Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние десятилетия значительно расширились представления о свойствах и закономерностях функционирования поли(мульти)потентных клеток-предшественников организма высших млекопитающих (Сухих Г.Т. и др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2005; Дыгай А.М. и др., 2009; Beltrami A.P. et al., 2012). Данные элементы (истинные СК) не завершают программу своей дифференцировки на протяжении всей жизни организма и являются самообновляющимися СК, назначение которых заключается в регенерации тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Gussoni E. et al., 1999). Ростовой потенциал и плюрипотентность взрослых стволовых клеток (СК) делают принципиально возможным их использование для замещения тканей путем трансплантации, либо создания искусственно воспроизведенных тканей (Чертков И.Л. и др., 1991; Дыгай А.М. и др., 2009; Чехонин В.П. и др., 2010; Williams A.R. et al., 2011). Однако применение клеток и тканей, особенно взятых от эмбрионов, в клинических условиях требует решения многих не только морально-этических и правовых, но, безусловно, и биологических проблем, и может рассматриваться лишь как направление с весьма отдаленными перспективами (Дыгай А.М. и др., 2010, 2011, 2012; Serakinci N. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005; Rsland G.V. et al., 2009; Torsvik A., et al., 2010).
В то же время существует альтернативная - фармакологическая стратегия клеточной терапии. При этом наиболее физиологичным и рациональным из неинвазивных подходов к решению задач регенеративной медицины является стимуляция функций эндогенных прогениторных клеток, основанная на принципе подражания деятельности естественных регуляторных систем их функционирования в организме (Годьдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай А.М. и др., 2007, 2009, 2010, 2011, 2012; Зюзьков и др., 2012).
Согласно современным представлениям, состояние пула прогениторных элементов in situ во многом определяется функциональной активностью клеточных элементов микроокружения тканей и продуктами их жизнедеятельности. Именно микроокружение определяет пролиферативный статус, миграцию, а также выбор той или иной программы дифференцировки родоначальных клеток (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай А.М. и др., 2009; Dombrowski C. et al., 2009).
Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой один из основных компонентов межклеточного матрикса. При этом важная роль в ее метаболизме принадлежит гиалуронидазе - ферменту, под действием которого происходит образование полимеров с различной молекулярной массой, способных оказывать разное влияние на многие биологические процессы и функциональную активность клеточных элементов (Noble P.W., 2002; Stern R., 2004). Причем установлено, что низко- и среднемолекулярные формы ГК стимулируют пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток, а ГК с высокой молекулярной массой, обладают противоположным действием. Кроме того, ГК in situ связывает предшественники посредством расположенных на них CD44 и RHAMM – рецепторов, а также входит в состав гликокаликса клеток, в том числе прогениторных, и их рецепторов к биологически активным веществам (Cichy J. et al., 2004; Avigdor A. et al., 2004; Schade U.M. et al., 2006).
Учитывая указанные обстоятельства, весьма перспективным представляется создание подхода управления регенераторным потенциалом тканей за счет модификации свойств ГК с помощью гиалуронидазы. Однако значительное содержание ингибиторов данного фермента в сыворотке и тканях организма предопределяет его быструю инактивацию и делает практически невозможным получение выраженных системных (резорбтивных) фармакологических эффектов (Максименко А. В. и др., 2001; Wolf R.A. et al., 1984; Afify A.M. et al., 1993).
В то же время существует нанотехнология электронно-лучевого синтеза, позволяющая получать конъюгаты биологически активных веществ белковой природы с низкомолекулярными носителями. При этом создаваемые соединения оказываются в значительной степени защищенными от факторов деградации (Дыгай А.М. и др., 2009, 2010, 2011, 2012).
Исходя из вышеизложенного весьма актуальным представляется изучение возможности стимуляции процессов восстановления поврежденных тканей путем активации эндогенных прогениторных клеток за счет модификации свойств межклеточного матрикса, направленное на разработку новых средств для регенеративной медицины.
Цель исследования: Вскрыть механизмы модуляции функций прогениторных клеток под влиянием гиалуронидазы и определить возможность управления регенераторным потенциалом кроветворной ткани с помощью пегилированного фермента.
Задачи исследования:
Изучить состояние костномозгового и циркулирующего пулов мезенхимальных и кроветворных предшественников при введении различных доз нативной гиалуронидазы.
Исследовать влияние гиалуронидазы на мобилизацию прогениторных клеток в периферическую кровь, индуцируемую гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ).
Выявить изменения связывающей способности элементов микроокружения костного мозга в отношении родоначальных клеток, а также адгезирующих свойств клеток-предшественников под действием гиалуронидазы.
На модели цитостатической миелосупрессии определить терапевтическую активность донорских прогениторных клеток, подвергшихся воздействию фермента, при их трансплантации.
Изучить специфическую активность пегилированной гиалуронидазы в отношении прогениторных клеток различных классов при ее парентеральном и пероральном введении.
Исследовать гемопоэзстимулирующие эффекты пегилированной гиалуронидазы (Пэг-ГД) и вскрыть механизмы их развития.
Научная новизна. Впервые показана важная роль ГК в регуляции функций прогениторных клеток и выявлена возможность управления их пролиферативно-дифференцировочным потенциалом с помощью гиалуронидазы. При этом обнаружена зависимость эффектов от дозы вводимого in vivo фермента. Относительно низкие дозы ГД приводят к повышению функциональной активности мезенхимальных и кроветворных предшественников костного мозга, а также к стимуляции их выхода в кровь, индуцируемого Г-КСФ. Потенцирование мобилизующей прогениторные клетки активности Г-КСФ наблюдается, несмотря на возрастание адгезивных свойств клеток-предшественников, и связано с воздействием фермента на элементы микроокружения гемопоэтической ткани. В условиях моделирования цитостатической миелосупрессии показано повышение способности СК, подвергшихся воздействию ГД, к реализации ростового потенциала. Выявлено увеличение терапевтической активности трансплантата, представляющего собой мононуклеары периферической крови, содержащие мобилизованные Г-КСФ стволовые клетки, при дополнительном введении донорам гиалуронидазы. При этом обнаружена важная роль ускоренного структурно-функционального восстановления гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) в стимуляции регенерации кроветворной ткани. Впервые продемонстрировано возрастание специфической активности фермента в отношении прогениторных клеток после его пегилирования с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза. Выявлены выраженные гемопоэзстимулирующие эффекты Пэг-ГД при ее пероральном введении, связанные с увеличением функциональной активности кроветворных предшественников на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам и увеличения фидерных свойств стромальных элементов ГИМ.
Практическая значимость. Продемонстрирована принципиальная возможность и высокая эффективность управления регенераторным потенциалом СК с помощью гиалуронидазы. Предложен оригинальный подход получения трансплантационного материала, представляющего собой мононуклеары периферической крови, максимально обогащенные регенераторно-компетентными клетками. Разработан способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток и способ стимуляции миелопоэза. Показана перспективность создания средства для регенеративной медицины на основе пегилированной с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы (разработанной ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент» (г. Новосибирск)).
Полученные результаты вносят существенный вклад в развитие фармакологической стратегии регенеративной медицины и могут использоваться в экспериментальной биологии и медицине с целью разработки медицинских клеточных технологий, методов лечения дегенеративных заболеваний и для изучения биологии стволовых клеток.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Российской научной конференции, посвященной 25-летию НИИ фармакологии СО РАМН «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2009 г.); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010); V, VI и VII Региональных конференциях молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2010, 2011, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ; получено 2 патента на изобретения: патент (RU) № 2439147 «Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток» (опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1) и патент (RU) на изобретение № 2442589 «Способ стимуляции миелопоэза» (опубл. 20.02.2012, Бюл. № 5).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 20 таблицами. Библиографический указатель включает 402 источника, из них 79 отечественных и 323 иностранных.
