаруживается в клетках карциномы желудка человека (Soman et al., 1991).

2.2 Мезенхимо-эпителиальная трансформация клеток

Наряду с ЭМТ, описанной выше, существует и обратный процесс -мезенхимо-эпителиальная трансформация клеток (МЭТ). В ходе этой трансформации клетки мезенхимального происхождения и имеющие мезенхимальный фенотип приобретают эпителиальные черты. Разрозненные соединительнотканные клетки собираются в компактные островки, соединенные непрерывными межклеточными контактами, содержащими эпителиальный маркер Е-кадхерин. Организация цитоскелета меняется на эпителиальную, и клетки приобретают базо-апикальную поляризацию (см. Barasch, 2001; Wiggan et al, 2002).

В нормальном развитии организма значение МЭТ наиболее очевидно в процессе эмбриогенеза, где она является необходимой составляющей формирования сомитов, целомической полости и почек. Роль МЭТ в эмбриогенезе почки наиболее хорошо изучена, и в нашем дальнейшем рассмотрении МЭТ мы будем в основном опираться на данные, полученные в этой тканевой системе.

В процессе образования зародышевой почки (метанефроса) уретра, представляющая собой полую трубку, выстланную клетками эпителия, врастает в скопление мезотелиальных клеток-т.н. метанефральную мезодерму. В результате этого рыхлое скопление мезенхимальных клеток компактизуется, клетки приобретают эпителиоидный фенотип и в ходе дальнейшей дифференцировки образуют нефроны, состоящих из клубочкового и канальцевого эпителия. Уретра врастает в метанефральную мезодерму и ветвится, образуя систему собирательных трубок (см. Saxen, 1987).

При исследовании тубулогенеза в эксплантированных клетках метанефральной мезодермы был выделен белковый фактор LIF (leukemia inhibitory factor), относящийся к семейству интерлейкинов, который был способен индуцировать МЭТ. В процессе нефрогенеза LIF секретируется клетками уретры, т.е., эпителиоцитами, а мезенхимальные клетки экспрессируют на своей

поверхности комплементарный рецептор (Barasch etal, 1999). Однако, LIF оказался не единственным фактором, способным индуцировать МЭТ. Было показано, что клетки уретры синтезируют и секретируют также факторы роста TGFJ32 и FGF2 - одновременное воздействие этих двух факторов также индуцировало МЭТ. Однако, наилучший результат давало одновременное воздействие на клетки всех трех белковых факторов (Plisov et al, 2001).

In vivo, для индукции МЭТ достаточно 24 часов, после чего клетки мезенхимального происхождения необратимо меняют программу дифференцировки на эпителиоидную (Saxen, 1987). Действительно, воздействия in vitro LIF или TGF|32 в комбинации с FGF2 в течение 24 часов было достаточно, чтобы после отмывки культур от факторов роста, МЭТ оказывалась необратимой. Клетки начинали экспрессировать эпителиальные маркеры, например, белок промежуточных филаментов цитокератин, и по истечении 6-7 дней, образовывать в культуре тубулоподобные структуры (Plisov et al, 2001). Очевидно, что данные факторы роста ответственны только за индукцию такого пути дифференцировки мезенхимальных клеток, а поддержание эпителиоидного фенотипа осуществляется за счет дополнительного воздействия.

Таким дополнительным воздействием оказался секретируемый.белковый фактор Wnt-4. Индукция МЭТ с помощью LIF или TGF02/FGF2 запускает синтез и секрецию Wnt-4 в мезенхимальных клетках, и дальнейшая эпителиальная дифференцировка происходит в условиях аутокринной стимуляции (Kispert et al, 1998, Vainio, 2003).

Полные сигнальные каскады, активируемые при МЭТ, еще не расшифрованы, однако была идентифицирована группа белков, несомненно принимающих в них участие. Группа транскрипционных факторов Pax включает в себя белки, экспрессирующиеся на разных стадиях эмбриогенеза и отвечающие за правильное формирование тканевых и органных структур (см. Torres et al, 1995). В частности, белок Рах-2 экспрессируется в клетках метанефральной мезодермы в ответ на индукцию МЭТ, и эта экспрессия абсолютно необходима для успешного протекания МЭТ. При инактивации рах-2 in vivo наблюдается лишь некоторое уплотнение почечной мезенхимы, но дальнейшего развития почечных структур у эмбрионов не происходит (Rothenpieler, 1993, Torres et al, 1995).

В другой клеточной системе (клетки остеосаркомы) была показана индукция МЭТ при кратковременной экспрессии другого транскрипционного фактора той же группы, рах-3. Клетки мезенхимального происхождения образовывали

эпителиоподобные островки, соединенные межклеточными контактами. Цитоскелетные структуры в таких клетках располагались согласно базо-апикальной поляризации (Wiggan et al, 2002).

3. Антионкоген р53 и его влияние на морфологию клеток

В данном разделе мы рассмотрим функцию и регуляцию белка р53. Опухолевый супрессор р53, нарушение функции которого является одним из наиболее распространенных изменений в опухолевых клетках, играет ключевую роль в контроле пролиферации клеток и апоптоза. Мы кратко коснемся основных характеристик р53 и подробнее остановимся на влиянии р53 на морфологию клетки.

3.1 Структура и функция р53

Белок р53 является транскрипционным фактором, распознающим и связывающимся со специфическими последовательностями ДНК. Эти последовательности представляют собой два участка типа PuPuPuCATATGPyPyPy, разделенными 0-13 нуклеотидами. Они называются р53-связывающими элементами и находятся в промоторах генов, чья экспрессия зависит от р53 (El-Deiry at al, 1992). р53 связывается со своими специфическими последовательностями ДНК в тетрамерной форме.

На белковой молекуле р53 картировано несколько функционально значимых доменов, играющих важную роль в проявлении и регуляции его активности (Ко & Prives, 1996). N-концевой домен р53 отвечает за активацию транскрипции, взамодействуя с транскрипционными факторами РНК-полимеразы II: ТВР и белками TAF (O'Rourke et al, 1990, Horikoshi et al, 1995). Связывание p53 с белками TAF также предохраняет его от связывания с mdm2 и последующей деградации (Buschmann et al, 2001). Также на N-конце молекулы р53 находится сигнал ядерного экспорта, необходимый для регуляции активности р53 (Zhang and Xiong, 2001).

В центральной части молекулы р53 находится ДНК-связывающий домен. Этот домен обеспечивает связывание р53 со специфической последовательностью ДНК (El-Deiry et al, 1992). Изменение конформации центральной области молекулы, нарушающее связывание р53 с ДНК, является ключевой особенностью часто встречаемых мутантных форм р53 (Milner and Metcalf, 1991).

Между трансактивационным и ДНК-связывающим доменами располагается небольшой обогащенный пролином участок, содержащий пять повторов РХХР (X - любая аминокислота). Делеция этой части молекулы р53 не влияет на трансактивацию генов-мишеней р53 Waf1 и mdm2 и р53-зависимую остановку клеточного цикла, однако может отменять р53-зависимую программу апоптоза (May and May, 1999, Sakamuro et al, 1997).

С-концевая часть молекулы p53 содержит много основных аминокислотных остатков (Soussi et al. 1990), Она состоит из гибкого промежуточного участка, тетрамеризационного домена, а также регуляторного С-концевого участка (May and May 1999). В немодифицированном состоянии регуляторный домен препятствует образованию комплекса между ДНК и центральным ДНК-связывающим доменом р53. В этом случае молекула р53 находится в латентном состоянии (Hupp et al, 1992). Также на С-конце молекулы находятся три сигнала ядерной локализации NLS (nuclear localization signal) (May and May 1999), а также сигнал ядерного экспорта NES в тетрамеризационном домене (Stommel et al. 1999).

3.2 Активация р53

Активация р53 происходит в ответ на множество различных стрессорных воздействий. Эти стрессорные воздействия приводят к усилению синтеза и функциональной активации р53 и, как следствие, к повышенной экспрессии генов-мишеней р53 (Fei & El-Deiry 2003). Специфические сигнальные пути контролируют активацию р53 в ответ на самые различные стрессы. Среди них разнообразные повреждения ДНК (Lakin & Jackson 1999), разрушение тубулинового цитоскелета (Tishler et al. 1995), появление полиплоидных и многоядерных клеток (Di Leonardo et al. 1997; Armit et al, 2002), остановка синтеза РНК (Chernova et al. 1995), окислительный стресс (Sandau et al, 1998), гипоксия (Graeber et al. 1994), активация онкогенов (Lowe, 1999).

Как правило, следствием активации р53 является остановка клеточного цикла или, при необратимых повреждениях, апоптотическая гибель клетки. В нашей работе мы исследовали остановку клеточного цикла в Gl-фазе и апоптоз, вызванные активацией р53. Рассмотрим подробней механизм этих эффектов.

3.3 р53-зависимая остановка клеточного цикла

Прохождение клетки по циклу регулируется активностью специфических ферментов - циклин-зависимых киназ (CDK) в комплексе с их регуляторными субъединицами - циклинами. Каждой фазе клеточного цикла соответствует определенный баланс активностей различных циклин-зависимых киназ. Так, в G1-фазе клеточного цикла активны комплексы циклин D1-Cdk4/6 (ранняя G1) и циклин E-Cdk2 (поздняя G1). В S-фазе активен комплекс циклин A-Cdk2 и в G2-фазе - циклин A/Cdc2. Для входа в митоз необходима активность комплекса циклин B/Cdc2. Регуляция активностей циклин-зависимых киназ определяется уровнем экспрессии определенных циклинов во время соответствующих фаз клеточного цикла.

Индукция р53 в ответ на стрессорные воздействия (например, повреждения ДНК) вызывает задержку клеточного цикла чаще всего в Gl-фазе (Ко & Prives, 1996, Levine, 1997). Этот эффект связан в основном с активацией транскрипции гена p21^waf1 (el-Deiry et al, 1994). p21waf1 является универсальным ингибитором циклин-зависимых киназ, связывающим комплексы циклин D1-Cdk4/6, циклин Е-Cdk2, циклин A-Cdk2. (Sherr & Roberts, 1999)

При связывании p21^waf1 с комплексом циклин D-Cdk4/6 в ранней Gl-фазе комплекс инактивируется. Его главный субстрат, pRb, таким образом, остается в нефосфорилированном состоянии, связанный с транскрипционными факторами группы E2F. E2F запускают транскрипцию ряда генов, необходимых для вхождения в S-фазу, например, гены тимидинкиназы, дигидрофолатредуктазы, циклина Е и циклина А, однако в комплексе с pRb они неактивны. Таким образом, за счет блокады фосфорилирования pRb и, следовательно, сохранения неактивного комплекса pRb-E2F клетка задерживается в Gl-фазе (Bartek et al, 1997).

3.4 р53-зависимый апоптоз

Существует два пути активации программированной клеточной гибели -апоптоза. Первый, называемый внутренним, связан с высвобождением цитохрома с и других апоптогенных факторов из митохондрий, приводящих к запуску каспазного сигнального каскада. Второй путь, называемый внешним, связан с активацией так называемых "рецепторов смерти", находящихся на поверхности клетки. Этот путь также приводит к активации каспаз. Белок р53 контролирует оба пути через активацию своих генов-мишеней (Fridman & Lowe 2003). Однако есть

данные, согласно которым р53 может запускать апоптоз независимо от активации генов-мишеней. Такая активация апоптоза связана с локализацией р53 в митохондриях (Moll & Zaika 2001).

Апоптозный фактор 1 (Apaf-1), активирующий протеазы (от англ. apoptosis protease-activating factor 1), который, соединяясь с цитохромом с, выступает эффектором активации апоптотического каспазного каскада, является прямой транскрипционной мишенью р53 (Moroni et al. 2001; Rozenfeld-Granot et al. 2002).

Белок p53 непосредственно активирует экспрессию каспазы 6 (Fridman & Lowe 2003), а также некоторых генов, способных вызывать клеточную гибель: гена белка клеточной мембраны PERP (Attardi et al. 2000), а также гена PIG3 (Contente, Dittmer et al. 2002). Гены PIG (от англ. p53-inducible genes) регулируют появление в клетке активных форм кислорода, которые приводят к разрушению митохондрий и запуску запрограммированной клеточной гибели (Polyak et al. 1997).

Вопрос о выборе клеткой между торможением клеточного цикла и апоптозом остается нерешенным. Набор и кинетика активации генов, экспрессия которых изменяется после стимуляции активности р53, зависит от характера активации р53, типа клеточной линии и количества белка р53 в клетке (Zhao et al. 2000). Известно, что р53-связывающие элементы, присутствующие в промоторах генов-мишенией р53, в силу различия своих первичных структур различаются по сродству к р53 (Kondratov et al, 1996). Как правило, промоторы р53-зависимых проапоптотических генов имеют более низкую аффинность, и для запуска транскрипции этих генов требуется более сильная активация р53 (Zhao et al. 2000). Кроме того, выбор может зависеть от типа клеток, условий роста и внутриклеточного контекста, например, параллельной р53-независимой экспрессии про- и антиапоптотических генов (Fridman & Lowe 2003).

3.5 Регуляция активности р53

Белок р53 в клетке может подвергаться различным посттрансляционным модификациям. Эти модификации направлены в первую очередь на изменение времени жизни белка р53 в клетке, а также его локализации и силы его связывания с р53-респонсивными сайтами на ДНК. Белок р53 присутствует в нормальных клетках в очень малом количестве. Время жизни р53 в клетке в отсутствие стресса составляет около 20 минут (Levine, 1989).

Процесс убиквитинирования р53 приводит к протеосомальной деградации р53, следовательно, уменьшает время жизни р53 и, соответственно, его функциональную активацию. Основную роль в этом процессе играет белок mdm2, являющийся транскрипционной мишенью р53. Mdm2, обладая ЕЗ-убиквитин-лигазной активностью, присоединяет молекулу убиквитина к полипептидной цепи р53, и, помимо этого, способствует экспорту р53 из ядра и направлению в протеосомы, где происходит деградация белков по убиквитин-зависимому механизму (Honda et al, 1997).

Многие сериновые и треониновые протеинкиназы обладают способностью фосфорилировать различные аминокислотные остатки р53 и таким образом менять конформацию молекулы и ее функциональную активность. Так, например, фосфорилирование Ser15 очень важно для функциональной активации р53. В ответ на повреждения ДНК в клетке происходит фосфорилирование р53 по Ser15 в течение первых часов стресса (Espinosa et al. 2003), которое повышает сродство р53 к своему сайту связывания на ДНК и способствует транскрипции эффекторов р53. Кроме этого, фосфорилирование р53 по Ser15 ослабляет взаимодействие р53 с mdm2 (Shieh et al. 1997) и способствует накоплению р53 в ядре за счет блокирования сигнала ядерного экспорта, находящегося в N-концевой части молекулы р53. В числе ферментов, способных осуществлять эту модификацию, описаны протеинкиназы ATM и ATR, которые обеспечивают фосфорилирование и активацию р53 при повреждениях ДНК, и , как следствие, опосредованную р53 остановку клеточного цикла (Westphal, 1997).

Активация р53-зависимой программы апоптоза осуществляется, в том числе, посредством фосфорилирования р53 по Ser46. Показано, что локализованная в ядре протеинкиназа HIPK2 (homeodomain-interacting protein kinase-2), которая активируется в ответ на ультрафиолетовое облучение клеток, связывает и фосфорилирует р53 по Ser46, что стимулирует в клетках р53-зависимую транскрипцию и включение апоптозной программы (D'Orazi, 2002). Именно фосфорилирование р53 по Ser46 относят к характерной модификации, связанной с апоптозом (Fridman & Lowe 2003).

3.6 Влияние р53 на морфологию клетки

В последнее время становится ясно, что спектр воздействий р53 на клетку не ограничивается остановкой клеточного цикла или апоптозом. Появились данные, свидетельствующие о том, что р53 оказывает определенное влияние также и на

морфологию клеток. Так, было показано, что гиперэкспрессия р53 в мышиных фибробластах, не содержащих эндогенного р53, сопровождается очевидными морфологическими изменениями. Клетки исходной линии представляли собой типичные фибробласты с хорошо выраженными параллельными актиновыми пучками и фокальными контактами по краям клетки. Экспрессия р53 вызывала резкую деградацию актиновых пучков и укорочение фокальных контактов. Псевдоподиальная активность таких клеток увеличивалась, но скорость их перемещения по субстрату падала (Alexandrova et al, 2000). Авторы объяснили этот феномен тем, что р53 обладает способностью подавлять экспрессию фибронектина - белка внеклеточного матрикса. Действительно, в использованной клеточной системе продукция фибронектина резко падала, как только начинал экспрессироваться р53. Без полноценного клеточного матрикса невозможно образование фокальных контактов и продвижение клетки по субстрату, несмотря на повышенную псевдоподиальную активность р53-положительных клеток.

Было также показано, что гиперэкспрессия р53 приводит к перестройке псевдоподиальной активности мышиных эмбриональных фибробластов. Происходило полное угнетение образования филоподии -длинных тонких выростов клеточной поверхности, содержащих пучки актиновых филаментов (Gadea et al, 2002). Образование филоподии происходит за счет полимеризации актина, регулируемой белком cdc42, который относится к группе малых ГТФ-аз. р53 не влиял непосредственно на активность cdc42, но полимеризация актина, приводящая к выбрасыванию филоподии, в клетках, экспрессирующих р53, была угнетена. Фибробласты, не несущие р53, наоборот, образовывали множественные филоподии по периметру клетки. Авторы не оценивали скорость движения клеток по субстрату, но отметили, что у клеток без р53 процесс распластывания происходил заметно быстрее. Распластывание, также, как и передвижение клетки, обусловлено выбрасыванием псевдоподий и последующим их прикреплением.

Суммируя вышеизложенное, можно сказать, что в мышиных фибробластах гиперэкспрессия р53 приводила к значительным морфологическим перестройкам. Эти перестройки можно охарактеризовать как "ослабление" актиновых филаментов и фокальных контактов. Обеими группами авторов были также замечены изменения псевдоподиальной активности клеток, вызванные экспрессией р53. Эти изменения приводили в одном случае к замедлению передвижения клеток по субстрату, в другом - к замедлению распластывания.

Неясно, однако, чем опосредованы эти изменения. Посадка клеток на стекло, покрытое фибронектином, не приводило к восстановлению актиновых филаментов и фокальных контактов (Alexandrova et al, 2000). Исследования активности cdc42 и его эффектора WASP также не дало однозначного ответа (Gadea et al, 2002). Тем не менее, обе серии экспериментов указывают на наличие стадии полимеризации актина, контролируемой р53 по неизвестному на сегодняшний день механизму.

Эксперименты, проведенные в основном на линии клеток карциномы кишечника человека НСТ116, дали результаты, отличающиеся от приведенных выше. НСТ116 - клетки с ярко выраженной трансформированной морфологией. Клетки линии НСТ116 - небольшие, слабо распластанные, с практически диффузным актином и единичными фокальными контактами. Исходная линия содержит р53 дикого типа, и существует также ее производная с нокаутированным р53. В работе Саблиной и соавт. исследовалась способность этих клеток к передвижению по субстрату в зависимости от р53 (Sablina et al, 2003). Авторы приводят доказательства того, что в данной клеточной системе р53 повышает способность клеток к миграции. Клетки НСТ116 с нокаутированным геном р53 медленнее выползали в "рану", сделанную в монослое, а также отставали при перемещении в камере Бойдена. Активация р53 при помощи агентов, вызывающих повреждения ДНК или гипоксию, увеличивала эту разницу. Следует отметить принципиальное отличие этой работы от двух предыдущих: результаты авторов, процитированных выше, были получены в клеточных системах с гиперэкспрессией нормального р53. Здесь же исследователи обращают внимание на эффекты, имеющие место при физиологически адекватных изменениях внутриклеточных концентраций р53.

Саблина и соавт. убедительно показывают, что в клетках НСТ116 наличие р53 обеспечивает активацию белка Rad - еще одного члена семейства малых ГТФаз, регулирующих полимеризацию актина. При этом общее количество белка Rac не отличается в р53-положительных и р53-отрицательных клетках. В принципе, активация одного только Rac в большинстве клеточных линий приводит к повышенному образованию псевдоподий по всему периметру клетки, но не к направленному движению. Однако, следует помнить, что НСТ116 -трансформированные клетки, несущие мутацию гена Ras. В большинстве клеток, трансформированных геном Ras, активность белка Rho, отвечающая за образование актиновых пучков и зрелых фокальных контактов, подавлена; по-

^

видимому, то же происходит и с линией НСТ116. В таких условиях активация белка Rac потенциально может привести к увеличению подвижности клеток за счет повышения псевдоподиальной активности.

Так активирует ли р53 подвижность клеток или, наоборот, ее подавляет? По-видимому, противоречивость данных, полученных разными авторами, может быть объяснена и различными методами экспрессии р53 (гиперэкспрессия в клетках, не содержащих р53 против нокаута в клетках, содержащих р53), и различиями между клеточными линиями, использованными в опытах. Естественно, что в контексте трансформированных клеток эпителиального происхождения активация р53 может приводить к совершенно другим результатам, чем в контексте нормальных или иммортализованных фибробластов. Тем не менее, следует отметить, что повышенная псевдоподиальная активность фибробластов при сниженной скорости их передвижения по субстрату, отмеченная Александровой и соавт., потенциально может быть объяснена р53-зависимой активацией Rac, как и в работе Саблиной и др.

Материалы и методы

1. Культуры клеток

В нашей работе мы использовали различные линии фибробластов, различающиеся по статусу р53, а также фибробластоподобные клетки карциномы. Все клеточные культуры были любезно предоставлены проф. Б.П. Копниным (лаборатория цитогенетики, Институт канцерогенеза РОНЦ РАМН), если не указано иначе.

1. REF - эмбриональные фибробласты крысы, полученные путем трипсинизациии крысиных эмбрионов второй половины беременности (для опытов использовали клетки, прошедшие 2-6 пассажей in vitro).

2. REF52-линия спонтанно иммортализованных фибробластов крысы, экспрессирующих р53 дикого типа (Ishizaka et al, 1995).

3. REF52/GSE22 - фибробласты крысы линии REF52, конститутивно экспрессирующие p53-GSE22. GSE22 представляет собой один из панели генетических супрессорных элементов - коротких фрагментов кДНК крысиного р53. Они кодируют короткие пептиды, соответствующей разным доменам р53, и действуют как домитантно-негативные элементы. GSE22 гомологичен С-концевому домену, где расположен сайт олигомеризации р53. Экспрессия GSE22 препятствует нормальной олигомеризации и функции р53 (Ossovskaya eta), 1996).

4. REF52/mdm2/2 - фибробласты крысы линии REF52, конститутивно экспрессирующие ген mdm2 - негативный регулятор активности р53. Белок mdm2 отвечает за убиквитинировние р53 и его последующую деградацию, таким образом укорачивая время жизни р53 в клетке. Клетки получены в Лаборатории клеточной пролиферации и любезно предоставлены проф. П.М. Чумаковым (Институт молекулярной биологии РАН).

5. REF52/CAT - фибробласты крысы линии REF52, конститутивно экспрессирующие плазмидную ДНК pADA-CAT, несущую ген устойчивости к

генитицину и репортерный ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) под р53-респонсивным промотором (Кондратов, 1996).

6. 12(1) -линия ЗТЗ-подобных фибробластов мыши, экспрессирующих р53 дикого типа. В клетки, использованные нами, был встроен вектор pConALacZ, несущий репортерный ген бактериальной Р-галактозидазы под р53-респонсивным промотором (Komarova et al, 1997). Показано, что в условиях нормального культивирования клетки 12(1) не окрашиваются на р-галактозидазу, тогда как при активации р53 (например, при воздействии у-облучения), окрашиваются 90% клеток (Komarova et al, 1997).

7. 10(1) -линия ЗТЗ-подобных фибробластов мыши, не экспрессирующих р53. Показано, что оба аллеля р53 у этих клеток были утрачены в ходе иммортализации (Harvey & Levine, 1991).

8. С8 (р53+/+) и А4 (р53-/-) - иммортализованные фибробласты мыши, экспрессирующие ген Е1А и конститутивно активный H-ras (Lowe at al, 1993).

9. HCT116 p53+/+ и HCT116 p53-/--линия клеток карциномы кишечника человека и ее производная с нокаутированным р53 (Bunz et al, 1998).

Все клеточные линии инкубировались в среде DMEM (Life Sciences) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят (ПанЭко), ЮОЕд/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

В ходе экспериментов клетки инкубировались с различными агентами:

цитохалазин D (Sigma), 0.2-0.4 мкг/мл

колцемид (Serva), 0.1-0.4 мкг/мл

дефероксамин (DFO) (Sigma) 100-400 мМ.

2. Вестерн-блот анализ

Клетки в количестве 10⁷ промывали дважды холодным PBS и переносили в 0,5 мл холодного лизирующего буфера (20мМ HEPES рН7,6, ЮмМ NaCI, 1,5 mM MgCI₂, 0,2 мМ ЭДТА, 20% глицерин, 0,1% Тритон Х-100, 1мМ дитиотреитол, 1мМ

PMSF, 100 мг/мл апротинин). Целые ядра, отделенные центрифугированием, инкубировали на льду со встряхиванием в том же буфере с добавлением 500 мМ NaCI. После центрифугирования, супернатант подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия. Белки, перенесенные на мембрану ECL, инкубировали с антителами рАЬ421, специфичными к р53 (антитела были любезно предоставлены проф. П.М. Чумаковым (Институт молекулярной биологии РАН)). Проявление блота проводили с помощью ECL Western blotting kit (Amersham).

3. Определение трансактивационной способности р53

3.1 Анапиз активности хлорамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT)

Клетки в количестве 1-1,5x10⁶дважды промывали раствором PBS, собирали скребком в 0.25М Tris-HCI рН 7,8 и лизировали замораживанием-оттаиванием. Эквивалентные по белковому содержанию клеточные экстракты инкубировали с хлорамфениколом, содержащим С¹⁴, и ацетил-СоА при 37С в течение 1-3 часов. Продукты реакции экстрагировали этилацетатом, хроматографировали на силикагеле в системе хлороформ/метанол 19:1 и экспонировали контактным способом на рентгеновской пленке в течение суток.

3.2 Анализ активности р-галактозидазы.

Клетки промывали 5-6 раз PBS и фиксировали 1% глутаральдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем клетки промывали 3-4 раза PBS и инкубировали при 35С в течение ночи в растворе, содержащем 0,2% Xgal, 3,3 мМ K4Fe(CN)₆, 3,3 мМ K₃Fe(CN)₆, 1мМ MgCI₂ (25 мкл на стекло). После инкубации клетки промывали 3-4 раза PBS и заключали в 50% глицерин на PBS.

4. Анализ вхождения клеток в S-фазу цикла по включению 5-
бромдезоксиуридина (5-BrdU) в ДНК.

Клетки инкубировали с 5-BrdU в концентрации 100 мМ. По окончании инкубации клетки промывали 3-4 раза PBS, затем фиксировали 3,7% раствором параформальдегида на PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее клетки инкубировали с 1% раствором Тритона Х-100 на PBS в течение 10 минут, промывали 3-4 раза PBS и инкубировали в течение 10 минут с 4N HCI.

РОССИИСКЛП ГССУДЛГ'СТГТІННЛП

fл- -.;;;:о7і:кл

Для выявления включения 5-BrdU использовали метод непрямой иммунофлуоресцентной окраски. Клетки последовательно инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре сначала с антителами, специфичными к 5-BrdU (BU-33, Sigma), а затем с антителами к мышиным IgG, меченными TRITC. Для одновременной окраски ядер использовали флуоресцентный краситель Hoechst #33258 (Sigma).

5. Апоптотическое фрагментирование ДНК

Клетки в количестве 1,5-3x10⁶ соскребали в центрифужные пробирки, промывали PBS и осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали 30 мин в 200 мкл лизисного буфера (20мМ Tris-HCI рН7.5, ЮмМ ЭДТА, 0,2% Тритон X-100). После центрифугирования супернатант обрабатывали протеиназой К (0,1 мг/мл) в течение 1,5 ч при комнатной температуре и подвергали экстракции смесью фенола с хлороформом и затем хлороформом. ДНК осаждали путем добавления ацетата аммония до концентрации 2М и этанола. После этого препарат ДНК обрабатывали РНКазой А (0,1 мг/мл) в течение 1,5ч и разделяли в 1% агарозном геле.

6. Флуоресцентная окраска

6.1 р53

Для выявления р53 покровные стекла с клетками промывали 3-4 раза PBS и фиксировали смесью метанол/ацетон 1:1 в течение 10 минут. После этого ацетон/метанол постепенно заменяли PBS. В качестве первых антител использовали рАЬ421, специфичные кр53 (антитела были любезно предоставлены проф. П.М. Чумаковым (Институт молекулярной биологии РАН)). После отмывки от первых антител стекла инкубировали с антителами против мышиных IgG, конъюгированными с биотином. После отмывки от вторых антител покровные стекла инкубировали в растворе стрептавидина, меченного FITC (Dianova).

6.2 Ядра

Для окраски ядер применяли ДНК-специфичный флуоресцентный краситель Hoechst #33258 (Sigma). Покровные стекла с клетками промывали 3-4 раза PBS, затем фиксировали 3.7% раствором параформальдегида в PBS. После фиксации промывали 3-4 раза PBS и инкубировали в растворе 0,1-1%Тритона Х-100 в

течение 5 мин. Покровные стекла инкубировали в растворе Hoechst #33258 в течение 30 мин.

6.3 Цитоскелетные белки

актин

Для выявления актин-содержащих цитоскелетных структур проводили фиксацию клеток 3,7% теплым формальдегидом на PBS в течение 10 минут, затем проводили экстракцию в течение 2 минут 0,2-0,5% раствором Тритона Х-100 на PBS. Для окрашивания полимеримеризованного актина использовали тетраметилродаминилфаллоидин (Sigma) или фаллоидин, конъюгированный с красителем Alexa488 (BD Transduction Labs).

микротрубочки

Для выявления микротрубочек использовали мышиные моноклональные антитела к а-тубулину (клон DM1 A, Sigma). Предварительно клетки фиксировали холодным метанолом в течение 10 минут при температуре -20С.

фокальные контакты (паксиллин)

Для выявления фокальных контактов использовались мышиные моноклональные антитела к паксиллину (клон 349, BD Transduction Labs). Предварительно клетки фиксировали также, как при окраске на актин.

межклеточные контакты (Р-катенин)

Для выявления фокальных контактов использовались мышиные моноклональные антитела к р-катенину (клон 14, BD Transduction Labs). Предварительно клетки фиксировали также, как при окраске на актин.

При использовании метода непрямой иммунофлуоресценции в качестве вторых антител использовали ослиные антитела к мышиным IgG, конъюгированные с флуоресцентными красителями (Chemicon).

Все окрашенные препараты заключали в водный раствор эльванола.

6.4 Прижизненная окраска митохондрий

Покровные стекла с клетками промывали 2-3 раза средой DMEM без сыворотки и добавляли краситель Rhodamine123 (Sigma) в концентрации ЮОмМ на 15 минут при 37С. После инкубации покровные стекла промывали вновь средой без сыворотки и инкубировали 15 минут. После этого покровные стекла

погружали клетками вниз на каплю PBS на предметном стекле; края камеры запечатывались расплавленным парафином. Съемку вели на предварительно подогретом до 34С предметном столике в течение 15-20 мин.

Наблюдения проводили с помощью микроскопов Leitz Axiophot и Zeiss Aristoplan. Съемку вели с помощью камеры Olympus D70.

7. Количественный анализ морфологии клеток.

Полученные изображения одиночных клеток использовались для морфометрического анализа. Контуры клеток с учетом масштаба были введены в компьютер и проанализированы с помощью программы Tracer 1.0, разработанной и любезно предоставленной А. Брауном (Dunn & Brown, 1986). При анализе использовался параметр площади клеток, а также два параметра, характеризующие форму клеток: дисперсия и элонгация. Элонгация - величина, характеризующая степень вытянутости клеток- равняется нулю у радиально симметричных фигур. Дисперсия - величина, выражающая степень "изрезанности" края клеток - равняется нулю у любого эллипса (рис. 1). Таким образом, эти две величины отражают степень поляризованности клеток.

О L 1 ^

элонгация

Рис. 1 Схема оценки результатов метода морфометрического анализа по Dunn & Brown, 1986

Результаты

Похожие диссертации на Роль опухолевого супрессора р53 в регуляции организации цитоскелета и формы нормальных и опухолевых клеток

Роль иммунофенотипирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железыАртамонова Елена Владимировна

Диагностическая и прогностическая роль активационных антигенов опухолевых клеток при диффузной В-крупноклеточной лимфомеЗейналова Первин Айдын кызы

Исследование молекулярного механизма развития и поддержания эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы человека: роль сигнальных белков STAT3, PI3K и NF-kappa BЛобанова Юлия Сергеевна

Роль гликопротеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке гемопоэтических клеток человекаЗаботина Татьяна Николаевна

Роль цитотоксических белков тромбоцитов в механизме гибели опухолевых клетокГолубева, Татьяна Сергеевна

Роль оксида азота в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клетокКакурина Гелена Валерьевна

Роль точечных мутаций CTAR-доменов гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр в модификации сигнальных путей клеткиДидук Сергей Васильевич

Современные подходы к организации и совершенствованию методов паллиативного лечения больных Диссеминированными формами злокачественных новообразованийНиколаева Надежда Владимировна

Клинико-патогенетическая роль растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы в развитии иммунопатологии человекаЕвсегнеева Ирина Валентиновна

Роль цитотрофобласта плаценты человека в регуляции способности дендритных клеток стимулировать клеточные формы иммунных реакцийМатвеичев, Алексей Валерьевич