Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Современное состояние вопроса криоконсервирования тромбоцитов (обзор литературы)
1.1 Современные методы замораживания донорских тромбоцитных концентратов 10
1.2 Криопротекторы для замораживания тромбоцитов 14
1.2.1 Криопротекторы внутриклеточного типа действия 15
1.2.2 Криопротекторы внеклеточного типа действия 17
1.2.3 Криопротекторы смешанного типа действия 18
1.3 Программы замораживания тромбоцитных концентратов 21
1.4. Оценка эффективности криоконсервирования тромбоцитных концентратов
ГЛАВА II Материалы и методы исследований 25
ГЛАВА III Разработка комбинированного криоконсерванта для замораживания тромбоцитов
3.1 Характеристика нативных тромбоцитных концентратов 29
3.2 Состав комбинированного криоконсерванта 32
3.3 Оценка физико-химических характеристик комбинированного криоконсерванта для замораживания тромбоцитов 33
3.4 Физико-химические свойства донорских тромбоцитных концентратов на этапе смешивания и экспозиции с растворами 35
3.5 Функциональные свойства донорских тромбоцитов после смешивания с криоконсервантами 37
3.6 Оценка хладоограждающей способности комбинированных растворов при замораживании тромбоцитных концентратов до температуры -80С 40
3.7 Биологические испытания криоконсерванта 42
3.8 Оценка стабильности ограждающего раствора при хранении 43
ГЛАВА IV Результаты криоконсервирования донорских тромбоцитных концентратов . 45
4.1 Сохранность свойств тромбоцитных концентратов при различных сроках низкотемпературного хранения 48
4.2 Хладоограждающая способность нового криоконсерванта в сравнении с раствором «Тромбокриодмац» 55
4.3 Результаты замораживания донорских тромбоцитных концентратов с новым криоконсервантом до -196С 56
Заключение 61
Выводы 67
Рекомендации по использованию выводов 68
Список литературы 69
- Криопротекторы внутриклеточного типа действия
- Оценка эффективности криоконсервирования тромбоцитных концентратов
- Физико-химические свойства донорских тромбоцитных концентратов на этапе смешивания и экспозиции с растворами
- Хладоограждающая способность нового криоконсерванта в сравнении с раствором «Тромбокриодмац»
Криопротекторы внутриклеточного типа действия
Современное состояние клинической трансфузиологии характеризуется применением заместительной гемокомпонентной терапии [1, 50]. В настоящее время все большее значение придается трансфузиям тромбоцитов [4, 27, 76, 78, 118, 119], особенно в условиях онкологических и гематологических отделений и клиник [3, 57]. Увеличение числа трансфузий кровяных пластинок диктует необходимость наличия запасов функционально полноценных клеток [17, 45, 57, 40, 108]. Создание резерва донорских ТК ограничено короткими сроками хранения указанного гемокомпонента. При положительных температурах (22±2С) с постоянным перемешиванием длительность консервирования ТК составляет 5 суток [33, 40, 47, 58, 60]. Короткие сроки сохранности трансфузионной среды определяют необходимость создания постоянных запасов кровяных пластинок. Однако, общепринятый способ хранения тромбоцитов обладает рядом недостатков. Во-первых, происходит «истощение» кровяных пластинок, что проявляется увеличением степени их активации и влечет за собой значительное снижение эффективности их трансфузий [109, 122]. Во-вторых, при температуре хранения 20 – 24С существенно возрастает риск роста бактерий и контаминации трансфузионной среды [70, 75, 95, 130]. В связи с указанными факторами предложены различные подходы к удлинению продолжительности хранения ТК при положительных температурах: хранение тромбоцитов при +4 +8С [90, 102], разработка плазмозамещающих сред и сбалансированных растворов [23, 68, 73, 74, 81, 93, 99, 100, 111], лиофилизация [77, 110, 121], а также применение специализированных контейнеров с повышенной газопроницаемостью [101, 116, 124]. Указанные методы позволяют увеличить срок консервирования тромбоцитов при положительных температурах до 7 – 12 суток [89, 129]. Однако они не нашли применения из-за ряда недостатков, присущих каждому методу.
Так, при хранении ТК при температурах +4 +6С дисковидные «покоящиеся» кровяные пластинки преобразуются в сферические формы [90], что является причиной быстрого выведения таких тромбоцитов из кровеносного русла после переливания. Применение плазмозамещающих сред не предотвращает истощения кровяных пластинок [74]. В связи с этим, предложенные методы увеличения сроков хранения донорских ТК не позволяют создать запас полноценной трансфузионной среды.
Современным способом увеличения продолжительности хранения кровяных пластинок является их замораживание [12, 24, 37, 40, 59, 62, 88]. Криоконсервирование дает возможность создавать запасы донорских ТК, в том числе типирванных по антигенам система НРА [49], а так же аутологичных тромбоцитов. Наличие банка криоконсервированных кровяных пластинок значительно облегчает обеспечение растущих потребностей клиник лечебными дозами кровяных пластинок, придает гибкость учреждениям службы крови в управлении ресурсами ТК.
В процессе замораживания клеток процессы их жизнедеятельности временно останавливаются или значительно затормаживаются, но после размораживания восстанавливаются [13, 96]. Для долгосрочного хранения клетки крови замораживают до низких (-80С) и ультранизких (-196С) температур [28, 31, 36, 37, 52, 59, 63, 64]. Необходимость применения указанных температурных режимов связана с тем, что только при таких условиях в клетках практически полностью прекращаются биохимические процессы. Однако при замораживании любых биообъектов необходимым условием является их защита от губительного воздействия низких температур. Для разработки эффективных способов защиты от низкотемпературного воздействия, необходимо выявить факторы, отрицательно влияющие на биологические объекты, и всесторонне изучить механизмы их действия. В настоящее время известно, что повреждение клетки при замораживании происходит в результате чрезмерных потерь клеточной воды и вследствие образования внутриклеточного льда [96, 105]. Интенсивность повреждающего эффекта кристаллов льда зависит от активности процессов кристаллизации и свойств образованных кристаллов. При умеренно низких температурах (-15 -20С) кристаллы льда увеличивают объем на 10%. По мере дальнейшего понижения температуры происходит сжатие ледяных структур. Уже при -20С объем льда равняется исходному объему воды, а при температуре -183С он составляет 2,6% от исходного.
Непосредственная механическая травма клеток внеклеточными кристаллами льда не наблюдалась. Клетки повреждаются из-за деформации их при захвате растущими кристаллами, а также сжатия в каналах, которые образуются между этими структурами [13].
При медленном замораживании процессы формирования льда во внеклеточном пространстве приводят к концентрированию солевых растворов, увеличению их осмотического давления и изменению рН среды [44]. В ответ на возникший осмотический градиент вода покидает клетки. Они теряют не только свободную воду, процент которой крайне мал (порядка 10%), но и жидкость, связанную с белковыми макромолекулами [39, 44, 67]. Дегидратация клетки и резкое уменьшение ее объема ниже критического уровня приводят к повреждению мембраны.
При быстром замораживании основным повреждающим фактором для клеток является формирование внутриклеточных кристаллов льда, оказывающих разрушительное воздействие на структуры клетки. Интенсивность повреждающего действия внутриклеточных кристаллов зависит от их формы, размеров, количества, скорости кристаллизации. Неоднократно отмечено, что внутриклеточные кристаллы могут вызывать как необратимые, так и обратимые повреждения в клетках [13].
Оценка эффективности криоконсервирования тромбоцитных концентратов
Оценка эффективности криоконсервирования ТК базируется на изучении количественной сохранности и функциональной полноценности клеток. Жизнеспособность тромбоцитов обычно исследуют с помощью комплекса разнообразных методов in vitro.
Метод подсчета тромбоцитов используется для оценки эффективности криоконсервирования, так как воздействие низких температур вызывает повреждение части клеток, вследствие чего в тромбоконцентратах после оттаивания снижается их общее количество. Однако при этом нельзя судить о характере повреждений кровяных пластинок и их морфологических изменениях.
С целью определения функциональной активности и устойчивости к замораживанию тромбоцитов под защитой протекторов изучаются такие их функции, как адгезия, агрегация, РГШ. Указанные показатели считаются информативными и адекватными критериями, косвенно характеризующими сохранность гемостатической функции тромбоцитов (адгезия и агрегация) и их способность циркулировать в кровяном русле после переливания (РГШ).
Адгезивная способность тромбоцитов обеспечивает начальную фазу гемостатических реакций, приводящих к образованию тромба, и тесно связана с ангиотрофической функцией [15, 32, 48, 103, 107, 125]. Агрегационная функция тромбоцитов довольно лабильна и является показателем функционального состояния мембран клетки [32, 48, 103, 125]. Средние величины степени аг регации до замораживания пластинок и после него дают приблизительную оценку сохранности поверхностной мембраны тромбоцитов. Обычно после криоконсервирования кровяных пластинок под защитой различных криофилактиков их агрегационная активность снижается [2, 24]. РГШ характеризует структурную целостность мембранных систем, состояние энергетического метаболизма, коррелирует с уровнем посттрансфузионной приживаемости клеток [98].
В заключение следует отметить, что оптимизация методов криоконсервирования тромбоцитов за счет применения в хладоограждающем растворе только одного криопротектора практически себя исчерпала. Создание многокомпонентных по составу криоконсервантов, а именно с использованием комбинаций проникающих и непроникающих в клетку криофилактиков, является актуальным и перспективным направлением в исследовании консервирования ТК путем замораживания.
Работа посвящена разработке комбинированного криоконсерванта для замораживания донорских тромбоцитов до -80 -196С на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) и диметилацетамида (ДМАЦ). Исследования выполнены в лаборатории консервирования крови и тканей, виварии и на станции переливания крови ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России».
Объектом исследования служили опытные образцы комбинированного криоконсерванта, основными компонентами которого являлись ГМБТОЭМ и ДМАЦ. Синтез ГМБТОЭМ был осуществлен на Кирово-Чепецком химкомбинате. В работе был использован ДМАЦ, произведенный ЗАО «ВЕКТОН», г. Санкт – Петербург.
Растворы криофилактика готовили в условиях стерильного бокса в лаборатории консервирования крови и тканей, стерилизовали автоклавированием (1,2 атмосферы – 30 минут). Контроль качества готовых растворов проводили визуально (отсутствие изменений внешнего вида растворов), физико-химическими методами (измерение рН растворов, осмолярности и криоскопической точки).
Осмолярность и температуру кристаллизации (криоскопическую точку) готовых образцов криофилактика, донорских ТК (нативных, в смеси с хладоограждающими растворами) определяли при помощи криоскопа ОМТ-5-01 по температуре (точке) переохлаждения раствора. Для определения показателя кислотности (рН) криоконсервирующих растворов и суспензий тромбоцитов использовали рН-метр – иономер «Эксперт-001».
Для проведения исследований использовали образцы тромбоцитных концентратов, полученных методом аппаратного тромбоцитафереза с использованием сепараторов клеток крови «MCS+» (Haemonetics) от 44 доноров. Смешивание ТК с раствором криоконсерванта проводили в соотношении 1:1 (по объему). Экспозиция с раствором криофилактика составляла до 15 минут.
Замораживание донорских ТК до -80С проводили в электрохолодильниках по экспоненциальной программе [31]. С целью хранения тромбоцитов в условиях ультранизких температур охлаждение биоматериала осуществляли в программном замораживателе PLANER INTEGRA со скоростью 3С/мин до -90С [21] с последующим переносом образцов в биохранилище.
Период наблюдения составил от 1 недели до 1 года. По окончанию срока хранения размораживание образцов ТК производили при +37 +38С в водяной ванне при постоянном перемешивании содержимого.
Подсчет количества тромбоцитов проводили в камере Горяева с определением концентрации кровяных пластинок (х109/л) [55]. Эффективность криоконсервирования ТК считали достаточной при количественной сохранности не менее 70% клеток [60]. Исследование функций тромбоцитов осуществляли непосредственно после выделения их из цельной крови, после 5 – 15 минут экспозиции с испытуемыми криоконсервантами перед замораживанием и сразу же после размораживания образцов ТК.
Функциональную активность тромбоцитов оценивали с помощью метода определения адгезивности к стеклу [16, 48]; индуцированную агрегацию тромбоцитов с АДФ (в концентрации 2,5 мкг/мл), адреналином (2,5 мкг/мл) – турбидиметрическим методом [15, 16] с использованием лазерного агрегометра «Биола» модели LA – 230. Агрегатограммы регистрировали в течение 10 минут после добавления индукторов агрегации. Учитывали максимальную величину светопропускания и средний радиус агрегатов.
Физико-химические свойства донорских тромбоцитных концентратов на этапе смешивания и экспозиции с растворами
Для подтверждения эффективности криоконсервирования донорских ТК с новым криоконсервантом провели сопоставление их количественной и качественной сохранности с аналогичными показателями тромбоцитов, замороженных с раствором «Тромбокриодмац» при сроке низкотемпературного хранения 1 год. В качестве сравнения приведены результаты, полученные К.В. Кузнецовым [31]. Данные в таблице 14 представлены в виде процентов от показателей нативных ТК.
Анализ результатов криоконсервирования ТК показал, что в случае применения обоих криоконсервантов, не выявлено статистически значимых различий в количестве размороженных кровяных пластинок, их способности к адгезии и агрегации под влиянием АДФ (критерий р 0,05).
Оба криоконсерванта обеспечивали сохранность тромбоцитов противостоять осмотической нагрузке после размораживания клеточной суспензии. Однако определена достоверно большая способность ТК к восстановлению оптической плотности суспензии кровяных пластинок, после замораживания с новым криоконсервантом (p 0,05). Наблюдаемое различие в способности размороженных кровяных пластинок к РГШ объясняется различной осмолярностью криоконсервантов и ТК в смеси с ними. Гиперосмолярность клеточной суспензии с раствором «Тромбокриодмац» (607,8±24,9 мосм/л) обусловливает меньшую резистентность тромбоцитов к гипотоническим условиям в РГШ. Напротив, ТК, смешанные с раствором №2, отличались изоосмолярностью, что, вероятно, и обеспечило больший уровень сохранности их способности к РГШ. Таким образом, комбинированный криоконсервант по своим криозащитным свойствам при замораживании ТК до температуры -80С не уступает раствору «Тромбокриодмац», а по показателю осмотической резистентности тромбоцитов превосходит его.
Помимо определения эффективности криоконсервирования донорских ТК при температуре -80С, изучили результаты их линейного замораживания до -196С. Охлаждение клеточной суспензии проводили в программном замораживателе Planer (рисунок 13) со скоростью 3С/мин до -90С [21]. График изменения температуры образцов биоматериала представлен на рисунке 14.
При изучении термограмм выявлено, что происходило незначительное (в пределах 1 - 1,5С) повышение температуры на этапе кристаллизации воды, продолжительность указанного интервала не превышала 2 минут. Поскольку период выброса рекристаллизационного тепла был кратковременным, повреждающее действие перестройки структур льда на клеточные структуры было минимальным [13]. При достижении температуры -90С образцы ТК переносили в биохранилище с жидким азотом (рисунок 15). Рисунок 15 – Биохранилище, заполненное жидким азотом
После 1 года хранения ТК при ультранизких температурах оценили количество тромбоцитов, их функциональные свойства и осмотическую резистентность. Данные представлены в таблице 15. Таблица 15 - Сохранность донорских ТК, хранившихся в течение 1 года при -196С (М±т,п = 15)
Анализ результатов программного замораживания тромбоцитов с новым криоконсервантом показал высокую количественную сохранность ТК (88,1±5,6%). В то же время отмечено незначительное снижение показателей агрегационной активности кровяных пластинок (в ответ на внесение АДФ - с 10,7±2,9% до 8,0±1,5% , на адреналин - от 15,7±5,4% до 12,8±4,3%), адгезии к стеклу (от 31,0±3,2 % до 20,8±4,5%). Выявлено сокращение среднего размера агрегатов с 4,5±1,3 до 2,5±0,4 (в случае индукции АДФ) и с 4,3±1,3 до 2,6±0,6 условных единиц (при индукции адреналином). Сохранность способности ТК к РГШ уменьшилась от 98,3±1,7% до 85,3±3,1%. Можно заключить, что, несмотря на некоторое снижение функциональных характеристик тромбоцитов, их активность осталась на высоком уровне (62,9 - 85,7% от значений нативных ТК).
Хладоограждающая способность нового криоконсерванта в сравнении с раствором «Тромбокриодмац»
При изучении физико-химических свойств образцов 6 вариантов растворов, включавших от 1 до 5% ГМБТОЭМ и от 1,25 до 4,5% ДМАЦ, определено, что осмолярность образцов консерванта варьировала от 184 до 750 мосм/л и зависела от концентрации ингредиентов раствора. Показатель кислотности криофилактика находился в пределах 5,6 – 6,0.
После смешивания ТК с криоконсервантами осмолярность, кислотность суспензии тромбоцитов и функциональные свойства клеток существенно изменялись в зависимости от варианта хладоограждающего раствора. Так, осмолярность ТК при смешивании с криоконсервантом № 1, содержащим наименьшие концентрации криопротекторных веществ, составила 246,2±8,6 мосм/л, а в случае раствора № 6 (наибольшие концентрации компонентов) возрастала до 541,0±23,0 мосм/л. Осмолярность ТК в смеси с раствором № 2, включавшим 2% ГМБТОЭМ и 1,75% ДМАЦ, оставалась на физиологическом уровне (299,9±11,3 мосм/л). Показатель кислотности ТК снижался от 7,1±0,1 (с раствором № 1) до 6,2±0,1(с образцом № 6).
После смешивания с ТК, их экспозиции со всеми растворами не обнаружено существенного влияния на количество клеток. Агрегационно – адгезионные функции кровяных пластинок в смеси с растворами №№ 4 – 6 определены в пределах от 20,4 до 69,1% и отличались в меньшую сторону в сравнении с растворами №№ 1 – 3 (42,2 – 84,0%). В связи с тем, что функциональная активность тромбоцитов в большей степени сохранялась при смешивании с консервантами №№ 1 – 3, замораживание донорских ТК проводили с указанными образцами криофилактика.
Сравнение качественной сохранности ТК, замороженных с растворами №№ 1 – 3, показало, что при недельном сроке низкотемпературного хранения образцы №№ 1 и 3 обеспечивали достоверно меньший уровень функциональной активности клеток по сравнению с раствором № 2. Лучшие показатели сохранности количества тромбоцитов и их функций обеспечивал консервант, включающий 2% ГМБТОЭМ и 1,75% ДМАЦ (образец № 2): количество тромбоцитов после размораживания составило 93,6±2,2%, агрегационная активность с АДФ – 67,9±11,8%, в ответ на адреналин – 82,7±11,7%, адгезионная способность к стеклу – 72,2±10,2%, а осмотическая резистентность – 86,3±7,6%. Указанный состав раствора был признан наиболее эффективным по своим физико-химическим характеристикам, воздействию на тромбоциты и хладоограждающим свойствам. В этой связи дальнейшие исследования проводили с криоконсервантом № 2.
При сроках низкотемпературного хранения ТК 1, 6 и 12 месяцев не выявлено достоверного изменения сохранности как количества тромбоцитов после размораживания (90,3 – 94,6%), так и степени их индуцированной агрегации (65,9 – 78,1%) и способности к РГШ (88,8 – 90,9%). Отмечено, что после 6 месяцев хранения достоверно снизилась сохранность среднего размера агрегатов в ответ на внесение АДФ (до 64,5±10,9% от исходных значений до замораживания). После 1 года консервирования кровяных пластинок при -80С значимо уменьшилась сохранность размера агрегатов при индукции адреналином (до 59,1±18,8% от показателей нативных ТК) и адгезионной способности к стеклу (до 63,5±6,1%).
Помимо низкотемпературного режима криоконсервирования ТК, изучили количественные и функциональные свойства тромбоцитов, замороженных с новым криоконсервантом по линейной программе до ультранизких температур (-196С). После 1 года жидкоазотного хранения концентраты кровяных пластинок характеризовались высокой количественной сохранностью (88,1±5,6%). Функциональная активность и осмотическая резистентность тромбоцитов после размораживания зарегистрированы в пределах 62,9 – 85,7% от уровня нативных клеток. При сопоставлении результатов хранения ТК в течение 1 года при температурах -80С и -196С не выявлено достоверных различий как по количеству, так и по качественным характеристикам клеток.
Полученные результаты низкотемпературного (-80С) хранения ТК с новым криоконсервантом в течение 1 года сопоставили с аналогичными показателями тромбоцитов, замороженных с раствором «Тромбокриодмац». При этом не выявлено достоверных отличий в количестве клеток после размораживания и в их функциональных свойствах. Однако осмотическая резистентность кровяных пластинок при криоконсервировании с комбинированным хладоограждающим раствором оказалась достоверно выше, чем при использовании раствора «Тромбокриодмац».
Определение биологических свойств новой хладоограждающей среды (аномальная, хроническая токсичность), проведенное на белых лабораторных мышах, показало, что криоконсервант проявляет низкие токсические свойства. При оценке гистологических препаратов не выявлено существенных морфологических изменений внутренних органов лабораторных животных (сердце, печень, почки, головной мозг) на фоне многократного введения препарата.
Оценка стабильности свойств криофилактика (рН, осмолярность) при хранении в условиях температуры +4 +6С показала, что по истечению 2 лет с момента приготовления криоконсерванта его физико-химические свойства достоверно не отличались от аналогичных параметров свежих образцов. Хладоограждающий раствор является стабильным по показателям рН и осмолярности при длительном хранении.
Итак, на основании проведенных комплексных лабораторных и биологических исследований установлено, что разработанный комбинированный криоконсервирующий раствор не оказывает существенного влияния на тромбоциты крови человека на этапах смешивания и экспозиции. Новый криофилактик обеспечивает высокую количественную и функциональную сохранность ТК при их замораживании, хранении в течение 1 года и последующем оттаивании.
![Лечение открытой травмы поджелудочной железы с применением воздействия сверхнизких температур (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4508/203395.png "Лечение открытой травмы поджелудочной железы с применением воздействия сверхнизких температур (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Мусин Валерий Маратович")
