Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1.1. Серотониновые рецепторы 12
1.1.2. Серотониновые рецепторы и женские половые гормоны 33
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Препаративная часть 35
2.1.1. Моделирование экспериментальной менопаузы 3 5
2.1.2. Моделирование экспериментального инфаркта миокарда 35
2.1.3. Приготовление гомогенатов сердца и мозга 36
2.1.4. Выделение мембранной фракции гомогенатов сердца и мозга 36
2.1.5. Реагенты, препараты, аппаратура 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Определение уровня связывания [ Н]-серотонина с рецепторами головного мозга
2.2.2. Определение белка 40
2.2.3. Электронно-микроскопическое исследование 40
2.2.4. Статистические методы 40
2.3. Постановка экспериментов 40
2.3.1. Особенности определения уровня специфического связывания [ Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами сердца и мозга крыс на фоне овариэктомии 40
2.3.2. Особенности определения уровня специфического связывания [3Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами сердца и мозга у овариэктомированных крыс после введения препаратов женских половых гормонов
2.3.3. Особенности определения уровня специфического связывания [3Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами сердца и мозга у овариэктомированных крыс в разные сроки инфаркта миокарда 42
2.3.4. Особенности определения уровня специфического связывания [ Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами кастрированных крыс с инфарктом миокарда, получавших препараты женских половых гормонов. 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 44
3.1. Действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы сердца 44
3.1.1. Влияние ложной овариэктомии на уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГС 44
3.1.2. Действие хирургической овариэктомии на уровень пецифического связывания [ Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами сердца крыс 46
3.1.3. Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГС овариэктомированных крыс после введения препаратов женских половых гормонов 50
3.1.4. Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГС в разные сроки инфаркта миокарда у ложноовариэктомированных животных 54
3.1.5. Влияние экспериментального инфаркта миокарда на уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГС крыс после истинной овариэктомии 56
3.1.6. Влияние препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы сердца кастрированных самок в разные сроки инфаркта миокарда 59
3.2. Действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы головного мозга 67
3.2.1. Влияние ложной овариэктомии на уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с МФГМ 67
3.2.2. Действие хирургической овариэктомии на уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с МФГМ
3.2.3. Специфическое связывание [ Щ-серотонина с серотониновыми рецепторами головного мозга овариэктомированных крыс после введения препаратов женских половых гормонов
3.2.4. Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГМ в разные сроки инфаркта миокарда у ложноовариэктомированных крыс 76
3.2.5. Влияние экспериментального инфаркта миокарда на уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами головного мозга овариэктомированных крыс 79
3.2.6. Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГМ кастрированных крыс с инфарктом миокарда после введения препаратов женских половых гормонов 81
Глава 4. Обсуждение результатов 89
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Серотониновые рецепторы и женские половые гормоны
- Особенности определения уровня специфического связывания [ Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами сердца и мозга крыс на фоне овариэктомии
- Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГС овариэктомированных крыс после введения препаратов женских половых гормонов
- Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГМ кастрированных крыс с инфарктом миокарда после введения препаратов женских половых гормонов
Введение к работе
Актуальность темы
Одной из важнейших задач фармакологии является повышение эффективности и безопасности лекарственных средств, в том числе и препаратов женских половых гормонов, которые применяются для заместительной гормональной терапии в период менопаузы и после хирургической овариэктомии. В последние годы отмечен рост гинекологических операций и «омоложение» контингента оперируемых женщин [36]. Овариэктомия, проведенная в детородном возрасте, сопровождается необратимой утратой репродуктивной функции, изменениями в нейроэндокринной системе. Резко возникающий дефицит половых гормонов способствует возникновению системных изменений в органах и тканях [49].
До наступления менопаузы у женщин в 3 раза реже встречаются заболевания коронарных артерий, чем у мужчин. После наступления менопаузы частота сердечно-сосудистых заболеваний у них становится одинаковой, а еще позднее женщины даже опережают мужчин. Течение ИБС и структура осложнений этого заболевания у женщин имеет ряд особенностей. Так, по данным Доценко Ю.В. [25], у женщин инфаркт миокарда чаще бывает безболевым, отмечаются атипичные его симптомы, что нередко затрудняет диагностику. После инфаркта миокарда женщины чаще страдают психическими расстройствами, хуже поддаются реабилитации, у них позже восстанавливается трудоспособность. Поэтому после овариэктомии и в период менопаузы показана гормонозаместительная терапия. Существует целый ряд высокоэффективных препаратов женских половых гормонов. Наиболее широкое распространение получили комбинированные препараты, в состав которых входят эстрогены и гестагены. Одним из таких препаратов является фемостон-10 (Solvay Pharma), содержащий микронизированный 17/3-эстрадиол и дидрогестерон.
7 Микронизированный эстрадиол легко всасывается из желудочно-кишечного тракта, и после достижения равновесной концентрации его средний уровень при непрерывном приеме остается относительно постоянным. Дидрогестерон характеризуется метаболической стабильностью, избирательными прогестагенными свойствами и отсутствием эстрогенной, андрогенной и минералокортикоидной активности [98] Однако в нашей стране заместительную гормональную терапию получают менее 4% женщин с овариэктомическим синдромом. Это обусловлено наличием противопоказаний и повышением риска тромботических, онкологических, сердечно-сосудистых осложнений [2]. Все это определяет необходимость поиска новых направлений коррекции постовариэктомического синдрома, исследования молекулярных механизмов действия женских половых гормонов.
Одним из важнейших нейромедиаторов организма является серотонин, который оказывает свое действие, связываясь с 7 типами и не менее 15 подтипами серотониновых рецепторов, присутствующих во всех органах и тканях [46].
Серотонин, связываясь со своими рецепторами в сердце и сосудах определяет тонус сосудов, влияет на коронарный кровоток, сердечный ритм, а взаимодействуя с рецепторами мозга, участвует в формировании настроения, полового, пищевого поведения, когнитивных функций, восприятии "боли, регуляции цикла сон-бодрствование. Изменения в серотонинергической системе приводят к возникновению аритмий сердца, нарушений сосудистого тонуса и мозгового кровообращения, тромбоэмболии, депрессии, психозов, ожирения, мигрени, диссомнии [12, 16, 17, 18].
Однако влияние препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы в период менопаузы и после удаления яичников изучены недостаточно.
Цель исследования. Определить характер действия фемостона и его компонентов на серотониновые рецепторы сердца и мозга крыс после хирургической овариэктомии и при экспериментальном инфаркте миокарда.
Задачи исследования
1. Определить уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с мембранной фракцией гомогената сердца (МФГС) при вытеснении серотонин-креатинином, 5-НТі-агонистом суматриптаном и 5-НТ3- антагонистом ондансетроном у крыс после ложной и истинной овариэктомии в сравнении.
2. Оценить влияние 17/3-эстрадиола, дидрогестерона и фемостона на уровень специфического связывания меченого лиганда с МФГС овариэктомированных крыс.
3. Определить количество сайтов связывания [ Н]-серотонина в сердце ложноовариэктомированных и овариэктомированных крыс в разные сроки экспериментального инфаркта миокарда и после введения препаратов женских половых гормонов.
Изучить динамику уровня специфического связывания [3Н]-серотонина с мембранной фракцией гомогената мозга (МФГМ) при вытеснении серотонин-креатинином, суматриптаном и ондансетроном у самок крыс после ложной и истинной овариэктомии.
Определить уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ у овариэктомированных крыс на фоне заместительной терапии препаратами женских половых стероидов.
6. Изучить динамику специфического связывания [ Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами головного мозга ложноовариэктомированных и овариэктомированных крыс в разные сроки экспериментального инфаркта миокарда и после введения препаратов женских половых гормонов.
Научная новизна. Изучено специфическое связывание [ Н]-серотонина с МФГС и МФГМ при вытеснении лигандами серотониновых рецепторов серотонин-креатинином, 5-НТі-агонистом суматриптаном,
9 5-НТз-антагонистом ондансетроном у крыс с ложной и истинной овариэктомией. Установлено, что после ложной и истинной овариэктомии общее количество мест связывания [3Н]-серотонина и число 5-НТ3-рецепторов в сердце и головном мозге самок крыс увеличивается, а количество 5-НТі-рецепторов уменьшается. Выявлено модулирующее действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы мозга и сердца у овариэктомированных самок. Исследовано состояние серотонинергической системы головного мозга и сердца у ложнооперированных и овариэктомированных крыс в разные сроки инфаркта миокарда. Установлено модулирующее действие 17/3-эстрадиола, дидрогестерона и фемостона на серотониновые рецепторы сердца и мозга у кастрированных животных после инфаркта миокарда.
Научно-практическая значимость. Получены новые сведения о влиянии истинной и ложной овариэктомии, экспериментального инфаркта миокарда на серотониновые рецепторы сердца и головного мозга. Полученные данные расширяют представление о роли серотониновых рецепторов в регуляции деятельности сердца и головного мозга в норме и патологии, обосновывают возможность применения средств, действующих на серотонинергические синапсы, для фармакологической регуляции деятельности сердца и мозга в период менопаузы.
Выявлено модулирующее действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы сердца и головного мозга после хирургической овариэктомии, экспериментального инфаркта миокарда на фоне хирургической менопаузы, что вносит вклад в теоретическую фармакологию, раскрывая неизвестные аспекты механизма их действия.
Полученные данные могут быть использованы для преподавания фармакологии, кардиологии и гинекологии.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Ложная и истинная овариэктомии увеличивают количество мест связывания серотонина в сердце и мозге крыс, увеличивают количество
10 5-НТз-рецепторов и уменьшают количество 5-НТ] -рецепторов.
Препараты женских половых гормонов оказывают модулирующее действие" на серотониновые рецепторы сердца и головного мозга кастрированных самок с неоднозначным влиянием на различные подтипы рецепторов.
При экспериментальном инфаркте миокарда у крыс-самок изменяется уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГС и МФГМ. Динамика уровня связывания [ Н]-серотонина отличается у ложнооперированных и овариэктомированных крыс.
Препараты женских половых гормонов модулируют уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с МФГС и МФГМ при экспериментальном инфаркте миокарда.
Внедрение результатов работы в практику. Полученные данные используются в учебном процессе на кафедрах фармакологии № 1 с курсом клинической фармакологии, фармакологии № 2 Башкирского государственного медицинского университета. По результатам исследований зарегистрирован патент РФ № 2009138813/14 с приоритетом от 20.10.2009 г. «Средство для модуляции серотониновых рецепторов мозга при посткастрационном синдроме».
Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 1 публикация - в журнале, рекомендуемом ВАК.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XII Международной конференции «Новые информационные технологии' в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня, 2004), 69-й республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2004), 71-й республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики
Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2006).
Апробация работы состоялась на межкафедральном заседании кафедр фармакологии № 1 с курсом клинической фармакологии, фармакологии № 2 и ЦНИЛ ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» 09.12.2009 г.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах компьютерного набора текста, состоит из введения, обзора литературы, глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 10 таблицами. Библиогафия представлена 56 отечественными и 162 иностранными источниками.
Серотониновые рецепторы и женские половые гормоны
Серотонинергическая система играет модулирующую роль в когнитивных процессах, в частности, в обучении и памяти. Агонисты и антагонисты 5-НТіА-(буспирон, ипсапирон, гепирон, тандоспирон, WAY 100135, WAY-100635, 8-OH-DPAT, BMY-7378 и NAN-190), 5-HT1B-(CGS-12066B, RU-24969, CP-94253 и GR-127935T), 5-HT2-(LSD, DOM, MDA, MDMA, LY-53857, MDL-11939, квипазин, ритансерин, пизатифен, BOL, ципрогептадин, кетансерин и миансерин), 5-НТ3-(ондасетрон, гранисетрон, итасетрон и mCPBG) и 5-НТ4-рецепторов (BIMU-1, BIMU-9, GR-125487 и RS-67333), введенные перед, сразу после обучения или перед воспроизведением навыка, изменяют поведение животных разных видов в разных поведенческих ситуациях: изоляция, пассивное и активное избегание, открытое поле, угашение, водный и радиальный лабиринты, отставленное обучение, выработка пищедобывательного навыка и т. д., а также изменяют длительную _ потенциацию [182]. Блокада 5-НТ]Л-рецепторов усиливает стимулируемое хлоридом калия высвобождение глутамата и ацетилхолина в зубчатой извилине гиппокампа, устраняя дефицит обучаемости животных, вызванный глутаматергическим антагонистом [50].
5-НТ-ергическая система вовлечена в регуляцию мозгового кровообращения [111, 152, 164, 184]. Агонист 5-НТіА-рецепторов, 8-гидрокси-2-(ди-н-пропиламино)тетралин, в дозе 0,1 мг/кг в/в вызывал через 5 мин снижение ЧСС с 491 до 370 в 1 мин. Методом лазерной допплерографии обнаружено, что скорость мозгового кровотока максимально возрастала на 34% через 3 мин. Предварительное введение антагониста 5-НТіЛ-рецепторов, WAY100135, в дозе 5 мг/кг блокировало его эффект. Через 5 мин после введения агониста реакция кровотока в стриатуме и в лобно-теменной области коры больших полушарий на гиперкапнию возрастала на 27% и 61% соотв. [164]. Агонисты 8-OH-DPAT, BAYX3702 оказали неиропротекторное действие [62, 162]. Введение BAYX3702 непосредственно после перевязки средней артерии мозга в значительной степени предотвращало повышение концентрации внеклеточного глутамата, что обуславливает его нейропротекторное действие [130]. 5-НТіЛ-агонистьі оказывают антиноцицептивное действие [94, 129].
Давыдовой С. М. и др. [20] получены данные об участии пресинаптических 5-НТіЛ-рецепторов, расположенных, главным образом, на телах 5-НТ-нейронов (соматодендритные 5-НТ1Л-ауторецепторы), в процессе иммуномо дуляции.
Стимуляция 5-НТ]А-рецепторов оказывает гипотермическое действие [163, 168, 171]. Различия в плотности популяции 5-НТіА-рецепторов обусловливают особенности гипотермической реакции на агонист. У крыс с высокой, промежуточной или низкой чувствительностью к гипотермическому эффекту агониста 5-НТіА-рецепторов 8-OH-DPAT, через 45 мин температура тела снижалась на 0,5, 1,1 и 3,5 соотв., при этом концентрация участков связывания [ H]-8-OH-DPAT в лимбических проекциях в коре больших полушарий у крыс с высокой, промежуточной и низкой чувствительностью составляла 10,2-20,6, 8,8-17,2 и 8,2-15,7 нКи/мг соответственно. [141].
Существуют тесные взаимосвязи серотонинергической системы с другими нейромедиаторными системами. Серотонин, воздействуя на 5-HTiA-рецепторы, модулирует глутаматергическую нейропередачу в структурах красного ядра крысы [199]. BAYX3702, зависимым от концентрации образом ингибировало стимулированное освобождение глутамата с 1С5о 1 мкМ. При этом преинкубация срезов с антагонистом 5-НТіА-рецепторов, WAY100635, зависимым от концентрации образом блокировала данный эффект [132]. Серотонин, взаимодействуя с серотониновыми рецепторами, регулирует норадренергическую нейропередачу в голубом пятне [84]. С другой стороны, при поражении норадренергическои системы животные проявляли повышенную чувствительность к антидепрессивному действию R(+)8-оксидипропиламинотетралина, селективного агониста 5-НТіА-рецепторов, повышенную болевую чувствительность при термическом воздействии и повышенное тревожное состояние [177]. Серотонин вентролатеральной преоптической области [43], серотонинергические проекции от дорзальных ядер шва к базолатеральной миндалине [44] вовлечены в регуляцию цикла сон-бодрствование у крыс. В исследованиях Prosser R. A. et al. [175] серотонинергическую систему изолированных срезов надперекрестного ядра мыши активировали воздействием серотонина, 8-OH-DPAT, предшественника серотонина и ингибитора обратного захвата серотонина (флуоксетин) в низких концентрациях. Воздействие каждого из этих соединений вызывало сдвиг циркадианной реакции нейронов надперекрестного ядра на последующее воздействие серотонина или его агониста. Обнаруженный эффект обусловлен изменениями плотности рецепторов серотонина на нейрональной поверхности. Функциональная активность 5-НТ1Л- и 5-НТ2-рецепторов определяет показатели состояния сна [12].
Формирование нейромедиаторных систем, их функциональное созревание происходит по соответствующим генетическим программам. В регуляции пластичности головного мозга деятельное участие принимают такие факторы, как межгенные взаимодействия и влияния внешних факторов на генную экспрессию, определяющие индивидуальные особенности поведенческих реакций [39]. Существуют временные особенности постнатального созревания функциональной активности подтипов рецепторов серотонина. Максимальные проявления серотонинергического синдрома (аддукция задних конечностей, тремор, вращения головой и др.) отмечены при введении крысам агониста 5-НТі-рецепторов, 8-OH-DPAT, в возрасте 7-14 дней. Проявления симптома "отряхивания мокрой собаки" после введения 5-НТ2л/2С -агониста, (+)-1-(2,5-диметокси-4-йодофенил)-2-аинопропана, возникали после 14-го дня постнатального периода и достигали максимума к 18-му дню [96]. Изучение дегенерации, митотической активности и дифференцировки с помощью иммуногистохимического выявления ядерного белка (NeuN) пересаженных нейронов позволило установить, что серотонин способствует выживанию и дифференцировке нейроэпителиальных клеток трансплантатов, а также участвует в регуляции их пролиферации. Предполагается, что серотонин оказывает стимулирующее влияние на скорость клеточного цикла пересаженных клеток, тем самым ускоряя дифференцировку нейронов [37].
Особенности определения уровня специфического связывания [ Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами сердца и мозга крыс на фоне овариэктомии
Согласно данным исследователей, 5-НТ4-рецепторы участвуют в регуляции холинергической нейротрансмиссии. Так, BIMU-8 - агонист 5-НТ4-рецепторов увеличивал выброс ацетилхолина нервными окончаниями, а GR 125487 - антагонист 5-НТ4-рецепторов предотвращал упомянутый эффект [58]. Поэтому 5-НТ4-агонисты могут быть использованы для усиления действия веществ, обладающих прокогнитивными свойствами [60]. Серотонин через 5-НТ4-рецепторы участвует в формировании краткосрочной памяти. BIMU1, агонист 5-НТ4-рецептора, вызывал образование краткосрочной памяти, и этот эффект предотвращался введением селективных 5-НТ4-антагонистов [59]. В опытах на мышах предварительное внутрибрюшинное введение препарата SL65015 (1 мг/кг), частичного агониста рецепторов серотонина типа 5-НТ4 в течение недели блокировало амнестический эффект внутрижелудочнового введения 400 пмоль /3-амилоида или 3 мкг галанина. Также в опытах на крысах SL65015 (1 мг/кг) в течение недели улучшал память и обучаемость животных при моделировании амнезии, вызываемой разрушением крупноклеточного базального ядра иботенатом или введением животным метилазоксиметанола [93]. Существует функциональное взаимодействие серотонинергической системы с участием 5-НТ4-рецепторов и холинергической системы. В тесте пассивного избегания показано, что введение в желудочки мозга крыс Wistar агониста 5-НТ4-рецепторов SC 53116 частично восстанавливало обучаемость, нарушение которой было вызвано скополамином [110]. 5-НТ4-рецепторы были обнаружены в подвздошной кишке, где они опосредовали сокращение и расслабление кишечника, вызванное серотонином [95] и в миокарде предсердий, где опосредовали положительный инотропный эффект серотонина [181]. 5-НТ4-рецепторы предсердий характеризовались Kd = 9,7 нМ, Втах = 4 фмоль/мг белка. Это в 10 и 5 раз меньше, чем у /Зі и / рецепторов соответственно. Маленькая популяция 5-НТ4-рецепторов в сердце объясняет слабый инотропный эффект серотонина [139].
Серотонин регулирует амплитуду тока Са2+ в предсердных миоцитах через 5-НТ4-рецепторы, положительно сопряженные с аденилатциклазой [63], повышая уровень цАМФ и активность цАМФ-зависимой протеинкиназы [68], чем и обусловлен положительный инотропный эффект агонистов 5-НТ4-рецепторов [187].
В легочных венах овец высокоаффинные 5-НТ4-рецепторы опосредовали независимое от эндотелия вазодилатирующее действие серотонина [77].
Ауторадиографическим методом 5-НТ5-рецепторы, сопряженные с G-белками, найдены в обонятельной луковице и новой коре. Наибольшее количество рецепторов обнаружено в медиальном ободке [176]. 5-НТ5-рецепторы делятся на 5-НТ5А- И 5-НТ5в-рецепторы [131].
Рекомбинантные 5-НТб-рецепторы человека положительно сопряжены с аденилатциклазой, встречаются во всех отделах мозга, больше всего в хвостатом ядре. мРНК человеческого 5-НТ6-рецептора кодирует полипептид, содержащий 440 аминокислотных остатка. Ген рецептора находится в хромосомной области 1р35-рЗб [61]. Иммуногистохимическим методом было установлено, что 5-НТб -рецепторы находятся на плазматических мембранах нейронов [150].
5-НТ6-рецепторы вовлечены в контроль ацетилхолиновой нейротрансмиссии в мозге крыс, так как 5-НТ6-антагонисты подавляют вращательное движение крыс, вызванное блокадой М-холинорецепторов скополамином и атропином [137]. Следовательно, антагонисты 5-НТб-рецепторов могут применяться при нарушениях памяти и для улучшения обучения [82]. По данным М. D. Lindner et al. [73] не подтверждаются ранее полученные данные о возможности применения антагонистов 5-НТб-рецепторов при когнитивных нарушениях, так как при введении антагонистов 5-НТ6-рецепторов, SB-271046 и Ro 04-6790, не обнаружено существенного влияния на показатели мнестических функций у крыс, нарушенных введением скополамина.
мРНК 5-НТ7-рецепторов определялась в гипоталамусе, амигдале, таламусе, гиппокампе. Серотонин, зависимым от концентрации образом, стимулировал накопление цАМФ в культивируемых астроцитах таламо-гипота-ламической области крыс. Способность агонистов 5-НТ-рецепторов стимулировать накопление цАМФ снижалась в ряду: 5-карбоксамидотриптамин 5-метокситриптамин серотонин. Ингибиторная эффективность антагонистов 5-НТ, которую оценивали по торможению стимулированного 5-карбок-самидотриптамином накопления цАМФ, снижалась в ряду: метиотепин ме-сулергин ритансерин клозапин миансерин [127]. По результатам исследований Varnas К. et al. [211], б-ВДУрецепторы в основном локализованы в переднем таламусе, зубчатой извилине, остальные регионы имеют средний уровень 5-НТ7-рецепторов.
Путем альтернативного сплайсинга в организме человека и крыс образуются 4 изоформы 5-НТ7-рецепторов, которые отличаются внутриклеточными С-концами. У крыс имеется три изоформы: 5-НТ7А (448 аминокислот), 5-НТ7В (435), 5-НТ7С (470), а у человека 5-НТ7А (445), 5-НТ7В (432), 5-HT7D (479). Эти рецепторы отличаются друг от друга интрон -экзонной организацией [114]. У человека доминирующим является 5-НТ7л подтип рецепторов [113]. Провели ко-трансфекцию клеток НЕК 293 кДНК одной из изоформ аденилатциклазы и кДНК рецепторов серотонина 5-НТб или 5-НТ7А- При анализе функциональной активности рецепторов в трансфицированных клетках установили, что при активации рецепторов 5 33 НТб происходит классическая стимуляция чувствительной к белку Gs аденилатциклазы типа 1, но не типа 8, а при активации рецепторов 5-НТ7д происходит активация аденилатциклаз обоих типов, благодаря повышению концентрации цитозольного кальция [193].
Усеченный сплайсинговый вариант 5-НТ7-рецептора человека, h5 HT7(b), стабильно экспрессировали в клетках НЕК 293. Значения IQ и Вмакс связывания [- Щ-5-карбоксиамидотриптамина с рецептором составляли 0-,28 нМ и 7,3 пмоль/мг белка соотв. Сродство рецептора к использованным лигандам снижалось в ряду: 5-карбоксамидотриптамин серотонин метиотепин месулергин 8-OH-DPAT кетансерин. Значения рЕС5о стимуляции лигандами аденилатциклазы, сопряженной с экспрессированными рецепторами, составляли для 5 карбоксамидотриптамина, 5-метокситриптамина, серотонина, триптамина и 8-OH-DPAT 8,7; 8,1; 7,5; 5,6 и 5,3 соотв. [91] 5-НТ7-рецепторы играют важную роль в релаксации гладкой мускулатуры-сосудов [210]. Гипотензивное действие серотонина, возможно, опосредовано рецепторами, сходными с 5-НТ7 [198]. Развитие тахикардии при действии серотонина также связано с 5-НіУ-рецепторами [89].
Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГС овариэктомированных крыс после введения препаратов женских половых гормонов
Таким образом, после перевязки коронарной артерии у крыс с функционирующими яичниками уменьшается общее количество серотониновых рецепторов сердца. Минимальное число отмечается через 7 суток после инфаркта миокарда.
Подобная ситуация наблюдалась и в динамике специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГС при вытеснении суматриптаном. Так,, через сутки после коронароокклюзии наблюдалось снижение уровня специфического связывания лиганда до 10,6% от контрольного уровня. К 3 суткам после перевязки коронарной артерии уровень специфического связывания [ Н]-серотонина составлял 44,5% от уровня контрольных значений. На 7 день от момента коронароокклюзии количество сайтов связывания в МФГС еще более снижалось - до 7,4% от контрольного уровня и оставалось пониженным к последнему сроку наблюдения (в 4,6 раза по сравнению с контрольными значениями) — 21,9%.
Следовательно, инфаркт миокарда вызывает также уменьшение числа 5-НТі-рецепторов в сердце ложнооперированных крыс с минимумом через 7 суток.
При вытеснении ондансетроном уровень специфического связывания [ Н]-серотонина в МФГС ложноовариэктомированных крыс изменялся несколько иначе. Так, если через сутки после перевязки передней ветви коронарной артерии отмечалось снижение количества сайтов связывания [3Н]-серотонина с МФГС (до 29,3% от уровня контрольных значений), то на З, 7 и 14 сутки после коронароокклюзии наблюдалось их значительное повышение по сравнению с контрольным уровнем. На 3-й сутки после экспериментального инфаркта миокарда уровень специфического связывания лиганда с МФГС повышался в 2,7 раза (272,8% от уровня контроля), оставаясь повышенным на 7 сутки коронароокклюзии (268,5%). К концу наблюдения уровень специфического связывания [3Н]-серотонина практически не изменялся по сравнению с 3 сутками и оставался в 3,3 раза выше уровня связывания в контрольной группе (333,7%). Следовательно, при инфаркте миокарда количество 5-НТз-рецепторов в сердце уменьшается в острейшем периоде (1 сутки) и повышается в последующие сроки.
Таким образом, экспериментальный инфаркт миокарда влияет на серотонинергическую систему сердца. После перевязки коронарной артерии у крыс с сохраненными яичниками уменьшается общее количество серотониновых рецепторов и 5-НТгрецепторов и повышается число 5-НТ3-рецепторов в сердечной ткани.
В описанных выше сериях опытов было выявлено влияние коронароокклюзии на серотонинергическую систему сердца крыс с функционирующими яичниками.
Дальнейшие исследования уровня специфического связывания [ Н]-серотонина -в сердце кастрированных крыс-самок в разные сроки экспериментального инфаркта миокарда показали, что через 1 сутки после коронароокклюзии количество сайтов связывания меченого лиганда в МФГС при вытеснении серотонином-креатинином увеличилось в 1,6 раза по сравнению с контрольной группой (162,8%) (таб.3.2). На 3 и 7 сутки уровень связывания понизился и составил 24% и 40% от уровня овариэктомированных крыс без инфаркта миокарда соответственно. Однако, на 14 сутки уровень специфического связывания меченого лиганда увеличился в 2,6 раза по сравнению с животными после хирургической овариэктомии и составил 262% от уровня контроля.
Таким образом, при инфаркте миокарда у овариэктомированных крыс общее количество мест связывания серотонина в сердце увеличивается через 1 сутки, уменьшается через 3 и 7 суток и вновь повышается через 14 дней. В группе ложноовариэктомированных крыс, перенесших инфаркт миокарда, на протяжении всего периода наблюдения общее количество серотониновых рецепторов уменьшалось. Уровень связывания [3Н]-серотонина с МФГС кастрированных самок при вытеснении суматриптаном был следующим. Через сутки после коронароокклюзии уровень специфического связывания [3Н]-серотонина повысился в 2,5 раза и составил 149,4% по отношению к контрольной группе. На 3 и 7 сутки определялось повышение уровня в 18 раз (1096,3% и 1089,5% соответственно). На 14 сутки количество сайтов связывания [ Н]-серотонина с МФГС овариэктомированных крыс при вытеснении суматриптаном оставалось повышенным в 2,3 раза (225,9%) от контрольного значения. Следовательно, при инфаркте миокарда у кастрированных крыс количество 5-HTi -рецепторов повышается во все сроки наблюдения, особенно выраженный подъем отмечается через 3 и 7 суток. Между тем у крыс с сохраненными яичниками число 5-НТгрецепторов уменьшалось во все сроки наблюдения. Следовательно, динамика количества 5-НТгрецепторов сердца кастрированных животных после экспериментального инфаркта миокарда было прямо противоположно динамике ложноовариэктомированных крыс Существенное влияние оказывала хирургическая овариэктомия на уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с МФГС при вытеснении ондансетроном у крыс, подвергшихся коронароокклюзии. В 1 сутки отмечается резкий всплеск уровня связывания до 840 % с последующим значительным спадом на всем протяжении наблюдения (22,7% - в 1 сутки, 6,02% - на 2 сутки, 32,8% - на 3 сутки). У крыс с сохраненными яичниками в 1 сутки инфаркта миокарда определялось снижение, а далее стойкий подъем уровня связывания меченого лиганда вплоть до 14 суток наблюдения. Таким образом, количество 5-НТ3-рецепторов у кастрированных самок повышается через сутки после инфаркта миокарда, а в последующие сроки снижается, у ложнооперированных крыс - наоборот.
Специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГМ кастрированных крыс с инфарктом миокарда после введения препаратов женских половых гормонов
При сравнении динамики числа серотониновых рецепторов мозга в разные сроки инфаркта миокарда после ложной и истинной овариэктомии установлено, что у ложноовариэктомированных крыс лишь через 1 день после инфаркта миокарда отмечается уменьшение количества рецепторов. В отличие от. них, у кастрированных крыс резкий подъем количества рецепторов в 1 день инфаркта миокарда сменяется спадом на 3 и 7 дни, с последующим значительным подъемом на 14 день экспериментального инфаркта миокарда.
В 1 день инфаркта миокарда уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ при вытеснении суматриптаном повысился более чем в 10 раз (1098,1%) по сравнению с контрольной группой животных. На 3 день исследования отмечался дальнейший подъем уровня связывания до 1508,7%, который на 7 день инфаркта миокарда составил 983,2% от контрольных величин. На 14 день инфаркта миокарда уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ был выше более чем в 25 раз (2704,4%) значений овариэктомированных крыс без инфаркта миокарда.
Итак, число 5-НТі-рецепторов головного мозга у овариэктомированных крыс повышается во все сроки экспериментального инфаркта миокарда с максимальным значением на 14 день. Сравнение полученных данных с изменениями числа 5-НТі— рецепторов у ложноовариэктомированных крыс показало, что у крыс с сохраненной функцией яичников количество 5-НТі-рецепторов увеличивалось лишь через 1 и 7 суток после инфаркта миокарда. Уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ при вытеснении ондансетроном при однодневном инфаркте миокарда был повышен более чем в 30 раз и достигал 3124,3% от контрольных значений. На 3 день инфаркта миокарда количество мест связывания уменьшилось до 0,4% от контроля. На 7 и 14 день инфаркта миокарда специфическое связывание [3Н]-серотонина приблизилось к уровню овариэктомированных крыс без инфаркта миокарда (111,5% и 112,6% соответственно). Итак, у овариэктомированных крыс максимальное количество 5-НТз— рецепторов головного мозга отмечается в 1 день инфаркта миокарда, минимальное — на 3 день, с возвращением к уровню овариэктомированных крыс без инфаркта миокарда к 7 и 14 дню. Для сравнения, у крыс с ложной овариэктомией в первые три срока наблюдения число 5-НТ3-рецепторов уменьшалось, а через 14 суток повышалось.
Уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ при вытеснении серотонин-креатинином в первый день инфаркта миокарда у овариэктомированных крыс в течение двух недель, получавших 17/3-эстрадиол (таб. 3.8) снижался до 8,6% по сравнению с овариэктомированными крысами, получавшими плацебо. В динамике развития инфаркта миокарда на 3 день специфическое связывание [3Н]-серотонина снижалось, при этом прием 17/3-эстрадиола увеличивал количество мест связывания [ Н]-серотонина более чем в 4 раза (432,7% от контроля). На 7 день инфаркта миокарда, когда наблюдалось наименьшее специфическое связывание [3Н]-серотонина у овариэктомированных крыс, у крыс, получавших заместительную терапию 17/3-эстрадиолом, оно было минимальным. При повышении уровня специфического связывания [ Н]-серотонина на 14 день инфаркта миокарда у контрольной группы животных, прием 17/3-эстрадиола вызывал снижение уровня связывания до 14,5% по сравнению с овариэктомированными крысами, получавшими плацебо.
Итак, заместительная терапия 17/3-эстрадиолом снижает повышенный уровень специфического связывания в 1 и 14 день инфаркта миокарда, повышает сниженный уровень на 3 день, тем самым оказывает модулирующее действие на серотониновые рецепторы мозга в эти сроки исследования.
На фоне повышения уровня специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ при вытеснении серотонин-креатинином у овариэктомированных крыс в 1 сутки инфаркта миокарда заместительная терапия дидрогестероном вызывала снижение уровня связывания до 14,01% по сравнению с контрольной группой животных. При трехдневном инфаркте миокарда, когда отмечалось снижение связывания в контроле, у крыс, получавших дидрогестерон, уровень специфического связывания [ Н]-серотонина был выше более чем в 5 раз (550,9%). На 7 день инфаркта миокарда, когда наблюдалось минимальное количество сайтов связывания [ Н]-серотонина, введение дидрогестерона увеличивало специфическое связывание более чем в 4 раза (404,5%). На 14 день инфаркта миокарда введение дидрогестерона снижало до 20,5% связывание [3Н]-серотонина на фоне повышенного уровня связывания, наблюдаемого у крыс с инфарктом миокарда, получавших плацебо.
Таким образом, дидрогестерон приближает динамику числа серотониновых рецепторов мозга кастрированных крыс с инфарктом миокарда к динамике крыс с функционирующими яичниками.
Уровень специфического связывания [ Н]-серотонина с МФГМ при вытеснении серотонин-креатинином у овариэктомированных крыс в 1 день инфаркта миокарда повышается. Предварительное введение фемостона снижает уровень связывания [ Н]-серотонина до 4,02% по сравнению с контролем. На 3 день инфаркта миокарда введение фемостона также снижало уровень связывания [ Н]-серотонина у овариэктомированных крыс более чем в 4 раза (20,9%) по сравнению с контрольной группой животных. При семидневном инфаркте миокарда, когда отмечался минимальный уровень специфического связывания у контрольных животных, у группы крыс, получавшей препарат фемостон, специфическое связывание уменьшалось. На фоне подъема специфического связывания на 14 день инфаркта миокарда введение фемостона снижало уровень связывания до 16,1%.
