Введение к работе
Актуальность темы. В клинической практике более двадцати лет используются трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), извлеченных из пуповинной крови (ПК) человека для лечения заболеваний системы крови, а также ряда других заболеваний, при которых происходит угнетение гемопоэза. (Karen К. Ballen at al., 2008).
В связи с разработкой методов трансплантаций ГСК пуповинной крови и расширением показаний к клиническому применению гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови проблема создания банков длительного хранения стволовых клеток является весьма актуальной. Получение гемопоэтических клеток-предшественников из костного мозга и периферической крови является сложной и дорогостоящей процедурой, связанной с вмешательством в здоровье донора, которое может приводить к нежелательным осложнениям. Широкомасштабный сбор ПК позволяет быстро формировать банк данных для подбора неродственного донора. Концентрация гемопоэтических стволовых клеток в одном образце ПК может обеспечить надёжную трансплантацию пациентам с массой тела, не превышающей 50 кг. Для пациентов, имеющих вес, превышающий 50 кг, приходится производить трансплантацию двух образцов ПК, что может иногда приводить к развитию осложнений в виде РТПХ или отторжения трансплантата. Поэтому вопросы о сохранности гемопоэтических стволовых клеток ПК на всех этапах их получения, сепарации, криоконсервирования и хранения, а также оценка их пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке in vivo требуют постоянного изучения и совершенствования.
Регенерация кроветворной системы у пациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток зависит не только от их количественного содержания, но и от репликативного потенциала этих клеток, снижение которого коррелирует с потерями теломерных повторов в хромосомах. Гемопоэтические стволовые клетки с фенотипом CD34+ имеют различия в пролиферативной способности. Потенциал самовоспроизведения этих клеток также различен, что свидетельствует о гетерогенности их популяции, которая обусловлена различной степенью зрелости. Поэтому данные о количестве CD 34+ гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови следует интерпретировать с осторожностью. При достаточном для восстановления гемопоэза количестве гемопоэтических стволовых клеток может быть недостаточен их пролиферативный потенциал, что приведёт к отсутствию ожидаемого результата от трансплантации. Это диктует необходимость определения терапевтической дозы
гемопоэтических стволовых клеток, учитывая не только их количество, но и пролиферативный потенциал, зависящий от длины теломер.
Криоконсервирование является неотъемлемой частью процедуры длительного хранения клеточных биоматериалов. Криоконсервирование приводит к повреждению белковых структур клеточной мембраны, ферментов и ДНК и может служить потенциальным механизмом, вызывающим одиночные поломки терминальной теломерной ДНК и уменьшение длины теломер. Это приводит к снижению пролиферативных свойств деконсервированных клеток.
Оценка пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криоконсервирования ПК является дополнительным критерием контроля качества образца и поэтому важным прогностическим критерием успеха трансплантации.
Цель исследования. Оценить исходный пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови как альтернативного источника ГСК для трансплантации и изучить влияние различных способов криоконсервирования и условий хранения при ультранизких температурах на пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
Задачи исследования:
-
Оценить количество ЯСК в образцах пуповинной крови и количество CD34+/CD45 методом проточной цитометрии. Выявить зависимость количества CD34+/CD45 в образце пуповинной крови от количества ЯСК
-
Изучить влияние различных акушерских пособий на количественный и качественный состав собираемой пуповинной крови
-
Определить длину теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и оценить их пролиферативный потенциал перед низкотемпературным криоконсервированием и после размораживания
-
Исследовать влияние различных способов криоконсервирования на колониеобразующую способность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и сохранность длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, как один из важных критериев их репликативного и пролиферативного потенциала
5. Выявить зависимость между длиной теломер и колониеобразующей
способностью гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
6. Изучить влияние различных сроков и условий хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови на длину теломер и колониеобразующую способность гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови
На защиту выносятся следующие положения:
-
Количество клеток CD34+/CD45 зависит от количества количества ЯСК в образце пуповиннои крови
-
Акушерское пособие, оказываемое в родах при сборе образца пуповиннои крови, влияет на качественный и количественный состав клеток образца пуповиннои крови.
-
Измерение длины теломер гемопоэтических стоволовых клеток после их криоконсервирования и длительного хранения является высокочувствительным биологическим маркером сохранности пролиферативного потенциала.
-
Сохранность пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови зависит от способа криоконсервирования. При криоконсервировании время от наступления точки эвтектики до кристаллизации должно быть не более 1,5 минут. Увеличение этого времени приводит к разрушению клеток и снижению их репликативного и пролиферативного потенциала.
-
Колониеобразующая способность гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови зависит от их длины теломер.
-
Соблюдение условий низкотемпературного хранения необходимо для сохранности пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови.
Научная новизна. Впервые изучен пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови, определяемый длиной теломер и степенью сохранности клеток-предшественников. Установлено влияние различных анестезиологических пособий во время родов на количество и качество клеток образца пуповиннои крови. Выявлена зависимость между длиной теломер и колониеобразующей способностью гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови. Определено влияние различных способов криоконсервирования на сохранность длины теломер.
Показано, что условия хранения ПК влияют на сохранность гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови.
Практическая значимость работы. Установлено, что при отборе образцов пуповиннои крови донорскими банками пуповиннои крови необходимо учитывать такие факторы, как особенности течения родов, виды анестезиологического пособия, объем взятой пуповиннои крови. Изучено влияние условий криоконсервирования и хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови на их сохранность, выявлены факторы, снижающие сохранность клеток.
Внедрение в практику. Основные положения диссертации внедрены в практическую и научно-исследовательскую работу гематологической клиники ФГБУ Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии ФМБА России.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международной конференции «Сгуо2006», (24-27 июля 2006 года, Гамбург, Германия) и Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (17-19 октября 2006 года, Санкт-Петербург), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы диагностики и лечения опухолевых заболеваний кроветворной и лимфатической ткани» (19 - 20 апреля 2010 года, Санкт-Петербург).
Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно проведена работа по сбору фактического материала; предложена методика и разработаны критерии оценки пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови на всех этапах технологического процесса по сбору, криоконсервированию, хранению и размораживанию пуповиннои крови; произведена оценка способов выделения гемопоэтических стволовых клеток и определены оптимальные условия криоконсервирования и хранения. Проведена статистическая обработка результатов исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 6 в научно-практических журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописи, из них ПО станиц текста, и состоит из введения, обзора литературы, главы посвященной материалам и методам исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, а также списка литературы, содержащего 169
источников, из которых 41 отечественных и 128 зарубежных. Работа иллюстрирована 22 рисунками, 34 фотографиями и 10 таблицами.
Похожие диссертации на Исследование пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в зависимости от различных способов криоконсервирования и сроков хранения
![Жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови [Электронный ресурс]](/i/i/4492/185644.png "Жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови [Электронный ресурс] Абдуллаев Руслан Тагирович")
