Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний. Леплина, Ольга Юрьевна

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Леплина, Ольга Юрьевна. Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний. : диссертация ... доктора медицинских наук : 14.03.09 / Леплина Ольга Юрьевна; [Место защиты: ГУ "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН"].- Новосибирск, 2011.- 242 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность темы. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), играющими центральную роль в поддержании врожденного иммунитета. Благодаря высокой экспрессии MHC антигенов I и II класса, костимуляторных молекул (CD80, CD86) и продукции широкого спектра цитокинов и хемокинов ДК обладают способностью активировать наивные Т-клетки и индуцировать антигенспецифический иммунный ответ [Massard G. et al, 1996; Peters J. et al, 1996]. Наряду со способностью индуцировать активацию иммунокомпететных клеток, ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные/супрессорные свойства ДК обусловлены различными механизмами, в том числе способностью ДК экспрессировать коингибиторные молекулы и рецепторы (B7-H1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G), продуцировать иммуносупрессивные цитокины (IL-10, TGF-), [Reichardt W. et al, 2008; Fedoric B. et al, 2008] и индуцировать генерацию регуляторных Т-клеток (СD4⁺СD25⁺Т рег) [Suciu-Foca N. et al, 2005]. Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий [Wesa A. et al, 2008, Chauvin C. et al, 2008]. Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-, lymphotoxin-12, FasL, TRAIL), а также перфорина и/или гранзима [Wesa A. et al, 2008; . et al, 2007] и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться дендритными клетками Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск специфического иммунного ответа.

Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при многих заболеваниях [Duan X.Z. et al, 2005; Pinzon-Charry A. et al, 2005; . et al, 2004]. При этом снижение стимуляторной активности ДК рассматривается в качестве возможного механизма персистенции вирусной и бактериальной инфекции, а также ускользания опухоли от иммунного надзора [Della Bella S. еt al, 2006; Zhang Z. et al, 2006; Ulsenheimer A. et al, 2005; Chen L. et al, 2007], тогда как нарушение толерогенных свойств ДК при гестации чревато угрозой преждевременного прерывания беременности [. et al, 2008; . et al, 2003].

Способность ДК индуцировать антигенспецифический иммунный ответ и наличие цитотоксической активности сделали эти клетки привлекательными кандидатами для иммунотерапии опухолевых и инфекционных заболеваний. Действительно, исследования на животных [Akbar S.M. et al, 2004] и клинические испытания у человека [Steinman R.M. et al, 2001; K. et al. 2004, Chen L. et al, 2005] показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается положительным клиническим эффектом. С другой стороны, толерогенные ДК представляют интерес в плане лечения аутоиммунных заболеваний, патологии беременности и трансплантации органов и тканей [Lim D-S. et al, 2009].

Изучению ДК и их клинической апробации во многом способствовала разработка методов генерации ДК in vitro. При этом выяснилось, что условия культивирования существенно влияют на свойства генерируемых ДК [Hart D.N. et al, 1997; Bender A. et al, 1996]. Традиционно ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов - GM-CSF и IL-4 [Thurner B. et al, 1999]. Генерируемые таким образом незрелые миелоидные дендритные клетки (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой способностью активировать Т-клетки. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-, IL-1, LPS, CD40-лиганда или коктейля «дозревающих» стимулов ведет к созреванию ДК и повышению их способности стимулировать Т-клеточный ответ [Jonuleit H. et al, 2007]. Однако генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты.

Наряду с традиционным протоколом, Santini с соавт. продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интерфероном- [Paquette R. et al, 1998; Santini S. et al, 2000; Santini S. et al, 2003; Santini S. et al, 2009; Santini S. et al, 2005]. Интерферон- индуцированные ДК (ИФН-ДК) генерируются быстрее по времени, обладают высокой поглотительной активностью, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов и превосходят ИЛ4-ДК по миграционной активности, способности стимулировать CD8 Т-лимфоциты. Кроме того, ИФН-ДК индуцируют более сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Th1-стимулирующей способностью обладают умеренной Th2-стимулирующей активностью [Parlato S. et al, 2001; Santini S. et al, 2003; Carbonneil C. et al, 2004]. Учитывая также, что интерфероны способны усиливать цитотоксический потенциал ДК [Lu G. et al, 2002; Chauvin C. et al, 2008; Papewalis C. et al, 2008] и ИФН-ДК по некоторым данным могут обладать более выраженной цитотоксической активностью [. et al, 2007], применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным.

Однако до сих пор свойства этих клеток (включая спектр и уровень продуцируемых ДК цитокинов, экспрессию поверхностных молекул и способность активировать Th1 и Th2 ответ), особенно активированных ИФН-ДК, охарактеризованы недостаточно. Практически отсутствуют сравнительные данные о цитотоксической и толерогенной активности ИЛ4-ДК и ИФН-ДК. Неисследованным остается также вопрос, насколько эффективно могут генерироваться ИФН-ДК при патологии и отличаются ли ИФН-ДК пациентов по функциональной активности. Наконец, большой интерес представляет клиническая апробация ИФН-ДК в качестве адьювантной клеточной терапии, направленной на активацию специфического иммунного ответа у больных с опухолевыми и инфекционными заболеваниями.

В связи с вышеизложенным, была сформулирована цель работы:

на основании сравнительной характеристики ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, анализе свойств ИФН-ДК при физиологических и патологических состояниях, оценке возможности их регуляции in vitro и клинической апробации у больных с внутримозговыми опухолями и хроническими вирусными инфекциями обосновать возможность использования ИФН-ДК в лечении онкологических и инфекционных заболеваний. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

Провести сравнительную оценку поверхностных маркеров (стадиоспецифические, активационные, костимуляторные, коингибиторные, проапотогенные молекулы) в популяции ИФН-ДК и ИЛ4-ДК в группе здоровых доноров
Провести сравнительное исследование функциональной активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (продукция цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторная активность ДК, Th1- и Th2 – стимулирующая активность ДК), генерируемых у здоровых доноров.
Оценить цитотоксическую и цитостатическую активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против клеток опухолевых линий.
Исследовать способность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК к индукции регуляторных Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов.
Охарактеризовать поверхностные маркеры и функциональную активность ИФН-ДК у больных с онкологическими заболеваниями (злокачественные опухоли головного мозга, гемобластозы).
Исследовать фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных с хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких)
Исследовать in vitro влияние цитокинов и иммуноактивных факторов (интерлейкин-2, смесь провоспалительных цитокинов, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека) на аллостимуляторную активность и цитотоксический потенциал ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.
Изучить фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у женщин с физиологической гестацией и беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.
Оценить влияние гормона дегидроэпиандростерона сульфата на экспрессию поверхностных маркеров и функциональную активность ИФН-ДК доноров.
Оценить безопасность и эффективность иммунотерапии с использованием ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга.
Провести апробацию ИФН-ДК-вакцин у больных с хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В, герпесвирусная инфекция).

Научная новизна

Исследование свойств LPS-активированных интерфероном-a ДК в сравнении со стандартно генерируемыми ИЛ4-ДК показало, что популяция ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD14, СD11c/CD123 и TRAIL, и меньшим количеством CD83⁺ клеток. При этом ИФН-ДК отличаются более высокой продукцией IFN-, IL-2, IL-17, IL-1, IL-10, IL-5, G-CSF и MCP-1, более активно индуцируют генерацию CD3⁺IFN⁺ T-клеток и способны активировать CD3⁺IL4⁺ Т-клетки. Кроме того, ИФН-ДК проявляют более выраженную цитостатическую активность против TRAIL-чувствительных опухолевых клеток и более высокую цитотоксическую активность в культурах TRAIL-резистентных опухолевых клеток. Сравнение способности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК индуцировать регуляторные Т-клетки позволило получить новые данные о толерогенном/супрессорном потенциале анализируемых ДК. В частности, показано, что в отсутствие активации LPS интактные ИФН-ДК индуцируют не только генерацию СD4⁺FoxP3⁺, но также СD8⁺FoxP3⁺ и СD4⁺IL-10⁺- клеток, тогда как после активации LPS, ИФН-ДК теряют способность индуцировать генерацию СD4⁺FoxP3⁺- и обладают сходной с ИЛ4-ДК стимулирующей активностью в отношении СD8⁺FoxP3⁺ и СD4⁺IL-10⁺-клеток. В работе впервые исследована возможность генерации и свойства ИФН-ДК при различных онкологических и инфекционных заболеваниях. Продемонстрировано, что популяция ДК больных с онкопатологией (злокачественные внутримозговые опухоли, злокачественные лимфомы, множественная миелома) и хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких) отличается повышенным содержанием незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2/противовоспалительных цитокинов; снижением аллостимуляторной активности; уменьшением стимулирующей активности в отношении CD3⁺IFN⁺ T-клеток и/или усилением способности активировать CD3⁺IL4⁺ Т-клетки и угнетением цитотоксической противоопухолевой активности (у больных с онкопатологией). Причем выраженность указанных изменений существенно варьирует при различных нозологических формах патологических состояний. Впервые изучены свойства ИФН-ДК, генерируемых у женщин с физиологической и осложненной беременностью. Показано, что ИФН-ДК при физиологической беременности отличаются признаками незрелости, смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и доминированием Th2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против активированных NK-клеток. В то же время ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (с повышенным уровнем ДГЭАС) обладают более зрелым фенотипом ДК, сохранной аллостимуляторной активностью и способностью активировать Th1-ответ. При этом анализ влияния ДГЭАС на ИФН-ДК in vitro позволил получить новые данные о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/созревание ИФН-ДК, продукцию IFN- и TNF-, Th1-стимуляторную активность ДК и ингибирующем эффекте на способность ИФН-ДК индуцировать гибель CD56⁺CD16⁺ клеток. Впервые проведена клиническая апробация вакцин на основе ИФН-ДК и показана их безопасность и эффективность в индукции иммунного и клинического ответа у больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В и герпесвирусная инфекция)

Теоретическая и практическая значимость

Сравнение фенотипа клеток в популяциях LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК позволило выявить ряд особенностей, которые свидетельствуют о менее зрелом, «промежуточном» фенотипе ИФН-ДК и их более высоком цитотоксическом потенциале, ассоциированном с экспрессией молекулы TRAIL. В свою очередь, выявленные функциональные отличия ИФН-ДК, в частности, их более высокая цитокин-продуцирующая активность и способность к индукции CD3⁺IFN⁺ Т-клеток при сохранении умеренной Th2-стимуляторной активности, а также более высокая цитостатическая и цитотоксическая активность против опухолевых клеток при сходной способности к индукции регуляторных Т-клеток, указывают на более высокий потенциал ИФН-ДК в индукции/опосредовании иммунного ответа. Выявленные при онкологических и инфекционных заболеваниях фенотипические и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении дифференцировки/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета при данных патологических состояниях. При этом взаимосвязь нарушений ИФН-ДК со степенью злокачественности (у больных ЗОГМ) и угнетением антигенспецифического ответа (у больных ТБ) свидетельствует о патогенетической значимости дисфункций ДК при данных патологиях. Исследования свойств ИФН-ДК при физиологической и осложненной надпочечниковой гиперандрогенией беременности показало, что в условиях физиологической гестации ИФН-ДК приобретают толерогенные/супрессорные свойства, которые утрачиваются на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении. При этом способность ДГЭАС индуцировать in vitro созревание ДК и активировать их иммуностимулирующую активность свидетельствует о важной роли гормонов в регуляции ИФН-ДК, и в частности значении ДГЭАС в ослаблении толерогенных/супрессорных свойств ДК. Выявленные отличительные свойства ИФН-ДК обосновывают перспективы их использования в качестве ДК-вакцин для иммунотерапии. При этом установление принципиальной возможности генерации ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями, а также возможности коррекции дисфункций ИФН-ДК, в частности, усиление их аллостимуляторной активности и повышение цитотоксической активности in vitro c помощью различных медиаторов/соединений (интерлейкин-2, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека), является важной составляющей практической значимости работы. Значение работы в прикладном аспекте заключается также в разработке протокола иммунотерапии на основе ИФН-ДК и его клинической апробации у больных со злокачественными опухолями головного мозга и хроническими инфекциями (хроническим вирусным гепатитом В и герпесвирусной инфекцией). При этом полученные результаты о хорошей переносимости и отсутствии побочных эффектов/осложнений при проведении иммунотерапии на основе ИФН-ДК, а также данные об индукции специфического иммунного ответа, который сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями, прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности (соответственно, в 22 и 55%) при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции свидетельствуют о безопасности и терапевтическом потенциале ИФН-ДК-вакцин и обосновывают принципиальную возможность их использования в лечении онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

Активированные ИФН-ДК отличаются от ИЛ4-ДК менее зрелым фенотипом, повышенной экспрессией проапоптогенных молекул, а также более высоким уровнем продукции цитокинов (с преобладанием Th1/провоспалительных цитокинов), Th1- стимуляторной и цитотоксической активности.
При онкологических и инфекционных заболеваниях ИФН-ДК имеют признаки задержки дифференцировки/созревания и нарушения функциональной активности, наличие и выраженность которых существенно варьирует в зависимости от нозологической формы заболевания и может корригироваться in vitro рядом цитокинов или иммуноактивных факторов.
ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности.
Использование ДК-вакцин характеризуется хорошей переносимостью, является безопасным, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий, 2003 г, на 14-ой научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 2004 г, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет. Новосибирск, 2005 г, на 15-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г; на международном конгрессе «International conference Basic Science for Biotechnology and Medicine», Новосибирск 2006 г, на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» в Красноярске 2005 г, 2006 г; в Томске 2008 г; на 11 Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2007 г; на III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" Новосибирск 2007 г; на 2^nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100^th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Nrnberg 2008; на Объединенном иммунологическом форуме – Санкт-Петербург 2008 г, на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск 2010г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 64 печатных работы, в том числе 20 статей в центральной печати, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 255 страницах машинописного текста, включающего 49 таблиц, 17 рисунков, 3 схемы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 300 литературных источника, в том числе 287 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИКИ СО РАМН, руководитель – профессор Черных Е.Р. в рамках НИР 032: «Структурно-функциональная характеристика клеток иммунной системы и разработка клеточных биотехнологий иммунодиагностики и иммунотерапии инфекционно-воспалительных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний», НИР 037: «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток», грантов РФФИ №09-04-00525-а «Гормонально-опосредованная регуляция толерогенной активности дендритных клеток» и №07-04-00967 «Роль дегидроэпиандростерона сульфата в регуляции дифференцировки, созревания и функциональной активности дендритных клеток», гранта ФЦП госконтракт № 14.740.11.0007. - «Разработка технологии создания индивидуальных вакцин на базе инновационных подходов генерации дендритных клеток с использованием интерферона для лечения онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека».