Введение к работе
Актуальность
Лимфопролиферативные заболевания (ЛПЗ) являются одними из часто встречающихся опухолевых заболеваний кроветворной ткани у взрослых. В России неход-жкинские лимфомы составляют 2,55 % от всех злокачественных опухолей; стандартизованный показатель заболеваемости среди мужчин составил 8,2, а среди женщин — 7,2 на 100000 человек [Поддубная И.В. 2005]. Термин ЛПЗ объединяет группу достаточно разнородных по клиническим проявлениям, степени тяжести и прогнозу заболеваний лимфоидной ткани, при которых в результате опухолевой трансформации возникает блок на определенной стадии развития лимфоцитов. Способность лимфо-идных клеток к опухолевой трансформации практически на всем пути клеточной дифференцировки определяет многообразие лимфопролиферативных заболеваний. В настоящее время в соответствии с классификацией ВОЗ 2008г. насчитывается более 30 различных нозологических форм ЛПЗ [4th Edition WHO Classification... 2008]
Изучая особенности иммунологического фенотипа клеток, можно установить стадию дифференцировки, на уровне которой наступила онкогенная трансформация [Stetler-Stevenson М, et al. 2001]. Однако, для волосатоклеточного, пролимфоцитарно-го лейкозов пока не найден нормальный клеточный аналог [Chen YH, et al. 2006], a при ряде В- и Т- клеточных ЛПЗ может наблюдаться утрата типичных антигенов, появление активационных маркеров, либо коэкспрессия антигенов, несвойственных данной стадии дифференцировки лимфоцитов [Луговская С.А. и др. 2005].
Согласно рекомендациям ВОЗ диагноз ЛПЗ базируется на данных морфологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. При верификации диагноза обязательным является установление линейной принадлежности опухолевых клеток (Т или В) и степени их дифференцировки, что невозможно без проведения иммунофенотипического анализа лимфоцитов. В настоящее время установлены основные иммунофенотипические характеристики опухолевых клеток для различных вариантов ЛПЗ. Однако, многочисленные клинические наблюдения показывают, что не у всех больных иммунофенотип опухолевых лимфоцитов соответствует классическому варианту для данного заболевания [Morice W.G. et al. 2008]. Все это указывает на необходимость поиска дополнительных маркеров диагностики, в том числе и иммунофенотипических. Кроме того, учитывая высокую стоимость иммуно-фенотипических исследований и неодинаковую значимость различных антигенов для верификации диагноза ЛПЗ, назрела необходимость разработать оптимальную панель моноклональных антител (МАТ), которая будет наиболее информативна для проведения диагностики и дифференциальной диагностики ЛПЗ.
За последние годы в терапии ЛПЗ достигнуш значительные успехи благодаря использованию таких препаратов как Мабтера, Флюдарабин, Кэмпас. Полные ремиссии удается получить у многих больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), волосатокле-точным лейкозом (ВКЛ) и др. ЛПЗ. Вместе с тем, часть больных остаются резистентными к терапии, у многих рано или поздно развивается рецидив заболевания. Все это диктует необходимость исследования биологических особенностей опухолевых клеток с целью проведения максимально прицельной терапии для уничтожения опухолевого клона.
Цель настоящей работы - сопоставление иммунофенотипических характеристик лимфоцитов с морфологическими вариантами В-клеточного хронического лимфолейкоза и выявление дополнительных маркеров, необходимых для проведения дифференциальной диагностики хронического лимфолейкоза от других В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.
Задачами в соответствии с поставленной целью являются:
Стандартизировать метод определения плотности экспрессии поверхностных анти-геновлимфоцитов.
Установить особенности иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови в зависимости от морфологического варианта и клинической стадии В-клеточного хронического лимфолейкоза
Исследовать особенности экспрессии поверхностных клеточных маркеров CD20 и CD45 на В-лимфоцитах хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), волосаток-леточного лейкоза (ВКЛ), лимфомы из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ), лим-фомы маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) и реактивных лимфоцитозов оценить их информативность в дифференциальной диагностике.
Изучить экспрессию CD43 на В-лимфоцитах при В-ХЛЛ и В-ЛПЗ в сравнении с практически здоровыми лицами и группой больных с реактивными лим-фоцитозами.
На основании полученных данных разработать диагностическую панель мо-ноклональных антител и алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний.
Научная новизна
Определено значение оценки плотности экспрессии поверхностных антигенов CD20 и CD45 на В-лимфоцитах для проведения дифференциальной диагностики В-ХЛЛ от других В-клеточных ЛПЗ.
Показана диагностическая значимость экспрессии маркера CD43 на В-лимфоцитах в дифференциальной диагностике В-ЛПЗ и реактивных лимфоци-тозов.
Показана однородность иммунологического фенотипа опухолевых клеток при различных морфологических вариантах В-ХЛЛ
Иммунологический фенотип опухолевых клеток существенно не изменяется при разных стадиях В-ХЛЛ.
Практическая значимость
Разработаны условия стандартизации метсщишопределеншплсггаосшповфхнсстньк рецепторов по величине средней интенсивности флюоресценции (МИ -mean fluorescence intensity).
Разработана оптимальная панель моноклональных антител (МАТ) для проведения дифференциальной диагностики В-ЛПЗ, включающая: CD45/CD14; CD3/CD16+56; ОЖШСЩ CD5/CD10CD19; CD2QCD23; CD43/CD19; CD38/CD19; Anti-k/Anti-VCD19; FMC7/CD23/CD19. При подозрении на волосатоклеточный лейкш к панели необходимо добавлять: CD19/CD1 lc; CD20/CD25; CD22/CD103.
Предложен алгоритм дифференциальной диагностики В-ЛПЗ с учетом плотности экспрессии поверхностных ашигеноа
Предложена модифицированная методика пгюбоподготовки, позволяющая снизить неспецифическое связавшие меченых антител, при проведении иммунофенотапирования клеток костного мозга и периферической крови у больных с парапротеинемиями.
Положения, выносимые на защиту:
Величина средней интенсивности флуоресценции MFI может использоваться для оценки плотности поверхностных рецепторов при соблюдении стандартных условий.
Экспрессия CD 19, CD20, CD23 и CD45 не зависит от морфологического варианта В-клеточного хронического лимфолейкоза и не отличается достоверно у больных на разных стадиях В-ХЛЛ в соответствии с классификацией Binet. При переходе в стадию прогрессирования выявляется достоверное увеличение плотности экспрессии только CD20.
Для дифференциальной диагностики хронического лимфолейкоза, волосатокле-точного лейкоза, лимфомы из клеток мантийной зоны, лимфомы маргинальной зоны селезенки и реактивных лимфоцитозов может использоваться анализ плотности экспрессии CD20 и CD45. Данные маркеры имеют выраженные разнонаправленные изменения при реактивных лимфоцитозах и различных формах В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.
4 Оценка экспрессии CD43 может служить дополнительным критерием для дифференциальной диагностики лимфопролиферитивных заболеваний
Личный вклад соискателя
Автором проведены клинический анализ крови и иммунофенотипирование лейкоцитов всех пациентов описаных в работе. Соискатель самостоятельно осуществил всю необходимую статистическую обработку полученных данных. Внедрение в практику результатов исследования
Результаты работы используются при чтении лекций, проведении практических занятии на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «РМАПО Росздрава» (ректор Мошетова J1K, зав. кафедрой - профессор Долгов В.В.) Разработанный алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний применяется на практике при проведении иммугісфенотипирования на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «РМАПО Росздрава» Апробация работы
Материалы данной работы были представлены на научно-практических конференциях «Национальные дни лабораторной медицины России 2008» (Москва 2008r.);BD FACS User's Meeting- (Сєсгрорецк 2008); «Технологии и инновации в лабораторной медицине» (Москва 2009г.)
