Введение к работе
Актуальность проблемы. Хронический гепатит представляет собой тяжелое распространенное заболевание печени, при котором недостаточная способность органа к регенерации зачастую приводит к замещению функционирующей паренхимы соединительной тканью, нарушению его структурной организации и развитию цирроза печени (Маянский Д.Н. и др., 1998; Павлов Ч.С., 2007; Ивашкин В.Т. и др., 2008; Абдурахманов Д.Т., 2010). Фармакологическое действие существующих гепатопротекторных лекарственных средств направлено преимущественно на защиту, либо стимуляцию сохранившихся клеточных элементов печени (Венгеровский А.И. и др., 1988, 1996, 2009, 2012; Ивашкин В.Т. и др., 2012). Однако данная концепция фармакологического вмешательства в ряде случаев оказывается несостоятельной. Зачастую не удается, не только восстановить морфофункциональное состояние органа, но и предупредить прогредиентный характер течения патологического процесса (Байматов В.Н., 1998; Лучшев В.И. и др., 2004; Блюм Х.Е., 2005; Крель П.Е. и др., 2009). Низкая эффективность существующих гепатопротекторных средств определяет необходимость разработки принципиально новых патогенетически обоснованных методов терапии патологических состояний печени.
Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития нового направления в лечении многих заболеваний – с помощью клеточной терапии (Сухих Г.Т. др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Зюзьков Г.Н., 2006; Дыгай А.М. и др., 2009; Zyuz`kov G.N. et al., 2005; Liu M. et al., 2008; Williams A.R. et al., 2011). При этом наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины является фармакологическая стимуляция эндогенных стволовых клеток (СК) (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009; Zyuz'kov G.N. et al., 2005, 2007; Dygai A.M. et al., 2011; 2012). Ранее в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН в экспериментах in vitro и in vivo была показана возможность модификации функций прогениторных клеток различных классов с помощью нативной гиалуронидазы (Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Дыгай A.M. и др., 2009). Основной мишенью данного фермента является гиалуроновая кислота (ГК), представляющая собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме, связывающий in situ посредством специфических рецепторов (CD44, RHAMМ) клетки-предшественники различных классов (Дыгай А.М. и др., 2009; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Nedvetzki S. et al., 2004; Avigdor A. et al., 2004; Zhu H. et al., 2006). При этом обнаружено, что в определенных условиях гиалуронидаза способна расщеплять ГК межклеточного матрикса до полимеров, активирующих процессы клеточного деления и дифференцировки, а также вызывать усиление индуцируемого внешними факторами выхода СК в кровь (Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Дыгай А.М. и др., 2009, 2012; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003).
Учитывая вышесказанное, весьма перспективным представляется разработка оригинального подхода управления регенераторным потенциалом тканей за счет модификации свойств ГК с помощью гиалуронидазы. Вместе с тем значительное количество ингибиторов данного фермента в организме (Максименко А. В. и др., 2001; Пушкарь Д.Ю. и др., 2006; . et al., 1986; .Afify A.M. et al., 1993) предопределяет возможность стимуляции родоначальных клеток с помощью его введения in vivo лишь в дозах существенно превышаюших терапевтически допустимые (Волкова М.А., 1998; Козлов В.А. и др., 2004; Дыгай А.М. и др., 2009; Anderson J.A., 1992), что делает невозможным создание на основе нативной гиалуронидазы безопасного средства для регенеративной медицины.
В то же время существует нанотехнология электронно-лучевого синтеза (Дыгай А.М. и др., 2009, 2010, 2011, 2012; Vereschagin E.I. et al., 2001), позволяющая получать конъюгаты биологически активных веществ с низкомолекулярными носителями – иммобилизированные лекарственные средства, которые в отличие от своих нативных аналогов белковой природы оказываются практически неиммуногенными и нетоксичными. Указанные свойства при этом определяются «перекрытием» молекулами носителя (в качестве которого наиболее предпочтительным является использование полиэтиленгликоля (ПЭГ)) антигенных детерминант белков, что делает их практически невидимыми для элементов системы иммунного надзора (Delgado C. et al., 1992; Avgoustakis K., 2004; Maullu C. et al., 2009; Huang Z. et аl., 2009). Более того, данные конструкции оказываются еще в значительной степени защищенными от протеолитических ферментов, что определяет возможность их эффективного перорального использования, представляющего собой наиболее комплаентный путь приема средств для регенеративной медицины (Гольдберг Е.Д. и др., 2008; Дыгай А.М. и др., 2009; Gol’dberg E.D. еt аl., 2008).
Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным представляется изучение возможности стимуляции процессов восстановления ткани печени при ее хроническом поражении путем активации функций эндогенных прогениторных клеток с помощью иммобилизированной (пегилированной) формы гиалуронидазы (Пэг-ГД).
Цель исследования. Выявить гепатопротекторные свойства пегилированной гиалуронидазы, вскрыть роль модификации функций прогениторных клеток в развитии терапевтических эффектов и изучить механизмы их регуляции в условиях моделирования хронического токсического гепатита.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние Пэг-ГД на морфофункциональное состояние печени в условиях экспериментального хронического токсического гепатита.
-
Определить состояние пулов клеток-предшественников различных классов в печени, костном мозге и периферической крови при введении Пэг-ГД.
-
Оценить изменение секреции факторов роста печеночных колониеобразующих единиц (КОЕ-Печ) элементами микроокружения печеночной ткани и восприимчивости прогениторных элементов к регуляторным стимулам под воздействием Пэг-ГД.
-
Вскрыть влияние Пэг-ГД на продукцию хемоаттрактантов родоначальных клеток элементами микроокружения костного мозга и печеночной ткани.
-
Оценить состояние периферической крови и костномозгового кроветворения при введении Пэг-ГД на фоне моделирования хронического токсического гепатита.
Научная новизна. Впервые выявлены выраженные гепатопротекторные эффекты пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. Обнаружено значительное уменьшение выраженности воспалительно-некротических и склеротических морфологических изменений в печени и снижение содержания щелочной фосфатазы в сыворотке крови при пероральном введении данного средства. Показано, что в основе выявленного противовоспалительного, противосклеротического и антихолестатического действия Пэг-ГД лежит стимуляция регенераторных процессов печеночной ткани, связанная с активацией регионарных КОЕ-Печ и направленной миграцией мультипотентных мезенхимальных СК костного мозга в орган-мишень. При этом развитие указанных феноменов определяется возрастанием выработки клеточными элементами микроокружения гуморальных факторов, стимулирующих КОЕ-Печ, на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам, а также падением продукции хемоаттрактантов СК стромальными клетками костного мозга при увеличении их выработки элементами микроокружения печени. Продемонстрировано, что мобилизация мультипотентных СК из гемопоэтической ткани, вызванная введением Пэг-ГД при моделировании хронического гепатита, не сопровождается значимым «негативным» влиянием на систему крови.
Практическая значимость. На основании результатов исследований подготовлен отчет для Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения о специфической активности пегилированной с использованием оригинальной технологии гиалуронидазы (разработанной ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск) для получения разрешения на ее клинические исследования в качестве гепатопротектора.
Полученные данные фундаментального характера о закономерностях функционирования клеток-предшественников различных классов в условиях патологии печени, а также о механизмах действия изучаемого средства – аналога регулятора функций прогениторных клеток, внесли существенный вклад в развитие фармакологической стратегии регенеративной медицины и могут использоваться для разработки новых медицинских клеточных технологий.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на VI, VII и VIII Региональных конференциях молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011, 2012, 2013); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); Российской конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 7 – в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 2 патента на изобретение: патент (RU) № 2439147 «Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток» (опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1) и патент (RU) на изобретение № 2477752 «Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении» (опубл. 20.03.2013, Бюл. № 8).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 308 источников, из них 100 отечественных и 208 иностранных.
