Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.
1. Основные свойства трансформированной клетки, обеспечивающие процесс метастазирования 10
1.1. Потеря зависимости от ростовых факторов 10
1.2. Нечувствительность к ингибиторам роста 11
1.3. Уклонение от клеточной гибели 13
1.4. Способность к бесконечному делению 15
1.5. Способность к стимуляции ангиогенеза 16
2. Изменение клеточной адгезии - необходимое свойство мстастазирующей клетки 18
Глава 2.
3. Молекулярные шаперопы в процессе канцерогенеза 20
3.1. Классификация шапероиов 20
3.2. Регуляция экспрессии шапероиов 21
3.2.1 Экспрессия шапероиов в опухолях 23
3.3. Роль шапероиов в индукции пролиферации и угнетении апоптоза 24
3.3.1. Шаперопы плазматической мембраны 24
3.3.2. Шаперопы цитозоля 26
3.3.3. Митохондриальные шаперопы 27
3.3.4. Ядерные шаперопы 28
3.3.5. Шаперопы эндоплазматического ретикулума 28
3.4. Роль кошаперонов в определение специфичности и интеграции шапероиов HSP90 и HSP70 33
3.4.1. Молекулярные кошапероны класса Hsp40 (MDG1) 35
3.4.2. Открытие и исследования функций кошаперона ERdj4/MDGl 36
Заключение 40
- Уклонение от клеточной гибели
- Способность к стимуляции ангиогенеза
- Шаперопы плазматической мембраны
- Шаперопы эндоплазматического ретикулума
Введение к работе
Несмотря на огромные успехи в исследовании механизмов канцерогенеза, на сегодняшний день мстастазирование изучено далеко не полностью. Одним из наиболее значимых методом при изучении канцерогенеза является анализ клеточных линий, полученных из клеток опухолей или трансформацией in vitro. Метод трансформации клеточных культур вот уже 50 лет считается одним из самых действенных в отношении поиска генов, вовлеченных в канцерогенез. В изучении процесса метастазирования в физиологических условиях значимые результаты могут быть получены при введении полученных клеточных линий сингенным животным или бестимусным мышам. Для этой цели животному ортотопично вводится исследуемая клеточная линия. При моделировании поздних стадий метастазирования клетки вводятся непосредственно в кровеносное русло. Данные методы классифицируются как анализ спонтанного и экспериментального метастазирования, соответственно.
Наиболее адекватное исследование метастазирования включает введение подопытным животным пары клеточных линий, отличающихся по метастатическому потенциалу, но близких по остальным биологическим характеристикам, например, клеточных линий, полученных из опухолей схожей этиологии, но отличающихся по
в уровню метастазирования.
Одной из самых перспективных клеточных моделей для изучения
, метастазирования является система клеточных линий, полученных в результате
инфицирования первичных эмбриональных фибробластов сирийского хомячка (HEF)
различными і ізолятам н штамма Schmidt-Rupin D (SR-D) вируса саркомы Рауса (RSV) в
лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН под
руководством д.б.н. Галины Исааковны Дейчман. Все полученные линии имеют типично
трансформированный фенотип и являются высокотуморогенными для сннгенных
животных. При внутривенном введении взрослым хомячкам, клетки всех линий
проявляют высокую экспериментальную метастатическую активность (ЭМА).
Значительные отличия выявлены при исследовании спонтанной метастатической
активности (СМА) при подкожном введении исследуемых клеточных культур. Следует
) отметить, что условия СМА-теста более приближены к естественным процессам
метастазирования, чем тест ЭМА.
В представленной работе использовались две линии этой серии - низкометастазная
,ч HET-SR и высокометастазная HET-SR1, согласно тесту СМА. Линии HET-SR и HET-SR1
отличаются по последовательности v-src, введенного при инфекции различными
* изолятами RSV-SR-D. Клеточная линия HET-SR содержит иизкометастазный вариант v-
srcLM (low metastasis), а высокометастазная линия HET-SR1 - v-srcHM (high metastasis). При подкожном введении животным опухолевых клеток HET-SR, метастазы либо не формировались вообще (50% случаев), либо образовывались в количестве 1-20 у одного животного. Клетки линии HET-SR1 формировали от 30 до 300 метастазов в легких животных.
Для сравнения экспрессии генов в клетках с различным метастатическим потенциалом в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза использовали метод дифференциального дисплея, с помощью которого получены фрагменты кДНК генов, высоко экспрессирующиеся в низкометастазной HET-SR или в высокометастазной HET-SRI линиях. Один из фрагментов, длиной в 365 нуклеотидов, выделенный из линии HET-SR, проявил гомологию с геном дифференцировки эндотелия 1 - MDG1 (microvascular differentiation gene 1), относящимся к 40-му классу белков теплового шока (Hsp40).
Целью данной работы являлось изучение участия гена дифференцировки эндотелия 1 в реализации метастатического фенотипа различных клеточных линий.
В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи:
Получить полноразмерную копию хомячкового гена дифференцировки эндотелия 1- shMDGl (Syrian hamster homologue of MDG1);
Подтвердить дифференциальность экспрессии гена shMDGl в клеточных линиях HET-SR и HET-SR 1;
Получить модельную систему клеточных культур, стабильно экспрессирующую кДНК гена shMDGl;
Изучить влияние экзогенной экспрессии гена shMDGl на способность клеточных линий образовывать метастазы в легких сингенных животных;
Оценить уровень экспрессии человеческого гена ERdj4/MDGl в опухолевых и нормальных тканях.
В результате исследований впервые получена и депонирована в GenBank последовательность открытой рамки считывания хомячкового гена дифференцировки эндотелия 1 - shMDGl. Показано, что экспрессия гена shMDGl повышена в низкометастазирующей линии HET-SR по сравнению с высокометастазирующей HET-SRI. Методом трансформации получены клеточные культуры, стабильно экспрессирующне кДНК гена shMDGl. При введении последних сингенным животным
ч показано снижение метастатической активности исходных родительских культур. Более
того, мы впервые показали, что инъекция ДНК гена shMDGl в опухоль, сформированную
і высокометастатнческой клеточной линией, снижает ее' метастатическую активность.
Изучено влияние продукта гена shMDGI на пролиферацию клеток с различным метастатическим фенотипом. Также впервые показано негативное влияние экспрессии этого гена на Asn-зависимое Р(1,6)-гликозилироваиие, характеризующие клетки с высоким уровнем метастазирования.
Изучение механизмов профессии модельных клеточных линий является фундаментальной проблемой современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии злокачественных новообразований. В ходе работы сконструирован набор генно-инженерных векторов, содержащих ген shMDGI, а также получена панель RSV-трансформированных клеточных культур с высокой экзогенной экспрессией данного гена, которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях в области экспериментальной онкологии.
*
Уклонение от клеточной гибели
В настоящее время принято считать, что запрограммированная гибель клеток осуществляется не только через апоптоз, но и некроз, автофагию, митотическую катастрофу [Schmitt, 2003]. Апоптоз является наиболее изученным и распространенным механизмом клеточной гибели и считается, что опухолевые клетки, прежде всего, теряют способность именно к апоптозу.
Апоптотическую программу принято разделять на две части. Первая - сенсорная -часть этой программы реализуется молекулами, которые получают экзогенные и эндогенные сигналы и затем передают их второй, эффекторной системе молекул, реализующих вторую часть программы - разрушение клетки.
После получения экзогенного или эндогенного сигнала активируется ряд протеаз, в результате через 30-120 минут ядро клетки фрагментируется, хромосомы разрушаются, мембрана образует структуры, похожие на пузыри, затем остатки клетки поглощаются соседними клетками. Через 24 часа от умершей клетки ничего не остается.
К сенсорным молекулам, получающим экзогенные сигналы, относятся мембранные рецепторы, взаимодействующие с ростовыми факторами (например, IGF и IGF-R; IL-3/IL-3R) и, так называемыми, факторами смерти, (FAS-лиганд и его рецептор FAS-R; TNFa и TNFa-R). Внутриклеточные сенсоры следят за благополучным функционированием всех клеточных систем и активируются в случае обнаружения неисправностей, таких как повреждения ДНК, гипоксия, активность онкогенов, слабый митогеиный сигнал. Кроме того, в поддержании клеточной жизни важную роль играют межклеточные взаимодействия и прикрепление к внеклеточному матриксу.
В настоящее время интенсивно изучается активация апоптоза в ответ на повреждения в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), или ЭПР-стресс. Эндоплазматический ретикулум является основным пунктом для сборки белков и синтеза фосфолипидов, а также выполняет важнейшую роль в поддержании уровня ионов кальция в клетке. Считается, что примерно треть всех клеточных белков транспонируется в ЭПР [Shen et аі., 2002]. Ингибирование ферментов гликозилировапия, перегрузка ЭПР вирусными белками приводит к индукции так называемого UPR (unfolded protein response), т.е. ответа на появление в люмене ЭПР белков с нарушенной конформацией. В ответ на UPR вступает в силу программа деградации белков ЭПР - ERAD (ER-associated degradation) или апоптоз. При сильных стрессах, когда невозможно в короткие сроки восстановить функции ЭПР, например, при действии фармакологических агентов, таких, как туникамицин (ингибитор N-гликозилирования), брефельдин А (блокатор везикулярного транспорта от ЭПР к аппарату Гольджи), дитиотреитол (ингибитор образования дисульфидных мостиков), тапсигаргин (ингибитор Са2+-насоса), клетка умирает в течение 20-48 часов.
Индукция апоптоза при ЭПР-стрессе происходит в результате активации прокаспазы-12, находящейся на мембране ЭПР. Механизмы активации прокаспазы-12 еще до конца не ясны [Yoneda et al., 2000]. Известно, что при кислородном и глюкозном голодании в клетках глии прокаспаза-12 расщепляется Са2+-зависимым кальпаином [Kaufman, 2002]. Кроме того, при амплификации апоптотического сигнала, активируемого не ЭПР-стрессом, прокаспазу-12 расщепляет каспаза-7 [Kaufman, 2002].
Большинство сигналов, запускающих апоптоз, аккумулируется в митохондриях, которые в свою очередь отвечают освобождением цитохрома с (Cyt с) - сильнейшего "катализатора апоптоза ". Регуляторами освобождения Cyt с из митохондрии являются белки семейства BcI-2 (В-ceII Iymphoma-2 protein), состоящего из проапоптотических (Вах, Bak, Bid, Віт) и аитиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W). Опухолевый супрессор р53 в ответ на повреждения ДНК повышает уровень экспрессии Вах, тем самым провоцируя апоптоз.
Последним этапом запуска апоптоза является активация цепной реакции гидролиза протеаз, относящихся к классу каспаз. Сигналы, поступающие от мембранных рецепторов или от Cyt с, активируют, соответственно, каспазу 8 или 9, которые инициируют активацию более десятка других каспаз. Каспаза-12, активирующаяся в ответ на ЭПР-стресс, расщепляет прокаспазу-9. В итоге индуцируются эффекторные протеазы, расщепляющие субклеточные структуры, органеллы, хромосомы и т.д.
Считается, что опухолевые клетки приобретают устойчивость к апоптозу вследствие различных изменений. Так, 50% известных человеческих опухолей несут мутации в опухолевом суппрессоре р53 [Levine, 1997], который является основным сенсорным белком при активации апоптоза в ответ на повреждение ДНК, гипоксию, гиперэкспрессию онкогенов и т.д. Кроме того, уклоняясь от апоптоза, злокачественная клетка способна увеличить силу аитиапоптотических сигналов. Например, активация PI3K - ЛКТ/РКВ сигнального пути возможна за счет нескольких механизмов: увеличения экспрессии внеклеточных факторов IGF-1/2 или IL-3 [Evan et al., 1998]; повышения экспрессии внутриклеточного онкогена Ras [Downward, 1998]; потери опухолевого суппрессора pTEN, который в норме ингибнрует функцию АКТ [Cantley et al., 1999]. С 1972 года, когда Kerr впервые показал, что хорошо растущие гормонозависимые опухолевые клетки уходят в апоптоз после удаления из питательной среды гормона, было открыто множество других механизмов уклонения от клеточной смерти в процессе канцерогенеза [Kerr et al., 1972].
В принципе, приобретения клеткой автономии от митогенного сигнала, нечувствительности к антиростовым факторам и апоптозу достаточно для образования опухоли. Однако, неограниченное клеточное размножение не приводит к злокачественной трансформации. Оказалось, что почти все клетки млекопитающих имеют еще один независимый механизм надзора за клеточным делением, который необходимо обойти клетке на пути к озлокачествлению. Это - программа количественного контроля циклов делений клетки.
Клеточная популяция проходит в среднем 60-70 делений in vitro, после чего рост невозвратимо останавливается в Go фазе - феномен клеточного старения [Hayflick, 1965].
Инактивация pRb и р53 дает клетке возможность преодолеть запуск программы старения и пройти еще несколько дополнительных делений, до тех пор, пока клетки не войдут в следующее состояние - кризис, который характеризуется массивной неконтролируемой клеточной смертью в результате хромосомной нестабильности. В среднем, на десять миллионов клеток, пребывающих в стадии кризиса, появляется одна способная делиться вечно - иммортализованная. Экспериментальные клеточные культуры и злокачественные опухоли состоят в большинстве своем из «бессмертных» клеток.
Механизмом ограничения числа клеточных делений принято считать потерю от 50 до 100 иуклеотндов, расположенных на концах хромосом (теломерная ДНК), во время каждой S-фазы. Теломеры состоят из нескольких тысяч шестинуклеотидных повторов и комплексов, соответствующих сайтам прикрепления ДНК-связывающих белков, предохраняющих концы хромосом от слипания. При каждом раунде репликации ДНК-полимеразы не копируют 3 концы ДНК, вследствие чего и происходит прогрессивная потеря концевых участков хромосом її последующее их слипание (стадия кризиса).
Очевидно, что все опухолевые клетки «умеют» поддерживать длину теломер. 90% зарождающихся опухолевых клеток повышают экспрессию теломеразы — фермента, добавляющего шестинуклеотидные повторы к концам хромосом после каждого деления, а оставшиеся 10%-активируют межхромосомный обмен иуклеотндов.
Способность к стимуляции ангиогенеза
Разрастание клона опухолевых клеток приводит к появлению новой проблемы -питания и выведения продуктов метаболизма. Доставка питательных веществ методом диффузии не эффективна в клеточном слое толщиной приблизительно в 100 мкм (около 5-10 клеток) и требует образования капиллярной сети. В организме такое плотное прилегание сосудов достигается в процессе совместной регуляции роста клеток кровеносных сосудов (ангиогенеза) и паренхимы во время органогенеза. В сформировавшейся ткани рост кровеносных сосудов - неоангиогенез, происходит только при заживлении ран и циклических перестройках организма.
Как уже обсуждалось, деление и дифференцировка клетки - процессы, построенные на балансе между активаторами и ингибиторами, как растворенными в среде, так и прикрепленными к внеклеточному матриксу или поверхности соседних клеток. Тот же принцип соблюдается и при регуляции ангиогенеза. Наиболее изученными растворенными активаторами ангиогенеза являются фактор роста васкулярного эндотелия (VEGF) и фибробластов (FGF), а из ингибиторов -тромбоспондин-1. Изменение сродства к внеклеточному матриксу клеток эндотелия, т.е. смена одного класса интегринов на другой, является важнейшим этапом на пути формирования сосуда. При заживлении в рану привлекается множество клеток, обеспечивающих реакцию воспаления, таких, как макрофаги, лимфоциты и эндотелиоциты. Безусловно, значительную роль в заживлении раны играют межклеточные взаимодействия между выше перечисленными клетками.
Ответ эндотелиальных клеток на сигналы усиления неоангиогснсза состоит из трех компонентов. Во-первых, эндотелиальные клетки должны разрушить базальную мембрану родительского капилляра. Показано, что на этом этапе решающую роль играют секретируемые протеазы, в частности, активатор плазминогена. Во-вторых, эндотслиальная клетка должна двигаться по направлению к нуждающейся в сосуде ткани. В-третьих, эндотелиальные клетки должны делиться. VEGF и FGF вызывают все три компонента реакции эндотелиальных клеток. Помимо сильно выраженного действия на эндотелиальные клетки, эти факторы стимулируют ростфибробластов [Ribatti, 2005].
Вершиной эволюционного развития опухолевой клетки является приобретение сю способностей, наиболее опасных для организма - интравазии и метастазирования. Безусловно, прогрессирующая опухолевая клетка, так же, как и зарождающаяся, должна содержать все признаки, описанные в предыдущей главе. Более того, эти изменения и те, что формируют инвазивный и метастатический фенотип, видимо, накапливаются параллельно. К тому же, метастатическая активность клеток может являтся отражением совокупности вышеописанных признаков и не требовать приобретения каких-либо дополнительных генетических изменений. Известно, что при трансформации такими сильнейшими онкогенами как Мус, Ras или Src клетки становятся метастатически активными, вследствие изменения целого ряда белковых систем.
Инвазия и метастазирование - чрезвычайно сложные процессы, протекающие внутри организма и вызывающие сходные изменения в физическом прикреплении опухолевых клеток. В настоящее время известно два типа белков, вовлеченных в процесс прикрепления клетки к внеклеточному матриксу и окружающим клеткам, которые претерпевают изменения в ходе приобретения метастатического фенотипа. Оба типа молекул играют важную роль не только в физическом прикреплении клетки к субстрату или другой клетке, но и в передаче митогенного и антимитогенного сигналов. Молекулы, прикрепляющие клетку к внеклеточному матриксу, называются ннтегринами. Молекулы, прикрепляющие одну клетку к другой, разделяют на два семейства - кадгерины и иммуноглобулиноподобные молекулы адгезии (immunoglobulin-like cell-adhesion molecules (Ig-CAMs)).
Необходимо отметить, что изменение сродства клетки к окружающим структурам меняет сигнальные пути, и vice versa. Например, инактивация антимитогенного сигнального пути, запускаемого Е-кадгерином, наблюдается в большинстве эпителиальных раков. Выключение сигнального пути происходит вследствие генетических изменений в одном из участников проведения сигнала: Е-кадгерине, Р-катенине или транскрипционном факторе Lef/Tcf [Cavallaro et al., 2004]. Кроме того, инактивация Е-кадгеринового сигнального пути происходит и вследствие посттрансляционных модификаций - фосфорилировапия кадгерина и катенинов рецепторними тирозин-киназами, такими как EGFR, с-МЕТ, FGFR, и нерецепторными, такими как Src. Фосфорилированные кадгерины и катенины подвергаются протеосомной деградации [Fujita et al., 2002]. Более того, индукция экспрессии металлопротеаз, стимулирующих иивазивность клеток, происходит в результате растворения надмембранной части Е-кадгерина [Nawrocki-Raby etal., 2003].
Таким образом, потеря Е-кадгерина индуцирует переход эпителиального фенотипа в мезенхимальный (epithelial-mesenchymal transition (ЕМТ)), т.е. клетка теряет полярность, приобретает кадгерины мезенхимального типа, которые позволяют опухолевой клетке прикрепляться к стромальным клеткам (фибробластам) и обеспечивают способность к передвижению, т.е. к инвазии.
Немаловажным изменением в клетке является повышение экспрессии N-CAM. Молекулы N-CAM, N-кадгерина и EGFR кооперируются цитоплазматическими доменами и запускают сигнальный путь, активирующий пролиферацию и экспрессию интегринов [Cavallaro et al., 2004].
Другой важнейшей характеристикой инвазивной и метастатической клетки является активация внеклеточных протеаз. Разрушение внеклеточного матрикса -неотъемлемая составляющая не только метастазирования, но и неоангиогенеза. Нередко в злокачественных клетках наблюдается пониженная экспрессия генов ингибиторов протеаз. Протеазы обычно находятся на поверхности клетки в неактивном состоянии (профермент) и ассоциированы со специальными протеазными рецепторами или интегринами. Кроме того, метастазирующие клетки могут использовать протеазы соседних стромальных клеток. Так, некоторые раковые клетки индуцируют в окружающих фибробластах экспрессию активатора плазминогена урокиназного типа (иРА), который связывается со своим рецептором (uPAR), находящимся на поверхности раковых клеток.
Активация внеклеточных протеаз, изменение сродства интегринов, кадгеринов и CAMs к субстратам, являются центральным механизмом в приобретении инвазивного и метастатического фенотипа, но молекулярные процессы, регулирующие появление данного фенотипа, до сих пор остаются невыясненными. Кроме того, они, скорее всего, специфичны для каждого типа ткани.
Шаперопы плазматической мембраны
Изменение экспрессии одного или нескольких молекулярных шаперонов наблюдается практически во всех типах опухолей, при этом возрастание экспрессии коррелирует с прогрессией и, следовательно, с повышением риска смертности [Jolly et al., 2000; Soti et al., 1998]. Таким образом, молекулярные шапероны можно использовать в качестве биомаркеров опухолевого роста. Например, HSP70 входит в группу генов, изменение экспрессии которых характерно для прогрессии рака легкого [Beer et al., 2002], рака молочной железы [Nylandsted et al., 2000], рака желудка [Isomoto et al., 2003]. Экспрессия HSP27 повышена в клетках карциномы толстой кишки [Garrido et al., 1998], рака желудка [Kapranos et а!., 2002], a HSP90 - в клетках карциномы простаты [Akalin et al., 2001].
Является ли повышенный уровень шаперонов причиной или следствием возникновения опухоли - до сих пор не ясно. Но очевидно, что шапероны связаны с ростом злокачественных клеток в изменяющихся условиях. Так, состояние гипоксии в бедно васкуолизированной опухоли индуцирует экспрессию шаперонов, которые восстанавливают и поддерживают конформацию, а, следовательно, функцию важнейших сигнальных белков. Тем не менее, избыточное количество шаперонов способно «скрывать» от деградации мутированные белки, т.е. генетические и эпигенетические изменения, содействующие трансформации [Csermely, 2001]. Кроме того, шапероны обеспечивают выживание клетки, блокируя апоптоз и активируя пролиферацию, т.е. определяют проявление типичных черт опухолевой клетки.
Выполняя цитопротекторную функцию, молекулярные шапероны ингибируют апоптоз и способствуют прохождению клеточного цикла. В то же время, существуют наблюдения, демонстрирующие активацию апоптоза при повышенном уровне шаперонов [Ran et al., 2004]. Видимо, необходимо рассматривать шапероны не только как молекулы системы сборки и поддержания пространственной структуры сигнальных молекул, но и как собственно сигнальные молекулы. Ниже подробно рассмотрена роль HSP в ключевых этапах клеточной смерти. Для удобства изложение разбито на главы в соответствии с локализацией процесса. Отдельно рассмотрены реакции, проходящие на мембранах, в цитоплазме, митохондрии, ядре и эндоплазматическом ретикулуме. В связи с тем, что предметом данного исследования является белок, участвующий в ERAD, наибольший акцент сделан на описании данного процесса.
Связывание TNF с Fas (Аро-1/С095)-рецептором приводит к формированию двух подмембранных белковых комплексов. Первый состоит из белков (например, R1P -receptor interacting protein), активирующих транскрипционный фактор NF-кВ (nuclear factor - кВ) и способствующий выживанию клетки. Второй комплекс ответственен за активацию апоптоза, т.к. содержит каспазу-8. Известно, что при активации NF-KB каспаза-8 инактивируется белком FLIP. Недавно было показано, что одним из субстратов каспазы-8 является белок Bid, принадлежащий семейству Вс1-2. После расщепления N- конец белка Bid переносится к митохондрии и участвует в освобождении Cyt с. События, приводящие к активации одного комплекса и ингибированию второго, до сих пор полностью не выяснены, но известно, что шапероны играют в этом выборе немаловажную роль [Ran et al., 2004].
HSP70 ингибирует клеточную смерть, индуцированную TNF. Однако эта способность пропадает в мышиных эмбриональных фибробластах Bidv" [Gabai et al., 2002]. Таким образом, HSP70 участвует в подавление клеточной смерти только в Bid+/+ клетках. Более того, HSP70 защищает от TNF-зависимого апоптоза и гематопоэтические клетки. При обработке TNF в этих клетках активируется проапоптотическая киназа, зависящая от присутствия двухцепочечной РНК (PKR - double-stranded RNA-dependent protein kinase). Недавно показано, что белок FANCC (Fanconi anemia complementation group С gene product) является ингибитором PKR [Zhang et al., 2004]. HSP70 в комплексе с HSP40 взаимодействуете FANCC и ингибирует апоптоз.
Белки класса HSP90 также играют значительную роль в TNF-зависимом апоптозе. HSP90 взаимодействует с RIP, тем самым стабилизируя его конформацию. В отсутствие HSP90 RIP быстро разрушается, и NF-кВ не привлекается к подмембранному комплексу, что приводит к гибели клеток [Lewis et al., 2000]. Известен и другой сценарий участия HSP90 в активации NF-кВ. Было показано, что комплекс IKK (inhibitor of кВ (ІкВ) kinase), состоит не только из известных трех субъединиц - IKKa, р и у, - но и из HSP90, и кошаперона cdc37. Ингибитор HSP90, гелданамицин, разрушает комплекс IKK и, соответственно, фосфорилирования и деградации ингибитора NF-кВ - ІкВ не происходит. Известно, что TNF индуцирует в некоторых клеточных линиях некроз. Видимо, HSP90 контролирует переключение между некрозом и апоптозом, поскольку ингибирование HSP90 гелданамицином в клетках линии фибросаркомы приводит к TNFR-1 индуцированному апоптозу, а не к некрозу.
HSP27 также повышает резистентность к TNF-индуцироваішой клеточной смерти. После активации лигандом Fas-рецептор взаимодействует с адапторным белком Daxx, который, в свою очередь, активирует кипазу JNK (c-Jun Nerminal kinase) и апоптоз. Фосфорилированпая форма HSP27 связывается с JNK и ингибирует апоптоз [Charette et al., 2000].
Косвенные данные указывают на участие шаперонов в аноикисе, клеточной смерти в результате потери контактов с матриксом. Фосфорилированпая форма HSP27 необходима для стабилизации комплекса интегриновых рецепторов с HSP70 и HSP90 [Polanowska-Grabowska et al., 2000]. Показано, что повышенная экспрессия HSP27 ингибирует метастатический потенциал клеток меланомы [Aldrian et al., 2002].
В цитозолс важнейшими элементами проведения сигнала, которые модулируют апоптотический и пролиферационный ответ клетки, являются фосфоинозитолкиназа PI3-К (phosphatidylinositol З-kinase), относящаяся к семейству киназ МАРК (mitogen activated protein kinase) митоген-активируемая киназа ERKI/2 (extracellular signal-regulated kinase), стресс-активируемые киназы SAPK/JNK (stress activated protein kinase/c-jun terminal kinase) и HOG-1 (high osmolarity glycerol) [Davis, 1994]. Важную роль играют также опухолевые суппрессоры (р53, pRb) и онкогены (v-src, ras и c-myc) [Davis, 1994].
При активации митогенного пути различными ростовыми факторами происходит активация пролиферации и параллельная отмена аноптоза в результате индукции сигнального пути с участием PI3-K. При стимуляции рецептора PI3-K активируется и фосфорилирует инозитол, который, в свою очередь, привлекает к плазматической мембране киназу Akt. После фосфорилирования киназой PKD1 киназа Akt становится полностью активной и ингибирует апоптоз в результате взаимодействия с Bad, IKK, каспазой-9 [Downward, 1998].
Недавно показано, что HSP90 взаимодействует с Akt и тем самым поддерживает функционирование киназы. При ингибировании HSP90 гелданамицином в клетках НЕК293Т Akt дефосфорилировхіась, и апоптоз активировался. Более того, стабильность комплекса Akt - HSP90 поддерживается другим шапероиом - Cdc37. Такой комплекс является устойчивым к протеосомалыюй деградации [Zhang et al., 2004].
HSP70 связывается с С-участком нефосфорилированных РКС (protein kinase С) и Akt и тем самым индуцирует повторное фосфорилирование киназ. HSP27 также активирует Akt, хотя механизм такой активации пока не известен.
Шаперопы эндоплазматического ретикулума
Созревание белков в ЭПР происходит под строжайшим контролем комплекса резидентных белков ЭПР, таких как пептидил-пролил-изомераза (peptidyl-prolyl isomerase - PPI), дисульфид-изомераза (protein disulphide isomerase - PDI), лектины (калнексин, калретикулин и EDEM (ER Degradation Enhancing a-Mannose-like protein)), а также HSP40 (ERdjl-5), HSP70 (BiP), HSP90 (GRP94) [Fewell et al., 2001]. Цепь событий, приводящая к ретранслокации белков, окончательно не изучена, но, видимо, для агрегированных друг с другом молекул белков и аномально гликозилированных белков существуют разные пути ретранслокации. Так, негликозилированные белки предпочтительнее взаимодействуют с BiP [Molinari et al., 2000], а гликозилированные - с калнексином и EDEM [Oda et al., 2003].
После опознания системой «контроля качества» белков с нарушенной конформацисй запускается система ретранслокации [Plemper et al., 1997]. Интересно, что транслокон используется как для импорта белков, так и для их экспорта. Экспрессия белков транслокона индуцируется, в первую очередь, в ходе UPR [Friedlander et al., 2000]. По-видимому, BiP является проводником белков к транслокону [Haigh et al., 2002]. Пока не ясно, каким образом транслокон различает недавно импортированную молекулу от белка, который необходимо экспортировать, т.к. в обоих случаях конформация белка нестабильна. Наиболее вероятно, что движущей силой ретранслокации являются три процесса: связывание субстрата с молекулярными шаперонами в люмене ЭПР, полиубиквитинирование и протеосомальная деградация, происходящие в цитоплазме [Fewelletal.,2001].
Ковалентное присоединение убиквитина происходит при помощи трех последовательных реакций, осуществляемых следующими ферментами: El (ubiquitin-activating), Е2 (ubiquitin-conjugating) и ЕЗ (ubiquitin-Iigating). На первом этапе в ЛТФзависимоГі реакции убиквитин присоединяется к Е1, затем переносится на Е2, в свою очередь, ЕЗ переносит убиквитин с Е2 на субстрат [Hershko et al., 1998]. После убиквитинирования протеосома узнает субстрат, и он разрушается. В настоящее время наиболее подробно связь убиквитинирования и процесса ERAD изучена на Saccharomyces cerevisiae [Gardner et al., 2000]. На мембране ЭПР обнаружены белки Hrdlp/Der3p, выполняющий функцию ЕЗ-фермента и Ubc6p, выполняющий функцию Е2-фермента. Интересно, что Hrdlp/Der3p активируется не Ubc6p, а цитоплазматическим Ubc7p. Видимо, существует еще не обнаруженный ЕЗ-фермент или белок, координирующий иЬсбр и Hrdlp/Der3p. В клетках млекопитающих также обнаружены ферменты Е2 -MmUBC6 и MmUBC7, трансмембранный и цитоплазматический. При этом функции Hrdlp/Der3p у млекопитающих, видимо, выполняет gp78 [Fang et al., 2001]. gp78 изначально идентифицирован как мембранный гликопротеин, участвующий в клеточной миграции [Nabi et al., 1987], - tumor autocrine motility factor (AMF), - а затем как фактор, способствующий не только миграции опухолевых клеток [Nabi et al., 1991], но и ангиогенезу [Funasaka et al., 2001]. Более того, повышение экспрессии gp78 коррелирует с метастатическим фенотипом опухолевых клеток. Необходимо отметить, что ЕЗ-лигазная активность найдена и у такого известного опухолевого суппрсссора, как BRCAl [Lorick et al., 1999].
Функционирование основных классов шаперонов невозможно без кошаперонов -белков с небольшой молекулярной массой, которые определяют специфичность связывания шаперонов с субстратами, ЛТФазную активность шаперонов, а также интегрируют шапероны разных классов между собой. Интересно, что в последнее время обнаруживаются новые функции кошаперонов, или наоборот, белки с различными другими свойствами обнаруживают способности кошаперонов.
Наиболее известными кошаперонами являются BAG-1 (Bcl-2-associated athanogene protein), Hip (Hsc70 interacting protein), Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), CHIP (Cerminal Hsp90 interacting protein), p23 (23-kDa co-chaperone of Hsp90) и Hsp40 [Morimoto, 2002; Caplan, 1999] (CM. рис 3).
BAG-I является первым обнаруженным антиапоптотическим белком [Takayama et al., 1995]. N-домен кошаперона BAG-1 связывается с Bcl-2, тем самым способствуя выживанию клетки [Takayama et al., 1995]. В то же время, С-домеи индуцирует освобождение субстрата из комплекса с HSP70, активируя его АТФазную активность [Hohfeld, 1998]. Интересно, что кошаперон Hip конкурирует с BAG-1 за один и тот же сайт взаимодействия с HSP70, стабилизируя комплекс посредством ннгибирования ЛТФазной активности HSP70 [Hohfeld, 1998]. Позднее выявлено, что BAG-1 способен связываться не только с Вс1-2, но и с белком FADD (Fas-associated death domain protein) [Frisch, 1999], тем самым, ингибируя аноикис. В соответствии с антиапоптотической ролью BAG-1, его экспрессия повышена в большинстве метастазирующих опухолей [Cutress et al., 2002].
Функция кошаперона р23 - стабилизировать взаимодействие HSP90 с субстратом [Johnson et al., 1996]. Диссоциация комплекса p23/HSP90/PKR [Donze et al., 2001] или p23/HSP90/Bcr-Abl приводит клетку к апоптозу [Shiotsu et al., 2000]. Недавно обнаружено, что для активации металлопротеазы-2 (ММР2), которая способствует инвазии опухолевых клеток, необходим комплекс HSP90/HSP70/p23Alop [Eustace et al., 2004]. Hop является связующим звеном между HSP70 и HSP90 [Frydman et al., 1997].
CHIP так же, как эндоплазматический gp78, вовлечен в убиквитин-зависимую деградацию белков, что, видимо, способствует нигибированию взаимодействий HSP70/HSP90 со своими субстратами [Cardozo et al., 2003].
