Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные представления о патогенезе фиброза лёгкого и механизмах регенерации альвеолярного эпителия 13
1.2. Гиалуроновая кислота и гиалуронидаза при пневмофиброзе 32
1.3. Пегилирование фармакологически активных молекул как направление создания эффективных лекарственных препаратов 45
1.4. Эффекты и механизмы действия спиперона 56
1.5. Заключение 59
Глава 2. Материалы и методы исследования 62
2.1. Материалы исследования 62
2.2. Реагенты 64
2.3. Экспериментальная модель 64
2.4. Введение препаратов 65
2.5. Дизайн исследования 66
2.6. Методы исследования 67
Глава 3. Результаты собственных наблюдений 79
3.1. Гистологическое исследование легких 79
3.1.1. Однократное и курсовое введение блеомицина 79
3.1.2. Влияние пегилированной гиалуронидазы на пневмофиброз 83
3.1.3. Влияние спиперона на развитие пневмофиброза 89
3.1.4. Влияние последовательного введения пегилированной гиалуронидазы и спиперона на развитие пневмофиброза 93
3.2. Иммунофенотипическое исследование мононуклеаров костного мозга, крови и легких 95
3.2.1. Влияние пегилированной гиалуронидазы и спиперона на клетки гемопоэза 95
3.2.2. Влияние пегилированной гиалуронидазы и спиперона на клетки мезенхимопоэза 101
3.3. Влияние пегилированной гиалуронидазы и спиперона на клональную активность мононуклеаров костного мозга, крови и легких при пневмофиброзе 105
3.3.1. Недифференцированные гемопоэтические колониеобразующие единицы (КОЕ-Н) 105
3.3.2. Смешанные (гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные) колониеобразующие единицы (КОЕ-ГЭММ) 107
3.3.3. Гранулоцитарные колониеобразующие единицы (КОЕ-Г) 109
3.3.4. Фибробластные колониеобразующие единицы при частично обратимом пневмофиброзе 110
3.4. Изучение влияния спиперона на длительные культуры мононуклеаров легких при частично обратимом пневмофиброзе 112
3.5. Исследование влияния спиперона на дифференцировку легочных МСК в клетки стромальных линий при частично обратимом пневмофиброзе 115
Заключение 119
Выводы 133
Список сокращений 135
Список литературы 137
- Гиалуроновая кислота и гиалуронидаза при пневмофиброзе
- Пегилирование фармакологически активных молекул как направление создания эффективных лекарственных препаратов
- Однократное и курсовое введение блеомицина
- Влияние пегилированной гиалуронидазы и спиперона на клональную активность мононуклеаров костного мозга, крови и легких при пневмофиброзе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Идиопатический фиброз лёгкого (ИФЛ) является наиболее распространённой и преимущественно смертельной формой идиопатической интерстициальной пневмонии. Болезнь возникает преимущественно в среднем или старшем возрасте и проявляется в рубцевании здоровой ткани лёгкого, что затрудняет дыхание больных. Больные после постановки диагноза живут не более 3-5 лет [Olson A. L., Swigris J. J., 2012]. В настоящее время в США 128000 американцев больны ИФЛ. Каждый год диагностируется 48000 новых случаев и 40000 больных ежегодно умирают от этой болезни. Эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации имеет схожий тренд [Фещенко Ю.И., 2005]. Этиология этого хронического и быстро прогрессирующего заболевания недостаточно полно изучена, хотя такие факторы риска как курение и воздействия окружающей среды описаны [Kelly B.G. et al., 2002; Denham J.W., Hauer-Jensen M., 2002]. За последние 10 лет были достигнуты существенные успехи в понимании патогенеза ИФЛ. На данный момент акцент с преимущественно провоспалительной компоненты заболевания сместился в сторону фибробластического процесса, нефизиологического ремодулирования тканей, чрезмерного накопления белков внеклеточного матрикса (коллагена) и ангиогенеза [Loomis-King Н. et al., 2013].
На протяжении последних трёх десятилетий в эксперименте на различных моделях пневмо фиброза были описаны противовоспалительные и антифибротические свойства более 240 соединений [Moeller Antje, et al., 2006; Amber L. D., William E. L., 2011]. Между тем, подавляющее большинство соединений изучены в профилактическом режиме введения и только 5% из них испытаны в условиях развёрнутой фазы болезни. Уверенности в том, что прошедшие жёсткий отбор доклинических исследований соединения успешно пройдут клинические испытания, нет. В настоящее время только один терапевтический агент - пирфенидон, был одобрен для лечения идиопатического фиброза: Япония в 2010 г., Европа в 2011 г., Китай в 2011 г. В клинических испытаниях у пациентов, принимавших внутрь пирфенидон, было отмечено значительное увеличение жизненной ёмкости легких по сравнению с теми, кто не принимал препарат [Gomer R.H., 2013; Okuda R., et al, 2013]. Прогрессирование болезни замедлялось, но не останавливалось. На изолированных человеческих мононуклеарных клетках периферической крови было показано, что пирфенидон сокращает выработку фиброгенных медиаторов (TGF-P) и воспалительных медиаторов (TNF-a, IL-ip) [Albera С, et al, 2013]. Примечательно, что FDA (Food and Drag Administration, США) отказалось одобрить использование пирфенидона. Это связано, во-первых, с незаконченностью клинических исследований, во-вторых, с развитием побочных эффектов при его назначении. Пирфенидон при приёме внутрь вызывает желудочно-кишечные расстройства, фоточувствительность, сыпь,
зуд, сухость кожи, печёночные дисфункции, головокружение, усталость, потерю веса [Cano-Jimenez Е., 2012; Cottin V., 2013]. Перспективный, на первый взгляд, пирфенидон в клиническую фазу исследований не проявил ожидаемую антифибротическую активность на этапе развёрнутой стадии болезни, кроме этого, препарат используется в высоких дозах и ограничен в применении при сопутствующей терапии.
Полученные за последние 3 года в ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (г. Томск) данные экспериментальных исследований кардинально изменили существующую парадигму клеточной терапии стволовыми клетками (СК) дегенеративных заболеваний [Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., 2012; Дыгай A.M. и др., 2013]. Отказавшись от малоэффективного использования эмбриональных плюрипотентных стволовых клеток (с большой вероятностью спонтанной трансформации и индукции злокачественных опухолей) и взрослых донорских мезенхимальных стволовых клеток (с паракринным / иммуномодулирующим эффектом), была обоснована необходимость модуляции эндогенных СК и тканеспецифичных прогениторных клеток в лечении больных ИФЛ [Дыгай A.M. и др., 2011; Скурихин Е.Г. и др., 2012; Скурихин Е.Г. и др., 2013]. Доказательством состоятельности предложенной концепции терапии выступают восстановление целостности альвеолярного эпителия, снижение активности воспаления (в том числе продукции про-воспалительных сигнальных молекул), и / или нарушения фиброгенеза при избирательном воздействии лекарственных средств на костномозговые и регионарные СК и прогениторные клетки-мишени гемопоэтического и мезенхимального происхождения [Дыгай A.M. и др., 2011; Дыгай A.M. и др., 2013; Скурихин Е.Г. и др., 2013]. В качестве потенциального антифибротического средства предлагаются соединения, ремодулирующие легочной матрикс гиалуронана (в частности, гиалуронидаза) [Дыгай A.M. и др., 2012]. Однако период полувыведения из ткани гиалуронидазы не превышает 3-5 минут, что существенно уменьшает продолжительность терапевтического эффекта [Girish K.S., Kemparaju К., 2007; Edith S. A. Hofinger et al, 2007].
На сегодняшний день модификация молекул химическим или физическим пегилированием активно развивающееся направление фармакологии. Присоединение белков к полиэтиленгликолю практически не влияет на фармакологическую активность базовой для конъюгата молекулы, но улучшает её фармакинетические свойства: удлиняется период полураспада, замедляется выведение, отсутствуют пики плазменной / тканевой концентрации, понижаются токсичность, иммуногенность и аллергенность [Piedmonte D.M., Treuheit M.J., 2008; Jain N.K., Nahar Manoj, 2010]. Преимущества пегилированных лекарственных препаратов пептидной структуры, созданных с помощью ионизирующего излучения (ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г. Новосибирск), над нативными аналогами продемонстрированы на модели цитостатической миелосупрессии [Дыгай A.M. и др., 2010].
Тяжесть ИФЛ у пациентов различна. Если для одних больных необходима монотерапия, то для больных с агрессивным течением фиброза этого не достаточно. Вполне закономерно, что эффективная стратегия лечения больных с ИФЛ на современном этапе должна быть ориентирована на более чем один профиброзный путь патогенеза. Исходя из этого, нами видится перспективной тактика "комплексной" терапии, основанная на использовании соединений, ремодулирующих матрикс гиалуронана и способных изменять активность СК. Снижение интенсивности воспаления и фиброгенеза модуляцией прогениторных / стволовых клеток нейротропными средствами была продемонстрирована на блеомициновой модели пневмофиброза A. Fabre с коллегами (2008), A.M. Дыгаем (2012) и Е.Г. Скурихиным с коллегами (2011, 2012, 2013).
Принимая во внимание вышеизложенное, является актуальным изучение противовоспалительной и антифибротической активностей пегилированной на полиэтиленоксиде электронно-лучевым синтезом гиалуронидазы, а так же механизмов её действия, связанных с прогениторными / стволовыми клетками гемо- и мезенхимопоэза в условиях токсического пневмофиброза. Исследование представляет интерес и с той точки зрения, что позволит получить патогенетическое обоснование целесообразности коррекции фиброза лёгких назначаемыми совместно спипероном и пегилированной гиалуронидазой.
Степень разработанности. Согласно данным Всемирной организации
здравоохранения лекарственных препаратов для лечения ИФЛ нет.
Существующий набор лечебных мероприятий для лёгочного фиброза
ограничен и не эффективен. Клиническая практика использования
глюкокортикоидов, циклофосфамида, иммунодепрессантов,
антикоагулянтов, комплексной терапии
(антиоксидантами/иммунодепрессантами, антифиброзными
соединениями/противовоспалительными соединениями/антиоксидантами, антагонистами рецепторов эндотелина и сосудорасширяющими средствами), направлена на лечение осложнений и является поддерживающей терапией. Разработанные в эксперименте подходы для лечения ИФЛ (использование иммунорегуляторных цитокинов, ограничивающих пролиферацию фибробластов и синтез коллагена, стимуляция ангиогенеза и ингибиция синтеза коллагена, лечение донорскими мезенхимальными стволовыми клетками, трансплантация лёгких) в клинической практике не оправдывают ожиданий.
Таким образом, существует высокая потребность в создании новых эффективных лекарственных средств для лечения ИФЛ в связи с отсутствием таковых.
Цель исследования. Изучить антифибротическую активность и механизмы действия пегилированной на полиэтиленоксиде гиалуронидазы при пневмофиброзе. Дать патогенетическую оценку целесообразности
совместного назначения пегилированной гиалуронидазы и спиперона в коррекции фиброзного заболевания лёгких. Задачи исследования:
1. На модели блеомицин-индуцированного пневмофиброза изучить
противовоспалительные и антифибротические эффекты пегилированной
гиалуронидазы при различных режимах (профилактический,
терапевтический) и способах введения (внутривенное, внутрижелудочное,
интраназальное).
2. Оценить действие пегилированной гиалуронидазы на костномозговые
и регионарные стволовые и прогениторные клетки гемо- и мезенхимопоэза
при фиброзе лёгких.
3. В условиях интратрахеального введения блеомицина изучить
возможность коррекции спипероном воспалительной реакции и фиброгенеза
в лёгких, а так же механизмы его действия.
-
Исследовать противовоспалительную и антифибротическую активности пегилированной гиалуронидазы на фоне введения спиперона.
-
Оценить состояние мезенхимальных и гемопоэтических прогениторных / стволовых клеток в условиях коррекции пегилированной гиалуронидазой и спипероном блеомицин-индуцированного воспаления и фиброгенеза в лёгких.
Научная новизна работы. В работе на модели токсического
пневмофиброза, вызванного назначением блеомицина, выявлена
антифибротическая активность 8 ЕД пегилированной гиалуронидазы (пегГД), вводимой мышам линии C57BL/6 интраназально, а также механизмы её действия. Продемонстрирована возможность повышения спипероном специфической фармакологической активности пегГД в условиях частично обратимого и необратимого пневмофиброза.
Результаты скрининговых исследований позволили выявить, что в условиях однократного интратрахеального (ИТ) введения блеомицина (частично обратимый пневмофиброз) антифибротическая активность 8 ЕД пегГД проявляется в случае интраназального введения и оказывается выше, чем у 16 ЕД тестикулярной гиалуронидазы. Внутривенное и внутрижелудочное введение конъюгата не влияет на отложение фибротических масс в лёгких. Пегилированная гиалуронидаза при ИТ инстилляции блеомицина эффективна, как в случае назначения в воспалительную фазу пневмофиброза (профилактический режим), так и в фибротическую фазу развития болезни (терапевтический режим). Подтверждение высокой антифибротической активности терапевтического введения пегилированного фермента получено и в условиях многократно повторяющегося токсического повреждения лёгких (необратимый пневмофиброз).
Причиной снижения пегГД интенсивности отложения фибротических масс выступает системное уменьшение количества MCK (CD31~, CD34", CD45", CD44+, CD73+, CD90+, CD106+), прогениторных фибробластных
клеток (CD45 ) и пан-гемопоэтических клеток (CD45 ). Воспалительная фаза развития пневмофиброза характеризуется сокращением в лёгких ГСК (Sca-1 , c-Kit+, CD34", (CD3, CD45R (В220), Ly6C, Ly6G (Grl), CDllb (Масі), TER-119)-).
Выявлены основы противовоспалительной и антифибротической активности спиперона. В условиях частично обратимого пневмофиброза это связано с сокращением популяции прогениторных CD45+ -клеток в костном мозге и циркулирующей крови, падением их клональной активности (образование КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г), а так же со снижением клональной активности костномозговых, циркулирующих в крови и легочных прогениторных С045~-клеток (образование КОЕ-Ф) и интенсивности дифференцировки МСК лёгких в клетки стромальных линий.
Последовательное назначение пегГД и спиперона более эффективно в терапии экспериментального фиброза лёгких, чем их изолированное курсовое введение. Кроме значительной антифибротической активности (патологическое отложение коллагена в блеомициновых лёгких не регистрируется), снижается инфильтрация интерстиции альвеол и альвеолярных ходов клетками воспаления. В основе этих эффектов лежит существенное падение числа прогениторных С045~-клеток и МСК в костном мозге и уменьшение ими экспансии лёгких.
Теоретическое и практическое значение работы. На моделях блеомицин-индуцированного пневмофиброза продемонстрирована высокая антифибротическая активность интраназально вводимой пегилированной гиалуронидазы, представляющей собой иммобилизированную на полиэтиленоксиде тестикулярную гиалуронидазу с помощью оригинальной технологии электронно-лучевого синтеза (разработанной ЗАО "Сибирским Центром Фармакологии и Биотехнологии", г. Новосибирск совместно с ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН, г. Томск). Тот факт, что активность пегилированного фермента проявляется не только при профилактическом режиме введения, но и при назначении во время фибротической фазы развития болезни (терапевтический режим), позволяет рассматривать его как «истинный» противофибротический фактор и предложить включить в качестве компонента антифиброзной терапии лёгких в наиболее тяжёлую фазу развития болезни.
Представленные в настоящем исследовании данные об эффектах пегГД на фоне введения спиперона указывают на перспективность последовательного изменения структурно-пространственной организации матрикса гиалуронана фиброзированных лёгких и модуляции функциональной активности нервной системы в лечении хронических заболеваний лёгких, в том числе ИФЛ.
Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам, выбраны современные высокоинформативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН и созданы новые
методы исследования. В качестве объекта исследования изучались мыши-самцы линии C57BL/6 в возрасте 8-10 недель. В работе использовались гистологические методы для оценки интенсивности воспаления и определения относительной площади фиброзированной ткани в легких. Цитометрический анализ поверхностных маркеров позволил определить фенотип клеток. Культуральными методами оценивалась функциональная активность стволовых и прогениторных клеток различных классов и различного происхождения. Результаты исследования обработаны методами статистического анализа.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов исследования, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 5th International Conference on Drug Discovery & Therapy (Dubai, 2013), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012), первой всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва 2012), 6th Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell (October 12-14, 2013, Dalian, China), 1-м Национальном Конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013).
По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 9 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 статья в иностранном журнале. Получен патент на изобретение «Способ повышения эффективности терапии нарушений в легочной ткани при цитостатических воздействиях», № 2497523, опубликовано 10.11.2013, бюллетень № 13. Получена приоритетная справка от 08.08.2013 на патент «Способ изучения дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток легких при пневмофиброзе», per. № 2013137273.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком, 17 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 401 источников, из них 34 отечественных и 367 зарубежных.
Гиалуроновая кислота и гиалуронидаза при пневмофиброзе
Структура, продукция, локализация и функции гиалуроновой кислоты Гиалуроновая кислота (ГК) была обнаружена в 1934 году [Meyer K.P., John W., 1934], ее структура была определена гораздо позднее – в 1951 году [Rapport M.M. et al., 1951]. По современным представлениям, ГК состоит из линейной последовательности единиц дисахаридов, состоящих из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина (Рисунок 2) [Jiang D. et al., 2007]. Распространенной формой ГК является высокомолекулярная гиалуроновая кислота (ВМ-ГК), которая имеет молекулярную массу более 106 Da [Olczyk P. et al., 2008; Maharjan Anu S. et al., 2011]. ВМ-ГК демонстрирует структуру произвольного клубка (катушки), в водных растворах увеличивающегося в объеме. Водная ВМ-ГК имеет высокую вязкость и обладает эластичными свойствами, что способствует заполнению ею пространства [Scott J.E. et al.,2013].
Гиалуроновая кислота является наиболее распространенным несульфатированным гликозаминогликаном (ГАГ) в экстрацеллюлярном матриксе (ЭЦМ) лёгких. Содержание ГК в легких составляет 15-150 мг г-1 сухого веса, локализована в основном в перибронхиальных и межальвеолярных / периальвеолярных тканях [Petrigni G., Allegra L., 2006]. Количество ГК в секрете лёгких у человека варьирует в диапазоне от 34 до 423 нг мл-1 [Dentener M.A. et al., 2005]. В дыхательных путях ГК производится подслизистыми железами и поверхностными эпителиальными клетками дыхательных путей [Basbaum C.B., Finkbeiner W.E., 1988; Monzon M.E. et al., 2006]. Синтезируются ГК гиалуронан синтазами на плазматической мембране и высвобождается в качестве высокомолекулярного полимера во внеклеточное пространство [Itano N. et al. 2013]. Провоспалительные цитокины, включая TNF-, ИЛ-1 и ЛПС, индуцируют производство ГК in vitro эндотелиальными [Mohamadzadeh M. et al., 1998], дендритными [Bollyky P.L. et al., 2010] и фибробластными клетками [Wilkinson TS. et al., 2004]. Считается, что фибробласты являются основным типом клеток, которые высвобождают ГК [Luke H.J., Prehm P., 1999; Jacobson A. et al., 2000]. Фибробласты синтезируют все три изоформы ГК-синтаз и высвобождают ГК в ответ на повреждение, в том числе легочной ткани и / или стимуляцию выше приведенными воспалительными факторами [Wilkinson T.S. et al.,2004]. С другой стороны, фрагменты гиалуроновой кислоты могут стимулировать фибробласты к секреции цитокинов, что регулирует воспалительный ответ, а также способствует TGF--опосредованной пролиферации фибробластов [Meran S. et al., 2008]. Кроме этого, ГК способна модулировать TGF--зависимую дифференциацию миофибробластов [Webber J. et al., 2009]. ГК участвует в фундаментальных физиологических и патологических процессах, таких как эмбриональное развитие, миграция, адгезия, пролиферация и дифференцировка клеток [Heldin P., 2003; Spicer A.P. et al., 2004] иммунный контроль, воспаление [Termeer C. et al., 2003; George J., Stern R., 2004], заживление ран, фармакокинетика лекарственных средств, ангиогенез, злокачественная трансформация, водный гомеостаз и вязкоупругие свойства экстрацеллюлярного матрикса [Tool B.P., 2004]. Многие и различные биологические функции, проявляемые гиалуроновой кислотой, связывают с длиной цепи, молекулярной массой и условиями, при которых синтезируется молекула [Noble P.W., 2002; Tool B.P., 2004]. Гиалуроновая кислота вовлечена в различные функции легких при фиброзе, такие как: 1. Регулирование баланса интерстициальной жидкости благодаря своей высокой способности связывать молекулы воды [Allen S.J. et al., 1991]. 2. Регуляция адгезии [Kosaki R. et al., 1999], миграции [Ito T. et al., 2004], дифференцировки [Zoltan-Jones A. et al., 2003] и пролиферации клеток [Evanko S.P. et al., 2007]. 3. Регенерация. Достигается посредством регулирования ГК-синтазы-2 и гиалуронидазы-2 в ответ на медиаторы, высвобождаемые в процессе заживления после повреждения легких, что приводит к фибропролиферативному ответу [Li Y. et al.,2000; Jiang D. et al., 2005]. 4. Провоспалительная активность. После повреждения легких, фрагменты ГК накапливаются и стимулируют альвеолярные макрофаги к секреции хемокинов, привлекающие клетки воспаления [Noble P.W., Jiang D., 2004]. 5. ГК усиливает клеточный механизм защиты организма, стимулируя активность нейтрофилов крови, фагоцитоз и миграцию [Turino G.M., Cantor J.O., 2003]. 6. В легочных альвеолах ГК взаимодействует с поверхностными фосфолипидами, что способствует стабильности сурфактанта [Lu K.W. et al., 2005]. 7. Путем создания более вязкой среды, ГК может препятствовать движению клеток и молекул через внеклеточный матрикс, и, тем самым, снижает активность лейкоцитов и их провоспалительных продуктов [Cantor J.O., 2007]. 8. Фенотипические преобразования фибробластов в миофибробласты связаны с изменениями производства и метаболизма ГК. ГК модулирует TGF- 35 сигналинг вследствие взаимодействия с рецептором CD44 [Ito T. et al.,2004]. Так в эксперименте было показано, что угнетение синтеза ГК приводит к отмене TGF--опосредованному фенотипическому преобразованию миофибробластов. Это указывает на ключевую роль ГК в фибробластно-миофибробластном переходе [Meran S., Thomas D., 2007]. Обнаруженные при фиброзе легких -SMA-positive миофибробласты (Alpha-Smooth Muscle Actin) коррелируют с аномальным отложением экстрацеллюлярного матрикса и прогрессированием заболевания [Gabbiani G., 2003]. В тканях, эти миофибробласты появляются в результате активации и дифференцировки стромальных фибробластов, процесс, в котором TGF- непосредственно участвует. Стойкость миофибробластического фенотипа зависит от аутокринной генерации TGF- [Vaughan M.B. et al.,2000]. 9. ГК улучшает рост культуры человеческих мезенхимальных стволовых клеток и способствует хондрогенной дифференцировки человеческих мезенхимальных стволовых клеток [Kavalkovich K.W. et al.,2002]. CD44 и ГК помогают МСК перейти к области повреждения в целях содействия регенерации тканей [Poulsom R., 2007]. 10. ГК увеличивает объем и площадь поверхности для миграции клеток и клеточной активности, и способствует стимуляции рецептор-опосредованной клеточной пролиферации [Solis M.A. et al., 2012].
Повышение уровня ГК и продуктов ее разложения наблюдаются у животных при блеомицин-индуцированном фиброзе легких [Zhao H.W., Lu C.J., Yu R.J., Hou X.M., 1999; Dentener M.A., Vernooy J.H., Hendriks S., Wouters E.F., 2005]. После интратрахеального введения блеомицина производство ГК увеличивается в несколько раз, максимальный пик концентрации наступает с 7 по 10 день. Затем ГК выводится из интерстиция легких и это совпадает с накоплением коллагена. Продукты деградации ГК размером 10-500 кDa накапливаются в лёгких и могут стимулировать экспрессию генов макрофагов и других воспалительных клеток in vitro. Увеличение уровня ГК наблюдается в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и/или плазме больных фиброзом легких [Bensadoun E.S. et al., 1996], хронической обструктивной болезнью легких [Dentener M.A. et al., 2005], аллергическим альвеолитом [Soderberg M. et al., 1989], астмой [Zhu Z. et al., 2001], интерстициальными заболеваниями легких [Cantin A.M. et al.,1992], саркоидозом [Milman N. et al., 1995] и идиопатической легочной артериальной гипертензией [Papakonstantinou E. et al., 2008].
Уровни ГК были значительно выше в БАЛ у пациентов с ИФЛ, чем у здоровых людей, при ухудшении состояния пациенты имели более высокие концентрации ГК в лаважной жидкости, чем пациенты со стабильным течением болезни [Bjermer L. et al.,1989]. Клоны фибробластов, полученные из первичной культуры ткани лёгких пациентов с ИФЛ, секретировали гораздо большее количество гиалуроновой кислоты и протеогликана декарина, чем клоны фибробластов от здоровых людей [Westergrenhorsson G. et al., 2004]. Высокомолекулярные и низкомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты Высокомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты (ВМ-ГК) обнаруживаются преимущественно в здоровых легких [Teder P. et al., 2002]. В поврежденной ткани ВМ-ГК распадается на низкомолекулярные фрагменты ГК (НМ-ГК) массой от 0,8 до 8105 Da [Jiang D. et al., 2007]. Таким образом, соотношение ВМ-ГК / НМ-ГК нарушается. Для реализации биологических эффектов ВМ-ГК и НМ-ГК связываются с CD44, TLR2, TLR4, LYVE и RHAMM (CD168) рецепторами [Powell J.D., Horton M.R., 2005].
Пегилирование фармакологически активных молекул как направление создания эффективных лекарственных препаратов
Потенциальная ценность таких белков как антитела, цитокины, факторы роста, ферменты в качестве терапевтических средств проверена десятилетиями. Однако создание лекарственных средств на их основе затрудняют короткое время циркулирования, низкая стабильность и биодоступность, высокая иммуногенность и аллергический потенциал [Veronese F.M., Pasut G., 2005; Jokerst J.V. et al., 2011]. Одним из способов преодоления большинства из этих трудностей является присоединение цепей полиэтиленгликоля к поверхности белка. Опыт пегилирования лекарственных препаратов указывает на то, что клинические эффекты пегилированных биологически активных пептидов превосходят соответствующие свойства немодифицированных молекул. Потенциал пегилированных препаратов улучшается за счёт 1. повышения растворимости в воде, что особенно важно для препаратов с низкой растворимостью, 2. устойчивости к действию ферментов, полностью разрушающих или частично снижающих концентрацию в тканях препарата и нарушая, тем самым, поглощение системой мононуклеарных фагоцитов, 3. адресной доставки лекарственного препарата до мишени [Khandare J., Minko T., 2006; Knop K. et al., 2010]. Кроме этого, пегилирование, задерживая всасывание препарата, отменяет развитие многих серьезных побочных эффектов, вызванные острым пиком тканевой концентрации препарата, продлевает период его полувыведения [George S. et al., 2008; Hu J. et al., 2010; Tamai H. et al., 2011].
На настоящий момент ковалентное присоединение полиэтиленгликоля к интересующей фармакологически активной молекуле – пегилирование, стало устоявшейся формулой создания пролекарства с избирательной доставкой к клеткам-мишеням [Hinds K.D., 2005; Filpula D., Zhao H., 2008]. Полиэтиленгликоль является наиболее часто используемым неионным полимером для доставки лекарств на основе полимеров [Khandare J., Minko T., 2006; Knop K. et al., 2010]. Мономер ПЭГ и основная структура полимера представлены на Рисунке 5. Рисунок 5 - Мономер полиэтиленгликоля (1) и основная структура полимера (2), лекарственная форма на основе ПЭГ (3) [Jokerst J.V. et al., 2011]. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой синтетический полиэфир – исконный полимер, легкодоступный в широком диапазоне молекулярных масс. ПЭГ известный как полиоксиэтилен или полиэтиленоксид (ПЭО). Полимеры с молекулярной массой 100000 Да называют ПЭГ, более высокомолекулярные полимеры – ПЭО. Полимеры амфифильны: растворимы в воде и многих органических растворителях (метиленхлорид, этанол, толуол, ацетон, хлороформ). ПЭГ с низкой молекулярной массой ( 1,000 Да) являются вязкими и бесцветными жидкостями, ПЭГ с более высокой молекулярной массой представляют собой воскообразные твердые вещества белого цвета с температурой плавления, пропорциональной их молекулярной массе [Bailey F.E., Koleske J.V., 1976]. Растворимость ПЭГ в воде уменьшается с увеличением молекулярной массы [Chen J. et al., 2005]. Полиэтиленгликоль синтезируется анионной полимеризацией этиленоксида инициированной нуклеофильным нападением гидроксид-иона на эпоксидное кольцо. Самым полезным для модификации полипептидов является монометокси полиэтиленгликоль (мПЭГ).
Новые свойства пролекарств вытекают из гидрофильности и гибкости ПЭГ. Большинство полимеров содержат проксимальный конец, который крепится к поверхности нано частицы (R1), другая дистальная концевая группа (R2) взаимодействует с растворителем (Рисунок 5). Идеальная концевая группа R2 снижает абсорбцию неспецифического белка, увеличивает гидрофильность, предотвращает агрегацию нано частиц и облегчает связывание лиганда для целевых нано частиц. [Jokerst J.V. et al., 2011]. Модель пролекарства обычно состоит из нескольких компонентов: (I) полимер в качестве носителя; (II) препарат, пептид или белок в качестве биологически активного компонента; (III) молекулы разделителя. Впервые о пегилировании сообщили Davies и A. Abuchowski в 1970 г. Авторам удалось связать полиэтиленгликоль с бычьим сывороточным альбумином и каталазой печени посредством сопряжения с цианурхлоридом. Это положило начало ковалентному присоединению ПЭГ к пептидам и белкам, а так же важному этапу в фармакологии: придавать новые положительные свойства ферментам без изменения их специфической активности [Ringsdorf H., 1975; Abuchowski A. et al., 1977; Abuchowski A. et al., 1977]. С тех пор процедура пегилирования постоянно совершенствуется.
Успешное сопряжение ПЭГ с биомолекулами зависит от химической структуры, молекулярной массы, стерических препятствий, и реакционных способностей как биомолекул, так и полимера. Для того, чтобы синтезировать биоконьюгат с одной стоны ПЭГ должен обладать реактивными группами, такими как -COOH, -OH, -SH или -NH2 [Bentley M.D., Harris J.M.1999, Shashwat S. et al., 2012], с другой стороны, остатками лизина, цистеина и N-концевых остатков в структуре белка [Cai Y., Yue P., 2011]. Успешное сопряжение ПЭГ с биомолекулой зависит от химической структуры, молекулярной массы, стерических препятствий, и реакционной способности биомолекул, а также полимеров. Исследователями отмечается, что, несмотря на приведённые выше положительные свойства, ПЭГ имеет ограниченные возможности сопряжения с пептидом в силу обладания только одной концевой функциональной группой в конце полимерной цепи [Jevsevar S. et al., 2010; Shashwat S. B. et al., 2012].
Наиболее часто используемые стратегии сопряжения предусматривают использование таких связующих веществ как дициклогексилкарбодиимид, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид и N-гидроксисукцинимид. Химическое сопряжение препаратов или других биомолекул к полимерам и их модификации могут образовывать прочные эфирные, амидные и дисульфидные связи. Химическая связь должна быть стабильной, чтобы предотвратить высвобождение лекарственного средства во время его транспортировки. В то же время она не должна препятствовать взаимодействию лекарства с мишенью [Satchi-Fainaro R. et al.,2005].
Пегилирование разделяется на случайное (неселективное) и сайт-направленное. В случае неселективного пегилирования ПЭГ преимущественно присоединяется при помощи активированных сложных эфиров или карбонатов цепей ПЭГ к выставленной на поверхность первичной аминогруппе лизина (Таблица 3) [Kinstler O. et al., 2002]. Реакция проходит быстро и результатом ее являются сложные смеси конъюгатов. Конъюгаты различаются между собой по количеству и сайту приложения цепей ПЭГ к пептиду и белку. Взаимодействие ПЭГ с аминогруппами остатков лизина не специфично, в меньшей степени ПЭГ способны связываться с N-концевыми аминокислотными группами, остатками гистидина и даже с боковыми цепями серина, треонина, тирозина и цистеина. Первые пегилированные фармацевтические препараты Adagen (pegademase) и Oncaspar (пегилированная аспарагиназа, пегаспаргаза) представляли сложные смеси различных видов пегилированных конъюгатов [Jevsevar S. et al., 2010]. Pegvisomant (Somavert , Pfizer), одобренный в 2003 г. для лечения акромегалии, так же получают случайным пегилированием. Таблица 3 - Технологии пегилирования [Jevsevar S. et al., 2010] Место прикрепления ПЭГ реагент Технология применима для Препараты Случайное Пегилирование Преимуществен ПЭГ NHS-эфиры Все белки Adagen но ПЭГ NHS- карбонаты (Adenosine аминогруппы ПЭГ- deaminase) лизиновых паранитрофениловые Oncaspar остатков и N- карбонаты (Asparaginase) концевые ПЭГ-триазиновые PegIntron аминогруппы реагенты (Interferon-2b)Pegasys(Interferon-2a)Somavert(Human growthhormonemutein)Mircera(Erythropoietin) Сайт-специфическое пегилирование (химическое) N-концевая аминогруппа ПЭГ-альдегиды ивосстанавливающиеагенты Все белки Neulasta (G-CSF) SH-группы непарных остатков цистеина ПЭГ-малеимиды Пиридил дисульфиды Винилсульфоны Тиол реагенты Белки с поверхностными естественными или встроенными остатками цистеина Cimzia (AntiNF-Fab ) Неприродныеаминокислоты(азидо- иэтинильныепроизводныесерина) ПЭГ-этинильныереагентыПЭГ-азид реагенты Белки с не-природными аминокислотами -(необходимы генетические манипуляции организма-хозяина) Дисульфидные связи ПЭГ-моносульфоны Белки с поверхностными -S-S связями Сайт-специфическое пегилирование (ферментативное) Серин или треонин N-актил галактозамина и ПЭГ-производные сиаловой кислоты Негликозилированные белки с открытыми Ser или Thr остатками Глутаминовые остатки ПЭГ-алкиламины (транс-глутаминаза опосредованные) Белки с природными или встроенными остатками Gln в гибких регионах Одним из прогрессивных направлений в развитии технологии пегилирования выступает сайт-специфическое пегилирование (Таблица 3). Примеры известных успешных сайт-специфических реакций это N-концевое и цистеин-специфическое пегилирование. N-концевое пегилирование, выполняется как редуктивная стадия алкилирования с ПЭГ-альдегид реагентом и восстановителем (например, цианоборгидридом натрия) [Kinstler O. et al., 2002]. Подобная реакция была использована в разработке Neulasta [Molineux G., 2004]. Пегилирование тиольных групп – другой известный подход сайт-специфического пегилирования. Доступно большое разнообразие тиол-специфических реагентов, таких как малеимид, пиридилдисульфид, винилсульфон, тиол-реагенты и др. Благодаря стабильности образованных связей, малеимид-ПЭГ реагенты стали очень популярны. Разрабатываются подходы сайт-специфического пегилирования с использованием ферментов (Таблица 3). Так, трансглутаминазы способны катализировать реакцию сопряжения ПЭГ-алкиламин реагентов с остатками глутамина [Sato H., 2002; Fontana A., et al., 2008]. Реакция имеет высокую степень специфичности. В последнее десятилетие созданы стратегии ковалентного связывания ПЭГ с белками (Таблица 3). Как правило, монометиловый эфир ПЭГ (мПЭГ) используется для пегилирования после активации (обычно многоступенчатой) гидроксильной группы с помощью фрагментов реактивного белка. Потенциально интересным реагентом, который мог бы способствовать преодолению этих проблем является диэтиловый скварат (Рисунок 6). Диэтиловый скварат состоит из двух связанных сложных эфиров карбоновых кислот винилогического ряда, разделенных углерод-углеродной двойной связью. Ранее диэтиловый скварат использовался для амино-селективного, гидрокси-ортогонального присоединения углеводов [Shu-jie H. et al., 2008] и гликопептидов [Westerlind U. et al., 2008] к белкам. На настоящий момент известна одношаговая активация -амино-ПЭГ диэтиловым скваратом [Dingels C. et al., 2012].
Однократное и курсовое введение блеомицина
При однократной интратрахеальной инстилляции блеомицина в легких мышей отмечались изменения, характерные для идиопатического фиброза легкого (ИФЛ). В частности, у блеомицин-леченных животных аналогично больным ИФЛ присутствуют воспаление, интрамуральные включения коллагена и закрытие альвеолярного пространства. Повреждение лёгочной ткани мышей С57BL/6 при однократном ИТ введении блеомицина протекает поэтапно. Гистохимическая окраска образцов гематоксилином и эозином позволила выявить воспалительную реакцию в лёгких. В ранние сроки после инокуляции блеомицина (3-й день) наблюдалась выраженная сосудистая реакция, характеризующаяся венозным полнокровием в стенках альвеол и отёком эпителия межальвеолярных перегородок. Вокруг крупных сосудов и перибронхиально обнаруживались воспалительные инфильтраты, содержащие лимфоциты, гистиоциты, альвеолярные макрофаги, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты. На 7-й день происходило усиление гиперемии и отечных явлений, в просветах альвеол появлялись слущенные альвеоциты. Одновременно увеличивалась интенсивность интерстициального воспаления, отмечалось утолщение стенок альвеол за счет инфильтрации их воспалительными клетками. 14-й день опыта характеризовался значительным усилением процессов воспаления и отёка. В альвеолах появлялся серозно-фибринозный экссудат, повышалось количество слущенных альвеоцитов и клеток инфильтрата. У корня лёгкого встречались участки, где легочный рисунок отсутствовал за счет массивной воспалительной инфильтрации. В этот период наблюдения в патологический процесс вовлекались бронхиолы с образованием мелких кист и разрушением структуры альвеол, что являлось начальным этапом формирования так называемого «сотового легкого». На 21-й день воспалительный процесс в лёгких достигал максимальной выраженности (Рисунок 8). С помощью гистохимической окраски пикрофуксином по Ван-Гизону нами было выявлено повышение интенсивности отложения коллагеновых волокон в легочной ткани фиброзных животных на протяжении всего периода наблюдения. На ранних сроках эксперимента отмечался преимущественно перибронхиальный и околососудистый фиброз (7-й день), который в дальнейшем распространялся на альвеолярные перегородки и превращался в интерстициальный (14-й день). На 21 й день опыта наблюдалась картина обширного, распространенного пневмофиброза (Рисунок 8).
Следует отметить, что такая особенность человеческого ИФЛ как постоянная прогрессия и необратимость природы при однократном ИТ введении блеомицина нами не наблюдались. Из рисунка 9 видно, что по достижению максимального фиброзного ответа на 21-й день опыта фибротическая реакция на цитостатик в дальнейшем (28-60-й день) менее выражена. К 60-му дню падает и интенсивность воспалительной реакции в лёгких по отношению к 21-му дню, при этом более чем на 50% сокращается содержание коллагена (Рисунок 9).
Вопрос необратимого прогрессирования ИФЛ у пациентов был воспроизведён на модели повторяющихся токсических травм альвеолярного эпителия мышей. Курсовое введение блеомицина более полно имитировало хронический аспект фиброгенеза, и, в том числе, наличие гиперпластических альвеолярных эпителиальных клеток, наблюдаемый у больных ИФЛ. Кроме этого, в этой группе животных инфильтрация интерстиции альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками более выражена по отношению к мышам, которым вводили блеомицин однократно. Активная воспалительная реакция поддерживается до конца наблюдения – 60-й день (Рисунок 8). Разрастание соединительной ткани начинается с 7-го дня и прослеживается вплоть до 60-го дня (Рисунок 9). На 14-й день опыта активность отложения коллагена в легких мышей, получавших блеомицин курсом, превосходит таковую у мышей в условиях однократного введения цитостатика.
Внутривенное (ВВ) и внутрижелудочное (ВЖ) введение пегГД в дозе 8 ЕД/18 мкл буфера / мышь профилактическим курсом не оказывало влияния на воспалительную реакцию в лёгких мышей при частично обратимом пневмофиброзе (Рисунок 11). Кроме этого, вводимая ВВ и ВЖ пегГД не влияла на процесс отложения фибротических масс в паренхиме блеомициновых легких (Рисунок 11; Таблица 7).
В дальнейших экспериментах для демонстрации большей эффективности пегилированной гиалуронидазы над нативным аналогом конъюгат вводили в 2 раза меньшей дозе (8 ЕД/18 мкл буфера /мышь), чем тестикулярную гиалуронидазу (16 ЕД/18 мкл буфера /мышь). Эффекты интраназально вводимой пегилированной гиалуронидазы в терапевтическом режиме при необратимом пневмофиброзе На рисунке 12 представлены результаты гистологических исследований легких мышей при необратимом пневмофиброзе, леченных пегГД, водимой в терапевтическом режиме интраназально. Воспалительная инфильтрация в блеомициновых лёгких мышей, получавших пегГД, сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. В отличие от не леченных животных с фиброзом легких (контрольная группа), где инфильтрат локализовался преимущественно у корня, в лёгких больных мышей с пегилированной гиалуронидазой отмечалась диффузная инфильтрация лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и плазматических клеток. Кроме этого, в инфильтрате повышалось количество альвеолярных макрофагов по сравнению с животными с пневмофиброзом без лечения.
Влияние пегилированной гиалуронидазы и спиперона на клональную активность мононуклеаров костного мозга, крови и легких при пневмофиброзе
Лечение спипероном оказывало супрессирующее действие на клональную активность прогениторных кроветворных клеток недифференцированного типа в образцах костного мозга (3, 7, 14-й день) и крови (14-й день) мышей с пневмофиброзом (Таблица 11). КОЕ-Н появлялись к концу эксперимента (21-й день) и исключительно в культурах костного мозга. Дополнительно изучался иммунный профиль клеток КОЕ-Н у мышей интактного контроля и мышей с частично обратимым пневмофиброзом. По данным цитометрического исследования клетки образцов крови и костного мозга имеют негативный отбор на маркеры зрелых гемопоэтических клеток (CD3–, CD45R– (B220), Ly6C– Ly6G– ,(Gr1), CD11b–, TER-119–), положительны для маркеров Sca-1, c-Kit и отрицательны по СD34 маркеру. Исходя из полученных данных, следует, что в состав КОЕ-Н входят гемопоэтические стволовые клетки. Таким образом, однократная интратрахеальная инстилляция блеомицина увеличивает клональную активность костномозговых ГСК и способствует росту КОЕ-Н в культуре периферической крови. Спиперон уменьшает количество КОЕ-Н в образцах костного мозга и крови у мышей с пневмофиброзом. В таблице 12 представлены данные, демонстрирующие увеличение роста КОЕ-ГЭММ в жидких культурах неадгезирующих миелокариоцитов (3, 21-й день) и крови (3, 7-й день) у мышей с частично обратимым пневмофиброзом по сравнению с животными интактного контроля. Лечение пневмофиброза спипероном оказывало длительное супрессирующее действие на формирование КОЕ-ГЭММ в образцах костного мозга (3, 7, 14, 21-й день). Изменение клональной активности в культуре клеток циркулирующей крови было неоднозначно. Так, на 3-й день эксперимента отмечалось понижение показателя, на 7-й день, напротив, его повышение. Таким образом, у мышей с пневмофиброзом спиперон оказывает супрессирующее действие на рост КОЕ-ГЭММ в образцах костного мозга, уменьшает клональную активность прогениторных кроветворных клеток крови.
В нашем исследовании однократная ИТ инстилляция блеомицина вызывала генерацию фибробластных колоний адгезирующими мононуклеаром костного мозга (3, 7, 14, 21-й день), крови (7, 21-й день) и лёгких (7, 14, 21-й день) (Таблица 14). Из представленных данных видно, что, на модели частично обратимого фиброза, прежде всего, возрастала клональную активность прогениторных фибробластных клеток костного мозга. К концу исследования более значительна клональную активность прогениторных фибробластных клеток легких. В образцах костного мозга и крови мышей интактного контроля отмечался не значительный по сравнению с частично обратимым пневмофиброзом рост КОЕ-Ф, в культуре адгезирующих мононуклеаров образование колоний не наблюдалось. Спиперон оказывал супрессирующее действие на клональную активность костномозговых адгезирующих клеток мышей с частично обратимым пневмофиброзом (3, 21-й день). Уменьшение количества КОЕ-Ф в условиях введения спиперона отмечалось и в образцах адгезирующих клеток крови (7, 21-й день). Примечательно, что после снижения выхода колоний в образцах легких мышей с пневмофиброзом (7, 14-й день) к 21-му дню показатель резко возрастал (Таблица 14). Курсовое введение пегГД уменьшало интенсивность роста КОЕ-Ф в культуре адгезирующих мононуклеаров легких на 21-день эксперимента. Количество КОЕ-Ф в опытной группе составило 2,50 ± 0,28 105 адгезирующих мононуклеаров. Это на 44% (n=8, p 0,05) было ниже показателя в группе мышей с частично обратимым пневмофиброзом без лечения. Итак, в условиях однократной инстилляции блеомицина спиперон уменьшает клональную активность костномозговых, легочных и циркулирующих в крови прогениторных фибробластных клеток. Пегилированная гиалуронидаза вызывает падение клональной активности фибробластных КОЕ в фиброзированных легких. Морфологическое исследование вторичных культур выявило клетки одноядерные и/или двуядерные клетки с морфологическими особенностями фибробластов (длинные и тонкие, веретенообразный вид), эндотелиальных клеток (форма булыжника) и эпителиальных клеток (кубические). На протяжении первых 6-7 смен среды основное увеличение биомассы флакона осуществлялось за счет эндотелиоподобных и эпителиоподобных клеток (Таблица 15). Начиная с 8-й смены среды, наблюдалось обогащение культуры фибробластами, количество эндотелиоподобных и эпителиоподобных клеток поступательно снижалось. К окончанию исследования (17-18 смена среды) в образцах выявлялись клетки преимущественно с фибробластной морфологией. Оценка иммунных профилей после окончания исследования (19 смена среды) позволила отнести до 30% клеток в культуре к МСК (CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31–, CD34–, CD45–). Наиболее интенсивное увеличение биомассы наблюдалось в образцах, полученных у мышей с частично обратимым пневмофиброзом без лечения: к концу опыта клеточные культуры достигли слияния 75% от общей площади флакона. В образцах клеток мышей с пневмофиброзом и леченных спипероном показатель не превышал 54,42%. Наименьший прирост биомассы отмечался в культурах клеток гистологически здоровых животных – 38,66%. Цитометрические исследования показали, что после второго пассажа адгезирующие мононуклеары лёгких у мышей интактного контроля, мышей с пневмофиброзом без лечения и леченных спипероном поддерживали стабильную морфологию фибробластов, экспрессировали на поверхности CD44, CD73, CD90, CD106, не экспрессировали CD31, CD34, CD45. С использованием стандартных протоколов изучали in vitro дифференциацию МСК-подобных клеток в клетки стромальных линий: остеобласты, адипоциты, хондроциты и фибробласты. Подтверждением дифференцировки МСК-подобных клеток выступили результаты гистологических исследований (Рисунок 7). Адипогенная дифференцировка
Выращенные в адипогенной среде с индометацином и инсулином МСК-подобные клетки мышей интактного контроля и мышей с пневмофиброзом накапливали небольшие липидные капли. Слияния липидных капель в большие вакуоли не регистрировалось. Достоверных различий в количестве клеток с липофильными включениями в образцах, полученных у здоровых мышей и мышей с частично обратимым пневмофиброзом, не выявлено. Спиперон препятствовал накоплению липидных капель в клетках фиброзированных легких. Доля клеток с липофильными включениями от общего числа культивированных клеток в опытной группе (пневмофиброз леченный спипероном) составляла 4,00 ± 0,39%, в образцах клеток мышей интактного контроля – 11,00 ± 2,32% (n = 8, p 0,001), в образцах клеток больных мышей без лечения – 10,00 ± 1,85% (n = 8, p 0,001). Хондрогенная дифференцировка в трёхмерных гранулярных культурах В хондрогенной среде с TGF-1 из МСК формировалась осадочная (гранулярная) культура. Гистологическое исследование демонстрировала наличие хряща и связанных компонентов матрицы в образцах всех исследуемых источников. При окрашивании гранул толуидиновым синим выявлялась интенсивная фиолетовая метахромазия, что указывала на высокое содержание сульфатированных протеогликанов. Окрашивание толуидиновым синим свидетельствовало о высоком содержании коллагеновых волокон в хондрогенно индуцированных гранулярных культурах.
Тем не менее, в образцах, полученных от леченных спипероном фиброзных мышей, клетки в гранулах были собраны в рыхлый конгломерат с несколькими структурными компонентами внеклеточного матрикса. Доля клеток с окрашенными кислотными и ацетатными муцинами в гистологических образцах опытной группы была ниже (44,00 ± 3,34%), чем в культуре клеток здоровых мышей (62,00 ± 7,21%; (n = 8, p 0,05)) и в культуре клеток мышей с пневмофиброзом, леченных NaCl (67,00 ± 7,82%; (n = 8, p 0,05)).
