Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 6
1.1 .Ревматические болезни и их место в структуре общих заболеваний 6
1.2. Поиск новых биологически активных веществ противовоспалительного действия 8
1.3. Использование НПВП в лечении ревматических болезней и заболеваний опорно-двигательного аппарата 14
1.4. Современные успехи и достижения в области создания ЛФ для наружного применения 18
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Объекты исследования 32
2.1.1. Вспомогательные вещества 33
2.1.2. Приборы и оборудование 37
2.1.3. Используемые животные в экспериментах 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Изучение физико-химических свойств мелоксикама 40
2.2.1.1. Изучение растворимости мелоксикама 40
2.2.1.2. Термогравиметрический анализ (ТГА) 41
2.2.1.3. Изучение процесса набухания структурообразователя 42
2.2.2. Изучение структурно-механических показателей гелей и мазей мелоксикама 44
2.2.3. Количественное определение мелоксикама 45
2.2.3.1. Метод ВЭЖХ для количественного определения мелоксикама в субстанции, в гелях и мазях 46
2.2.3.2. Определение идентифицируемых примесей в ЛФ мелоксикама 49
2.2.3.2. Метод УФ-спектрофотометрии для определения мелоксикама в субстанции, в гелях и мазях 51
2.2.4. Биофармацевтические исследования по высвобождению мелоксикама из гелей и мазей 53
2.2.4.1. Метод диффузии в агаровый гель 53
2.2.4.2. Метод равновесного диализа через полупроницаемую мембрану 55
2.2.5. Определение стабильности гелей и мазей мелоксикама 56
2.2.6. Определение рН исследуемых образцов мазей 57
2.2.7. Микробиологические исследования мелоксикама в гелях и мазях 58
2.2.8. Биологические методы исследования мелоксикама и его ЛФ для наружного применения 58
2.2.8.1. Токсикологическая оценка мелоксикама 58
2.2.8.2. Оценка специфического действия гелей и мазей мелоксикама 63
ГЛАВА 3. Разработка и исследовали геля мелоксикама 66
3.1. Изучение факторов, влияющих на структурообразование гелей 66
3.1.1. Изучение влияния температурного фактора на субстанцию мелоксикама 67
3.1.2. Изучение растворимости мелоксикама 68
3.1.3. Изучение набухающей способности полимера 70
3.1.4. Подбор вспомогательных веществ для разработки геля мелоксикама 74
3.2. Изучение реологических свойств гелей мелоксикама 77
3.3. Количественное определение мелоксикама в геле 81
3.3.1. Определение идентифицируемых примесей 89
3.4. Изучение высвобождения мелоксикама из геля 93
3.4.1. Оценка высвобождения мелоксикама из геля методом диффузии в агаровый гель 94
3.4.2. Оценка высвобождения мелоксикама из геля методом равновесного диализа 95
3.5. Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в геле мелоксикама 99
3.6. Изучение стабильности геля мелоксикама в процессе хранения 102
3.7. Обоснование состава и технологии 1% геля мелоксикама 105
3.8. Описание технологического процесса 109
Выводы по главе 115
ГЛАВА 4. Разработка и исследование мазимелоксикама 116
4.1. Подбор вспомогательных веществ для разработки мази мелоксикама.. 116
4.2. Изучение реологических свойств мазей мелоксикама 120
4.2.1. Оценка влияния мазевой основы на реологические свойства мазей.. 123
4.3. Количественное определение мелоксикама в мази 124
4.3.1. Определение примесей в мази мелоксикама 130
4.4 Изучение высвобождения мелоксикама из мази 131
4.4.1. Оценка высвобождения мелоксикама из мази методом диффузии в агаровый гель 132
4.4.2. Оценка высвобождения мелоксикама из мазей методом равновесного диализа 133
4.5. Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в мази мелоксикама 136
4.6. Изучение стабильности мази мелоксикама в процессе хранения 139
4.7. Обоснование состава и технологии 1 %мази мелоксикама 142
4.8. Описание технологического процесса мази мелоксикама 145
Выводы по главе 146
ГЛАВА 5. Биологические и микробиологические методы исследования лекарственных форм мелоксикама 147
5.1. Токсикологические исследования мелоксикама и его ЛФ 148
5.1.1. Оценка острой токсичности мелоксикама 148
5.1.2. Оценка хронической токсичности мелоксикама 151
5.1.3. Оценка токсичности мелоксикама при нанесении на кожу 152
5.1.4. Оценка местно-раздражающего действия мелоксикама 152
5.1.5. Оценка эмбриотоксического, тератогенного действия мелоксикама.. 153
5.2. Исследования на специфическую активность мелоксикама и его ЛФ 156
5.2.1. Оценка специфической активности геля и мази мелоксикама на модели каррагенинового отека 157
5.2.2. Оценка специфической активности геля и мази мелоксикама на модели формалинового отека 162
5.2.3. Оценка специфической активности геля и мази мелоксикама на модели ультрафиолетовой эритемы 167
5.3. Микробиологические исследования ЛФ мелоксикама 171
Выводы по главе 174
Общие выводы 175
Список литературы 177
- Использование НПВП в лечении ревматических болезней и заболеваний опорно-двигательного аппарата
- Метод ВЭЖХ для количественного определения мелоксикама в субстанции, в гелях и мазях
- Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в геле мелоксикама
- Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в мази мелоксикама
Введение к работе
Актуальность темы. Воспалительный процесс является ведущим патогенетическим звеном многих заболеваний, в том числе и ревматических болезней (РБ) и заболеваний опорно-двигательного аппарата, составляющие около 80% патологии в практике врача любой специальности. Современная медицина обладает широким арсеналом лекарственных средств (ЛС) противовоспалительного действия, однако наряду с благоприятным фармакологическим действием и достаточной степенью клинической эффективности, все они вызывают ряд нежелательных побочных реакций [Сигидин Я.А., 2001; Исаков В.А., 2005; Насонов Е.Л., 2005]. В связи с этим актуальным является поиск высокоэффективных ЛС, подавляющих воспа-ление и обладающих минимальными побочными реакциями. Одним из подходов является изыскание нестероидных противовоспалительных препа-ратов (НПВП) среди производных 1,2-бензотиазина, обладающих селектив-ностью к циклооксигеназе-2 (ЦОГ-2), в результате чего снижается синтез простагландинов и степень образования свободных кислородных радикалов. К подобным относится мелоксикам, отличающийся от других ЛС высокой эффективностью и безопасностью в применении. Обладая 20-ти кратной селективностью к ЦОГ-2 по сравнению с ЦОГ-1, мелоксикам, положительно воздействует на метаболизм гиалинового хряща и характеризуется наличием у него хондропротективных свойств.
На сегодня среди лекарственных форм (ЛФ) мелоксикама на фарма-цевтическом рынке России известными являются ЛФ для перорального и парентерального применения. Надо сказать, что мелоксикам хорошо прони-кает в синовиальную жидкость, а это является показателем того, что ЛВ способствует подавлению воспалительного процесса в тканях сустава, в связи с чем рационально его использовать в ЛФ для наружного применения.
Отсутствие отечественных ЛФ противовоспалительного действия для наружного применения с мелоксикамом указывают на целесообразность их создания.
Цель работы. Разработать и исследовать ЛФ мелоксикама для наружного применения.
Для достижения цели планировалось решить следующие задачи:
- экспериментально и теоретически обосновать состав и разработать технологию геля и мази мелоксикама для лечения РБ и заболеваний опорно- двигательного аппарата;
- исследовать физико-химические, реологические, технологические и биофармацевтические свойства разработанных ЛФ мелоксикама;
- разработать методики качественного и количественного определения мелоксикама в субстанции, в геле и мази для оценки биофармацевтических показателей;
- провести биологические исследования по оценке токсичности, местно-раздражающего действия и специфической активности разработанных ЛФ мелоксикама для наружного применения;
- разработать и составить НД на 1% гель и мазь мелоксикама.
Научная новизна. Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность создания противовоспалительных ЛС мелоксикама для наружного применения: 1% геля на основе карбопола и 1% мази на полиэтиленгликолевой (ПЭГ) основе для лечения РБ и заболеваний опорно-двигательного аппарата;
Методом термогравиметрии определены значения температур при которых мелоксикам проявляет термоустойчивость как в субстанции, так и в ЛФ для наружного применения: 1% геле и 1% мази. Физико-химическими и технологическими методами подобраны оптимальные растворители, способствующие увеличению растворимости мелоксикама и перехода его из раствора в основу-носитель. Структурно-механическими методами исследования установлены оптимальные реологические параметры (эффективная вязкость, напряжение сдвига, тиксотропность) 1% геля и 1% мази мелоксикама. Биофармацевтическими методами показано, что высвобождение мелоксикама из 1% геля и 1% мази носит пролонгированный характер и описывается уравнением Хигучи, определяющего линейную зависимость количества высвобождаемого ЛВ от времени высвобождения.
Методами ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии разработаны методики идентификации и количественного определения мелоксикама в субстанции, а также в 1% геле и 1% мази. Микробиологическими методами анализа выявлено оптимальное соотношение консервантов в составе 1% геля и 1% мази мелоксикама, обеспечивающих их микробную чистоту в соответствии с требованиями ГФ XII-го издания. Исследована стабильность 1% геля и 1% мази мелоксикама в процессе естественного и ускоренного хранения.
По результатам исследования подана заявка на изобретение “Средство для лечения болезней суставов”, получена приоритетная справка (рег. № 2010102763 от 27.01. 2010 г.).
Практическая значимость работы. На основании экспериментально-теоретических исследований разработаны ЛС мелоксикама для наружного применения – 1% гель и 1% мазь с противовоспалительной активностью. Предложены технологические схемы их производства.
В результате исследований разработаны нормы качества 1% геля и 1% мази мелоксикама по показателям внешний вид, подлинность, примеси, количественное содержание, pH, микробная частота.
На основании проведенных исследований разработаны лабораторные регламенты и проекты ФСП на производство препарата «Мелоксикам гель для наружного применения 1%» и «Мелоксикам мазь для наружного применения 1%», подтвержденные актами внедрения и апробированные на ЗАО «Казанская фармацевтическая фабрика» (г. Казань).
Апробации работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы на ХIII-й, XIV-й и XV-й Всероссийской научной конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008-2010 гг.); на 2-й Региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых БАС» (Казань, 2009); на 1-й Республиканской научной конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фар-мацевтических кадров» (Казань, 2009). Материалы опубликованы на XVI-м и XVII-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009-2010 гг.); на научной конференции биохимиков «История и достижение Казанской биохимической школы» (Казань, 2009); на 65-й Региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010); на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010); на 44-й Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 печатных работ (3 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Казанского государственного медицинского университета» по проблеме «Фармакология и фармация» (№ государственной регистрации темы - 01200962875).
Положения, выносимые на защиту:
- Результаты изучения физико-химических, реологических, технологических и биофармацевтических показателей, а также результаты фармакологической оценки специфической активности и микробиологического исследования 1% геля и 1% мази мелоксикама при наружном применении.
- Результаты изучения влияния природы вспомогательных веществ (ВВ) на растворимость и высвобождение мелоксикама из гелей и мазей.
- Результаты экспериментального обоснования составов, а также показатели и нормы качества 1% геля и 1 % мази мелоксикама.
- Технологические схемы производства 1% геля и мази с мелоксикамом.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 204 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (3-5 главы), выводов и приложения. Работа иллюстрирована 29 таблицами, 41 рисунками. Библиографический указатель включает 176 источника (137 отечественных и 39 иностранных авторов).
Использование НПВП в лечении ревматических болезней и заболеваний опорно-двигательного аппарата
В 1827 г. из коры ивы, жаропонижающее действие которой было известно с давних пор, был выделен гликозид салицин, из которого была получена салициловая кислота, а позже из нее была синтезирована ацетилсалициловая кислота (АСК) [175]. В настоящее время имеется большой арсенал НПВП, а в практике используется для лечения более 1000 ЛС, созданных на их основе.
Классификация НПВП (по химической структуре и активности представлены ниже в таблице 1. Большая "популярность" НПВП объясняется тем, что они обладают противовоспалительным, противоотечным и жаропонижающим эффектами и приносят облегчение больным с соответствующими симптомами (боль, отек, воспаление, лихорадка), которые отмечаются при РБ [70,134].
Особенностью современных НПВП является многообразие ЛФ, в том числе для местного применения в виде мазей, гелей, спреев, суппозиториев и ЛФ для парентерального введения [77,108,129].
Большинство препаратов группы НПВП относятся по современной терминологии, к "кислотным" противовоспалительным, названным так, потому, что они являются производными органических кислот и сами являются слабыми кислотами с рН=4,0. Некоторые авторы придают указанной величине рН большое значение, считая, что это способствует накоплению этих соединений в очаге воспаления [32,52,159]. По продолжительности действия НПВП подразделяются на: 1) короткого действия с периодом полувыведения (Т]/2) - 2-8 часов (ибупрофен, кетопрофен, индометацин, фенопрофен, вольтарен; фенаматы и др.); 2) средней продолжительности действия с Ті/2 - 10-20 часов (напроксен; сулиндак; дифлюнизал); 3) длительного действия с Тщ - 24 и более часов (оксикамы; фенилбутазон) [68,70].
В последние годы было показано, что существует два изофермента ЦОГ, ингибируемые НПВП. Так ЦОГ-1 — контролирует выработку ПГ, регулирующих целостность слизистой оболочки ЖКТ, функцию тромбоцитов и почечный кровоток, а ЦОГ-2 — участвует в синтезе ПГ при воспалении. Причём ЦОГ-2 в нормальных условиях отсутствует и образуется под действием некоторых тканевых факторов, инициирующих воспалительную реакцию (цитокины и др.). В связи с этим предполагается, что противовоспалительное действие НПВП обусловлено ингибированием ЦОГ-2, а их нежелательные реакции - ингибированием ЦОГ-1 [150,152,163]. Соотношение активности НПВП в плане блокирования ЦОГ-1 и ЦОГ-2 позволяет судить об их потенциальной токсичности. Чем меньше эта величина, тем более селективен препарат в отношении ЦОГ-2 и, тем самым, менее токсичен. Например, для мелоксикама она составляет 0,33, диклофенака - 2,2, теноксикама - 15, пироксикама - 33, индометацина - 107 [66,105]. Анальгезирующий эффект НПВП, в большей степени, проявляется при болях слабой и средней интенсивности, которые локализуются в мышцах, суставах, сухожилиях, нервных стволах, а также при головной или зубной боли [133,135].
Несмотря на то, что диклофенак считается «золотым стандартом» в лечении РБ и заболеваний ОДА и именно с его действием сравнивают эффективность вновь создаваемых ЛС, все же в последнее десятилетие, клиницистами выявлено, что одним из наиболее безопасных лекарственных веществ (ЛВ) является мелоксикам, который с 2003 г. вошел в повседневную практику ревматологов в виде ЛФ по 15 мг в ампулах для внутримышечного введения, что существенно расширило возможности достижения быстрого обезболивающего и противовоспалительного эффекта при лечении больных с РБ и заболеваниями ОДА [66,102,148].
Мелоксикам является производным 1,2-бензотиазина группы оксикамов. Как и все другие НПВП, обладает противовоспалительным, анальгетическим и антипирическим действием. Более 99,5% поступившего в организм мелоксикама связывается с белками. Мелоксикам обнаруживается и в синовиальной жидкости, а это является показателем того, что ЛВ способствует подавлению воспалительного процесса в тканях сустава. Т\/2 мелоксикама составляет 20 часов, что делает возможным его однократный прием на протяжении суток [145,148,150]. Терапевтическая эффективность и безопасность мелоксикама изучена в многочисленных исследованиях [150,154,173]. Достаточно высокая клиническая эффективность мелоксикама продемонстрирована у больных РА, анкилозирующим спондилоартритом, остеоартрозом и при заболеваниях, основным проявлением которых являются боли в нижней части спины [143]. По эффективности мелоксикам не уступал таким традиционным НПВП, как диклофенак, напроксен и пироксикам [146,149]. Хорошие результаты лечения мелоксикамом были отмечены и у больных анкилозирующим спондилоартритом в долгосрочном 12-ти месячном исследовании. По терапевтической активности мелоксикам в дозе 15 мг не уступал пироксикаму в дозе 20 мг. Повышение дозы мелоксикама до 22,5 мг/сут не сопровождалось нарастанием противовоспалительного и анальгетического действия [132]. Целесообразность введения мелоксикама в комплексную терапию РБ и заболеваний ОДА диктуется 2 обстоятельствами - хорошей переносимостью препарата и его положительным действием на метаболизм гиалинового хряща, являющегося первичным и основным плацдармом развития патологического процесса при этом заболевании [18,174]. Мелоксикам лишен кардиотоксичности, присущей некоторым селективным ингибиторам ЦОГ-2.
Метод ВЭЖХ для количественного определения мелоксикама в субстанции, в гелях и мазях
При выборе метода количественного определения мелоксикама руководствовались следующими показателями: точность, специфичность, избирательность, воспроизводимость, доступность и экономичность. Этим требованиям в наибольшей степени отвечает метод обращено-фазной ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием [35,122]. В процессе работы нами была выполнена оптимизация пробоподготовки и хроматографических условий разделения мелоксикама.
Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы «Shimadzu» (Япония), состоящим из насоса для создания градиента высокого давления (LC-20AB), термостата колонок (СТО-20А), инжектора «Реодайн», вакуум-дегазатора и УФ-детектора на диоидной матрице (SPD-M 20А). Обработку данных хроматограмм осуществляли на персональном компьютере с помощью программного обеспечения LC Solution ver. 1.22. Разделение компонентов проводили на хроматографической колонке с обращенной фазой Symmetry СІ8 (150 mm 4,6 mm, 5 men) с предколонкой Symmetry С 18 (20 mm-3,9 mm, 5 men). Подвижная фаза, состоящая из канала А представлена 0,5% раствором ортофосфорной кислоты в воде и канала В -представляющего собой смесь ацетонитрила с метанолом в соотношении 50/50 (об.) Работа насоса осуществлялась в режиме прямолинейного градиента, где содержание элюента В в смеси менялось от 30% до 60% в течение 10 минут. Далее использовали изократический режим в течение 10 минут при соотношении элюентов А/В = 40/60. Время уравновешивания колонки между циклами хроматографирования составляло 7 минут, при начальном соотношении элюентов (А/В = 70/30). Скорость потока составляла 1 мл/мин, температура термостата колонки - 40 С, объем вводимой пробы -20 мкл.
В хроматографическую колонку последовательно вводили по 20 мкл стандартных растворов метилпарабена, пропилпарабена и мелоксикама, а также растворов испытуемых образцов гелей и мазей мелоксикама. Время анализа составило 20 минут. Каждый раствор вводили не менее 3-х раз.
Приготовление испытуемого раствора геля (мази) мелоксикама: Около 0,5 г геля или мази мелоксикама (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 50 мл, добавляли 5 мл диметилформамида и 5 мл воды для хроматографии, перемешивали до однородного состояния (при необходимости колбу помещали в ультразвуковую ванну на 2-3 минуты). Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии, перемешивали. Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр 0,45 мкм.
Приготовление стандартного раствора метилпарабена, пропилпарабена и мелоксикама: Около 0,0188 г стандартного образца метилпарабена и 0,0063 г стандартного образца пропилпарабена (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли туда же 5 мл диметилформамида, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии и перемешивали (раствор А).
Около 0,0100 г стандартного образца мелоксикама (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли туда же 5 мл диметилформамида и 2 мл раствора А, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии и перемешивали (раствор В). Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр 0,45 мкм.
Содержание мелоксикама в 100 г мази или геля рассчитывали по формуле 6: ,где Sx - средняя площадь пика мелоксикама на хроматограмме испытуемого раствора, ast - навеска стандартного образца мелоксикама, г Sst - средняя площадь пика мелоксикама на хроматограмме стандартного раствора, ах - навеска мази или геля, г.
Содержание метилпарабена и пропилпарабена в 100 г мази или геля мелоксикама рассчитывали по формуле 7 : ast - навеска стандартного образца метилпарабена (пропилпарабена), г Sst - средняя площадь пика метилпарабена (пропилпарабена) на хроматограмме стандартного раствора, ах - навеска мази или геля, г.
Данная методика позволяет определять такие показатели, как подлинность, количественное содержание компонентов и содержание посторонних примесей. Достоверность результатов доказывали установлением пригодности хроматографической системы, отраженных в таблице 2.
В процессе разработки методики количественного определения мелоксикама в субстанции и его ЛФ - в гелях и мазях также снимали спектры поглощения самого мелоксикама и консервантов (метилпарабен и пропилпарабен) и определяли максимумы поглощения этих веществ. Дальнейшее количественное определение мелоксикама и консервантов проводили при длинах волн, соответствующих их максимумам поглощения. Результаты количественного определения мелоксикама, его спектры поглощения и хроматограммы как в субстанции, так и в гелях и мазях представлены в главах 3 и 4.
Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в геле мелоксикама
Приготовление стандартного раствора метилпарабена, пропилпарабена и мелоксикама: Около 0,0188 г стандартного образца метилпарабена и 0,0063 г стандартного образца пропилпарабена (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли туда же 5 мл диметилформамида, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии и перемешивали (раствор А).
Около 0,0100 г стандартного образца мелоксикама (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли туда же 5 мл диметилформамида и 2 мл раствора А, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии и перемешивали (раствор В). Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр 0,45 мкм.
Содержание мелоксикама в 100 г мази или геля рассчитывали по формуле 6: ,где Sx - средняя площадь пика мелоксикама на хроматограмме испытуемого раствора, ast - навеска стандартного образца мелоксикама, г Sst - средняя площадь пика мелоксикама на хроматограмме стандартного раствора, ах - навеска мази или геля, г.
Содержание метилпарабена и пропилпарабена в 100 г мази или геля мелоксикама рассчитывали по формуле 7 : ast - навеска стандартного образца метилпарабена (пропилпарабена), г Sst - средняя площадь пика метилпарабена (пропилпарабена) на хроматограмме стандартного раствора, ах - навеска мази или геля, г. Данная методика позволяет определять такие показатели, как подлинность, количественное содержание компонентов и содержание посторонних примесей. Достоверность результатов доказывали установлением пригодности хроматографической системы, отраженных в таблице 2. В процессе разработки методики количественного определения мелоксикама в субстанции и его ЛФ - в гелях и мазях также снимали спектры поглощения самого мелоксикама и консервантов (метилпарабен и пропилпарабен) и определяли максимумы поглощения этих веществ. Дальнейшее количественное определение мелоксикама и консервантов проводили при длинах волн, соответствующих их максимумам поглощения. Результаты количественного определения мелоксикама, его спектры поглощения и хроматограммы как в субстанции, так и в гелях и мазях представлены в главах 3 и 4. При разработке метода количественного содержания ЛВ как в субстанции, так и в его ЛФ, важным является и определение чистоты препарата и его качественного состава. И прежде всего, необходимым является идентификация примесей мелоксикама. Для чего нами и использовался метод ВЭЖХ. Методика определения идентифицируемых примесей была такая же, как и в случае определения количественного содержания мелоксикама как в субстанции, так и в его ЛФ для наружного применения. Условия хроматографирования представлены и описаны выше. В первую очередь снимали спектры поглощения примеси А (этил-4-П1Дрокси-2-метил-2Н-1,2-бензотиазин-3-карбокилат1,1-диоксид) и примеси Б (2-амино-5-метил-тиазол), представленные в главах 3 и 4, а затем определяли максимумы поглощения этих веществ. Дальнейшее количественное определение примесей проводили при длинах волн, соответствующих их максимумам поглощения. Для определения времен удерживания примесей хроматографировали смесь стандартов действующего вещества- мелоксикама, консервантов (метилпарабена и пропилпарабена) и примесей А и Б. Далее хроматографировали раствор сравнения и испытуемый раствор при 260 и 350 нм. Испытуемый раствор: около 0,5 г геля или мази (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 50 мл, добавляли 5 мл диметилформамида и 5 мл воды для хроматографии, перемешивали до однородного состояния (при необходимости колбу помещали в ультразвуковую ванну на 2-3 минуты). Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии, перемешивали. Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор сравнения: около 0,0100 г стандартного образца мелоксикама (т.н.) отвешивали в мерную колбу на 100 мл, добавляли 5 мл диметилформамида, перемешивали до растворения. Доводили содержимое колбы до метки водой для хроматографии, перемешивали (раствор А). 0,1 мл раствора А отмеривали в мерную колбу на 100 мл и доводили водой до метки (0,1 мкг/мл). Полученный раствор отфильтровывали через мембранный фильтр 0,45 мкн. Приготовленные растворы сравнения и для испытаний вводили с помощью шприца в хроматографическую систему хроматографа при условиях, описанных выше. Определяли времена удерживания и рассчитывали площади пиков примесей. Содержание посторонних примесей рассчитывали согласно ФС 42-0254-07 «Мелоксикам» [26]. Площадь примеси А на хроматограмме испытуемого раствора при 350 нм должна быть не более площади пика мелоксикама на хроматограмме раствора сравнения при 350 нм (не более 0,1% примеси А), площадь пика примеси В на хроматограмме испытуемого раствора при 260 нм должна быть не более площади пика мелоксикама на хроматограмме раствора сравнения при 350 нм (не более 0,1%).
Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в мази мелоксикама
Оценку эмбриотоксического и тератогенного действия мелоксикама проводили в соответствии с НД [127].
В опытах было использовано 20 самок белых крыс массой 200-220 г. Животных разделили на 2 группы по 10 крыс в каждой. Вечером самок подсаживали к самцам и на следующий день утром исследовали мазок из их влагалища. День обнаружения спермиев в мазке у крыс считали за первый день беременности. Первой опытной группе вводили суспензию из мелоксикама и 2% крахмальной слизи в соотношении 1:10 внутрижелудочно один раз в сутки в дозе 0,6 мл. Вторая группа животных была контрольной. Им вводили ту же суспензию без добавления ЛВ в той же дозе. Мелоксикам вводили на протяжении всего периода беременности. Эмбриотоксическое действие устанавливали после эвтаназии по 3 самки из каждой групп крыс на 12 день беременности и подсчетом в матке живых и мертвых плодов, а в яичнике желтых тел. Плоды взвешивали, осматривали, определяли размеры плодов. Остальных самок оставляли до рождения. Новорождённых крысят также взвешивали, осматривали, определяли размеры плодов. Для выявления нарушений постнатального периода развития крысят как опытной, так и контрольной групп каждые 10 суток их взвешивали, регистрировали сроки отлипания ушей, появления шерстного покрова, прозрения и прорезывания резцов. Показатели предимплантационной, постимплантационной гибели эмбрионов и общей эмбриональной смертности (%) вычисляли по формулам (13-15): 1) ПРЕДИМП = (ЖТ - МИ) / ЖТ 100 % (13) , где:
Большое значение имеет изучение эффективности ЛВ при патологических состояниях, поэтому важным этапом в разработке ЛФ мелоксикама для наружного применения является изучение их специфической активности, которое включает оценку действия противовоспалительного, выполняемую на различных моделях.
Исследования проводили на белых крысах весом 180-200 г на моделях: каррагенинового и формалинового отека и ультрафиолетовой эритемы. Эксперименты на животных проводили с учётом суточных и сезонных ритмов преимущественно в осенне-зимний период. Крысы содержались в виварии ГОУ ВПО «КГАВМ им. Н.Э. Баумана» при t = 18-20 С со свободным доступом к воде. Кормление животных осуществлялось 1 раз в день. В ходе экспериментов обязательным условием было гуманное обращение с животными [44].
Изучение противовоспалительной активности ЛФ мелоксикама для наружного применения - гелей и мазей проводили в условиях «in vivo» на 84 беспородных белых крысах, на моделях острого воспаления (каррагенино-вый и формалиновый отёк) согласно НД [123]. Всего было исследовано 9 ЛФ мелоксикама для наружного применения с содержанием в них мелоксикама 0,5%, 1% и 2% на различных носителях (на основе карбопола, на основе гидроксиэтилцеллюлозы (ТЭЦ) и полиэтиленгликолевой (ПЭГ) основе). В качестве препарата сравнения использовали 1% гель диклофенака - натрия производства «Hemophann» (Югославия). Для этого были отобраны 14 групп крыс по 6 животных в каждой группе (13 - опытных и 1 - контрольная).
На первом этапе оценку влияния ЛФ мелоксикама для наружного применения на острое экссудативное воспаление проводили на моделях каррагенинового и формалинового отека лапы у крыс. При исследовании формалинового или каррагенинового отёка все животные были разделены на 14 групп по 6 крыс в каждой группе, из них 13 групп составляли опытные животные и 1 - контрольная группа. При исследовании УФ- эритемы были использованы белые крысы: 14 групп по 6 животных в каждой группе (16 -опытных и 1 - контрольная). Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили субплантарным введением 0,1 мл 1 % раствора каррагенина. В случае модели «формалинового отека» вводили в полость коленного сустава опытных крыс 0,1 мл 2 % раствора формалина. Анализируемые ЛФ мелоксикама для наружного применения наносились на лапу (втирая и накладывая сверху пластырь с марлей) непосредственно после введения раствора каррагенина или формалина. Выраженность отека оценивали в динамике через 3,4 и 5 часов после индукции воспаления по степени уменьшения прироста отека лапы по сравнению с контролем.
Адекватным методом оценки противовоспалительного действия разработанных ЛФ мелоксикама является метод УФ -эритемы. Методика: острую воспалительную эритему у белых крыс обоего пола массой 180-200 г вызывали облучением УФ - лучами участка кожи спины (4x4 см), лишённого шерсти за 1 сутки до проведения опыта. В качестве источника УФ облучения использовали люминесцентную ртутно-кварцевую лампу (длина волны 300 нм). Облучение осуществляли на расстоянии 3 см в течение 5 минут. Выраженность эритемы и отёка кожи оценивали через 4 часа после воздействия УФ лучей по 4-х бальной шкале. Опытным животным (крысам) на правую сторону выстриженного участка наносили ЛФ мелоксикама (гели и мази) с оценкой данного эксперимента для профилактического и лечебного применения данных ЛФ мелоксикама. При профилактическом применении гели и мази мелоксикама наносились на кожу животных до облучения, а при лечебном применении ЛФ мелоксикама, наносились после облучения. В контроле крысам ничего не наносилось. Результаты оценки влияния ЛФ мелоксикама для наружного использования на модели ультрафиолетовой эритемы у крыс представлены в главе 5.
Статистическую обработку всех материалов исследования осуществляли с помощью методик, описанных в [11] и пакета прикладных программ Excel 2007 с вычислением средней арифметической ошибки, критерия Стьюдента, при этом различия считались достоверными при р 0,05 [24].
