Введение к работе
Актуальность проблемы
В современной гематологии диагностика лимфо- и миелопролиферативных заболеваний, а также уточнение их варианта и прогноза немыслимы без иммунофенотипирования клеток крови. В настоящее время в клинической практике предпочтение отдается методу проточной цитометрии, поскольку он характеризуется высокой воспроизводимостью и использованием методик, поддающихся стандартизации (Льюис С.М., 2009; Кишкун А.А., 2007; Козинец Г.И., 2006; Тупицын Н.Н., 2006, 2010).
Определенными ограничениями данного метода являются небольшой набор одновременно определяемых антигенов, необходимость использования дорогостоящего оборудования (Козинец Г.И., 2006) и достаточно высокий расход антител. Все это приводит к высокой стоимости подобных исследований и ограничивает их проведение
Перспективным путем решения указанных проблем может стать разработка и внедрение новых диагностических in vitro тест-систем на базе иммунологических биочипов (иммунобиочипов). Их использование позволяет во много раз сократить расход каждого вида антител при проведении анализа и многократно снизить стоимость исследования. Как правило, биочип данного класса представляет собой подложку, на поверхности которой иммобилизованы молекулы антител, специфичных к поверхностным антигенам изучаемых клеток. С помощью подобных биочипов можно одновременно определить множество различных поверхностных антигенов на разных клетках. Возможно также определение коэкспрессии антигенов (Belova L. et al., 2003).
Представляется обоснованным использовать биочипы для одновременного определения антигенов, имеющих дифференциально–диагностическое значение, и множества других антигенов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и расселения клеток опухоли в тканях. В результате, появляется принципиальная возможность установления особенностей иммунофенотипа клеток опухоли у каждого пациента и индивидуализации прогноза течения заболевания.
Помимо гематологии биочипы данного класса могут быть использованы в других областях медицинской науки: клинической иммунологии, онкологии, клеточной биологии и многих других направлениях (Belova L., Christopherson R.I. et al., 2001-2010; Liu A.Y., 2001)
Работы в области разработки иммунобиочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток, активно проводятся в Австралии (Belova L., Christopherson R.I. et al., 2001-2010), Японии (Ko I.K. et al., 2005.), Великобритании (Campbell C.J. et al., 2006) и ряде других стран.
В то же время, при анализе публикаций этих и других авторов, можно обнаружить ряд существенных недостатков описанных разработок, связанных с проблемой визуализации результатов, невозможностью проведения многих дополнительных исследований связанных клеток и необходимостью использования сложного оборудования для считывания результата.
Совершенствование аналитических систем данного типа, с целью повышения информативности получаемых результатов, снижения трудоемкости анализа, уменьшения расхода реактивов и биологического материала, снижения стоимости исследований в настоящее время представляется перспективным направлением современной медицинской науки. Для реализации всего перечисленного, прежде всего, необходимо создание новых конструкций биочипов, вспомогательных устройств, разработка новых методов проведения анализа. Таким образом, речь идет о создании исследовательско–диагностического комплекса, основанного на технологии биочипов, и разработке набора методик проведения анализа с его использованием. Создаваемый комплекс должен быть недорогим и простым в использовании, а также пригодным для решения не только сугубо диагностических, но и намного более сложных научно–исследовательских задач.
Возможность одновременного определения множества различных антигенов может быть использована для решения ряда фундаментальных и практических задач, например, изучения особенностей иммунофенотипа клеток хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) и различных вариантов неходжкинских лимфом, а также прогнозирования течения этих заболеваний. Для ХЛЛ характерна неоднородность клинических (Воробьев А.И., Лорие Ю.Ю., 2007) и лабораторных показателей (Никитин Е.А., 2003), а также ответа на проводимое лечение у разных больных (Бессмельцев С.С., 2007). Представляет интерес изучение взаимосвязи между экспрессией на клетках данной опухоли некоторых антигенов и особенностями заболевания.
Цель работы:
Теоретическое обоснование, разработка и практическая апробация исследовательско-диагностического комплекса для изучения нормальных и опухолевых клеток крови на основе иммунобиочипов с возможностью одновременного проведения иммуноморфологических и иммуноцитохимических исследований клеток, пригодного для решения задач различного уровня сложности в лабораториях с разным уровнем оснащенности.
Задачи работы:
1. Разработать новые конструкции биочипов для определения поверхностных антигенов клеток крови.
2. Создать новые типы приспособлений, позволяющих оптимизировать выполнение различных этапов анализа с помощью биочипов.
3. Предложить и апробировать информативные, простые и доступные для широкой клинической практики методики проведения анализа с применением биочипов и установить возможность их использования в качестве критерия диагностики и эффективности проведенной терапии больных с опухолевыми заболеваниями системы крови.
4. Оценить возможность использования разработки для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных для оптимизации лечения и определения прогноза течения заболевания.
5. Разработать рациональный алгоритм проведения анализа иммунологических, морфологических и цитохимических свойств клеток опухолей системы крови c помощью исследовательско–диагностического комплекса.
Научная новизна исследования
Впервые реализован ряд новых методических и конструкторских решений при создании биочипов, устройств, предназначенных для проведения анализа, и методик их использования. Предложены и апробированы новые конструкции биочипов в едином исследовательско-диагностическом комплексе.
Впервые разработаны способы комбинированных исследований клеток, связавшихся с биочипом. Показано, что одновременно с оценкой имунофенотипических особенностей клеток крови можно определять морфологические, цитохимические и другие признаки одних и тех же клеток.
Впервые в разработку данного класса заложен модульный принцип, позволяющий сочетать различные варианты методик проведения анализа и используемых устройств, что дает возможность решать поставленные диагностические или исследовательские задачи наиболее оптимальным способом.
Установлена вариабельность экспрессии ряда адгезионно-активационных антигенов клетками больных ХЛЛ. Выявлена взаимосвязь между содержанием в крови больных ХЛЛ клеток, экспрессирующих некоторые антигены адгезии и активации и, таким важным для прогноза показателем, как время удвоения лимфоцитов, характеризующим скорость нарастания опухолевой массы, и определяющим тактику ведения больных.
Доказана важность и необходимость использования биочипов для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных и оценки прогноза течения заболевания.
Разработан рациональный алгоритм проведения анализа на основе комплексной оценки иммунологических, морфологических и цитохимических свойств опухолевых клеток крови.
Практическая ценность работы
Создан и апробирован исследовательско-диагностический комплекс, позволяющий проводить изучение нормальных и опухолевых клеток крови с помощью биочипов и определять множество поверхностных антигенов на разных типах клеток. Это дает возможность наряду с определением важнейших дифференциально-диагностических антигенов устанавливать индивидуальные особенности иммунофенотипа клеток пациента, имеющих прогностическое значение.
Убедительно доказана необходимость применения предложенного исследовательско-диагностического комплекса в качестве важного дополнительного метода диагностики опухолевых заболеваний системы крови. Все элементы комплекса просты в использовании и имеют низкую себестоимость. Прогнозируемая стоимость проведения иммунофенотипирования клеток в 5 – 15 раз ниже по сравнению с применяемыми в настоящее время методами, что делает принципиально возможным проведение скрининговых исследований при профилактических осмотрах.
В процессе проведения исследования наряду с определением на клетках поверхностных антигенов возможно выполнение дополнительного окрашивания тех же клеток для их последующего морфологического или цитохимического исследования, что повышает информативность получаемых результатов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработаны и апробированы новые конструкции иммунологических биочипов и дополнительных устройств для исследования клеток крови.
2. Использование разработанных методик позволяет выполнять иммунологическое исследование клеток крови в сочетании с их морфологическим или цитохимическим исследованием, что повышает точность и информативность получаемых результатов.
3. Применение иммунофенотипирования клеток в сочетании с морфологическими и цитохимическими исследованиями на основе биочипов позволяет улучшить диагностику хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинских лимфом, острых лейкозов.
4. Анализ с применением биочипов позволяет снизить расход антител и использования дорогостоящего оборудования. Результаты иммунологического исследования клеток с использованием биочипов хорошо корреллируют с данными проточной цитофлуориметрии.
5. Показана возможность определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток, что позволяет оценить течение и прогноз ХЛЛ.
Внедрение результатов работы в практику.
Результаты диссертационного исследования внедрены в научно–исследовательскую работу, учебный процесс и практическую деятельность ГБОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии (учебно-экспериментальной лаборатории, кафедры гистологии, кафедры патологической физиологии, Центра трансфера– технологий), в работу АНО «Центр наноиндустрии Удмуртской Республики», ООО ППО «Технолог». По результатам данной работы выпущено 5 информационных писем Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. За создание и применение разработки в клинической практике получена Государственная премия Удмуртской Республики в области науки и техники за 2010 год.
Апробация работы
Основные результаты исследования были представлены на I, II, III Международных форумах по нанотехнологиям (Москва 2008, 2009, 2010), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (Москва 2008), на XII, XIII, XIV Международных Пущинских школах–конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино 2008, 2009, 2010), на II Российском форуме «Российским инновациям – российский капитал» (Саранск 2009), на VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург 2009), на III инвестиционном Форуме «Удмуртия: курс на модернизацию» (Ижевск 2011), на Всероссийской научно–практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров 2010), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт- Петербург 2011), на Всероссийской научно–практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт- Петербург 2011), на Всероссийской конференции с международным Интернет-участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий – к наноиндустрии» (Ижевск 2009), на научно–практической конференции «Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Ижевск 2008), на Межрегиональной научно–практической конференции «Актуальные вопросы терапии и восстановительной медицины» (Ижевск 2009), на Региональной научно-практической конференции «Клиническая биохимия. Единство фундаментальной науки и лабораторной диагностики» (Ижевск 2010), на конференции «Актуальные вопросы современной физиологии и медицины» (Ижевск 2010), на научной конференции, посвященной 75-летию службы крови Удмуртской Республики (Ижевск 2009).
Апробация диссертации состоялась 14.12.2011 г. на объединенном заседании кафедр ГБОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии: кафедры факультетской терапии с курсами гематологии и эндокринологии, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, кафедры патологической анатомии, кафедры биохимии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры патологической физиологии, учебно-экспериментальной лаборатории.
Личный вклад соискателя в выполнение работы
Соискателем самостоятельно разработаны и изготовлены биочипы новых конструкций, разработаны методики комплексного изучения клеток крови. Самостоятельно спроектированы устройства для проведения анализа с использованием биочипов, разработаны методики их применения и изготовлены опытные образцы большинства данных устройств. Соискателем были отработаны методики совместного использования различных элементов созданного комплекса при изучении клеток крови. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован автором. Им проанализированы данные обследования больных, включая клинико-гематологические и лабораторные признаки в сопоставлении с результатами исследований клеток с применением биочипов, оформлены результаты исследования.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 75 научных работ, в том числе 2 монографии, 1 глава в книге, 6 патентов РФ на изобретения, 25 патентов РФ на полезные модели, 13 публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, 19 публикаций в изданиях, содержащих материалы Всероссийских и международных конференций и форумов, 9 публикаций в прочих изданиях. Кроме того, по материалам диссертации подготовлено и опубликовано 5 информационных писем Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики.
Объем и структура диссертации
Текст диссертации включает разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение» и «Приложения». Приводятся практические рекомендации по использованию предложенной разработки. Диссертационная работа изложена на 294 машинописных страницах, содержит 22 таблицы и 59 рисунков. Список цитируемой литературы, включает 295 источников, в том числе 145 отечественных и 150 зарубежных.
