Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы .12
1.1. Преимущества и недостатки пуповинной крови, как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток 12
1.2. Создание банков пуповинной крови 16
1.3. Сбор и обработка пуповинной крови 18
1.4. Тестирование концентратов пуповинной крови .22
1.5. Криоконсервирование и долгосрочное криохранение клеток пуповинной крови .26
1.5.1. Криопротекторы 28
1.5.2. Этапы замораживания и долгосрочное криохранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 31
1.6. Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови 33
1.7. Клиническое применение криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови .35
Глава II. Материалы и методы 40
2.1. Материал исследования 40
2.2. Методы исследования .46
2.3. Статистическая обработка результатов .49
Глава III. Результаты исследования 51
3.1. Биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» .51
3.1.1. Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 51
3.1.2. Влияние методов лейкоконцентрации на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» 55
3.1.3. Влияние величины гематокрита на качество гемопоэтических
стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» 59
3.1.4 Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» .63
3.2. Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови .67
3.3. Анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра и эффективность подборов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в городе Москве 71
3.3.1. Особенности общественного регистра доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови .71
3.3.2. Анализ применения криоконсервированных гемопоэтических
стволовых клеток пуповинной крови 83
3.4. Алгоритм работы общественного банка-регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови 89
Глава IV. Заключение 92
Выводы 103
Практические рекомендации 105
Список сокращений 106
Список литературы 108
- Создание банков пуповинной крови
- Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови
- Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
- Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Эффективность первых аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) пуповинной крови (ПК) у пациентов с различными заболеваниями привела к широкомасштабному развитию клинических исследований в данной области (Gluckman Е., 2010; Wagner J.E., 2010; Broxmeyer, H.E., 2011).
Благодаря уникальным свойствам клеток ПК, относительной простоте и безопасности их заготовки, на сегодняшний день ПК стала одним из наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во многих странах мира (Gluckman Е., 2011; Ballen K., 2013). Ежегодно в мире проводится более 3000 алло-ТГСК ПК пациентам с различными заболеваниями (Rocha V., 2010).
С целью обеспечения систематической заготовки ГСК ПК для длительного криохранения и использования их в клинической практике было создано 160 успешно функционирующих банков ПК, в которых на криохранение находится более 600 000 тестированных образцов ПК (Welte K., 2010; Lauber S., 2010; URL:). Современная система банков ПК позволяет в короткие сроки накопить большое количество тестированных концентратов ПК, создать общественный регистр и подобрать подходящего донора для большинства пациентов, нуждающихся в проведении алло-ТГСК (Navarrete C., 1998; Armitage S., 1999; Brown J., 2000; Davey S., 2004, Бубнова Л.Н., 2008).
Успех алло-ТГСК ПК во многом зависит от качества криоконсервированных ГСК ПК (Rubinstein P. 2009; Wagner J.E., 2002; Gluckman Е., 2005; Абдулкадыров К.М., 2006).
Для оценки качества ГСК ПК в США, Италии и Японии были проведены исследования, которые продемонстрировали высокий процент сохранения ГСК во время криохранения (Вroxmeyer H.E. 2003, 2011; Zinno F., 2011). Рядом зарубежных авторов были показаны преимущества криохранения концентратов ПК в автоматизированном криокомплексе «BioArchive» и «mini-Bioarchive» (Rubinstein P., 2004; Miura J., 2008). В России аналогичные исследования единичны. В 2012 году были представлены данные по оценке сохранности CD45+, CD45+/СD34+ клеток, колониеобразующей способности ГСК ПК и длины теломер в зависимости от различных способов криоконсервирования (программное и неконтролируемое замораживание) и краткосрочного криохранения (Карпова Н.С, 2012). Также было проведено исследование по изучению влияния метода выделения ядросодержащих клеток (ЯСК) на ГСК ПК (сохранность и жизнеспособность CD45+, CD45+/СD34+ клеток) до и после криохранения в течение 7,0 ±0,42 месяцев (Хурцилава О.Г., 2012).
Одним из наиболее перспективных направлений является поиск оптимального комбинированного криопротектора, способного сохранить качество ГСК ПК для дальнейшего клинического применения (Cilloni D., 1999; Galmes A., 1999; Halle P., 2001; Bakken A.M., 2003). В России было проведено только одно исследование по оценке влияния стандартного комбинированного криопротектора ДМСО в сочетании с декстраном 40 (Pall, Великобритания) на качество ГСК ПК (Смолянинов А.Б., 2009).
Степень разработанности темы
Выше изложенные данные не охватывают весь комплекс по оценке качества ГСК ПК, необходимый для более полной характеристики трансплантационного материала. Не завершены исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность ГСК ПК после криохранения. Востребовано постоянное получение новых данных о распределения частоты HLA-
гаплотипов в регистре банков ПК для целенаправленного поиска совместимых образцов ГСК ПК, что особенно актуально для многонациональной России. Все это обуславливает актуальность настоящего исследования.
Цель исследования
Оценить качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в автоматизированном системе «BioArchive», для клинического применения.
Задачи исследования
-
Изучить клеточный состав концентратов ПК и биологические характеристики ГСК (количество CD45+/СD34+ клеток, жизнеспособность СD45+ клеток, колониеобразующую активность) до и после длительного криохранения.
-
Определить влияние методов обработки, концентрации гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество ГСК ПК.
-
Исследовать влияние отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, на качество криоконсервированных ГСК ПК.
-
Проанализировать иммуногенетические характеристики общественного регистра и эффективность подбора ГСК ПК в г. Москве.
-
Разработать алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT (International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release).
Научная новизна работы
Впервые в России представлена комплексная оценка качества
криоконсервированных ГСК ПК (биологические и иммуногенетические характеристики), находящихся на длительном криохранении в автоматизированной системе «BioArchive».
Изучение клеточного состава концентратов ПК и биологических характеристик ГСК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» показало, что общее количество ЯСК незначительно снижается, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, колониеобразующая активность ГСК ПК сохраняется на достаточно высоком уровне. Это позволяет использовать клеточные концентраты ПК в качестве альтернативного источника ГСК.
Выявлено, что на качество ГСК ПК во время криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» влияют метод выделения, величина гематокрита после лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA в концентрате ПК перед криохранением.
Установлено, что отечественный комбинированный криопротектор
ДМСО+реополиглюкин позволяет сохранять высокое качество ГСК ПК во время криохранения и может использоваться для длительного криохранения.
Впервые проанализирован характер распределения HLA-гаплотипов в
общественном регистре ГСК ПК г. Москвы и показано, что характер распределения в целом соответствует славянам центральной и восточной Европы, а частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3- генам HLA - системы (локусы А, В, DRB1) составляет 1:218.
Впервые разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT.
Теоретическая и практическая значимость
Криоконсервированные ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» являются качественным материалом и могут быть использованы в клинической практике.
В результате проведенного исследования установлены факторы, влияющие на клеточный состав концентрата ПК и биологические характеристики ГСК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive», которые необходимо учитывать при использовании клеточных концентратов ПК в клинической практике: метод выделения ЯСК, величина гематокрита после процесса лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA до криохранения.
Иммуногенетические особенности общественного регистра ГСК ПК Московского банка стволовых клеток позволяют проводить целенаправленный поиск совместимых образцов ГСК ПК для пациентов из различных регионов России.
Предложенный алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD -FACT позволит усовершенствовать работу в подобных учреждениях.
Методология и методы исследования
В работе были использованы общенаучные (анализ проспективный и ретроспективный, обобщение данных) и частные научные методы (лабораторные, клинические), а так же методы математической статистики.
На первом этапе исследования были изучены клеточный состав ПК и биологические
характеристики ГСК до и после длительного криохранения в автоматизированной системе
«BioArchive», было выявлено влияние методов обработки, содержания гемоконсерванта
CPDA, величины гематокрита на качество ГСК ПК после криохранения. Далее была
установлена целесообразность использования отечественного комбинированного
криопротектора ДМСО+реополиглюкин, при заготовке концентратов ПК для длительного криохранения. Был проведен анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра ГСК ПК, включающий характер распределения HLA-гаплотипов и эффективность подбора совместимых образцов ГСК ПК в г. Москве. На заключительном этапе проведенной работы был разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT.
Положения, выносимые на защиту
-
Предложенный комплекс по оценке биологических характеристик криоконсервированных ГСК ПК в автоматизированной системе «BioArchive» всесторонне характеризует качество трансплантационного материала.
-
Методы обработки ПК, концентрация гемоконсерванта CPDA и величина гематокрита перед криохранением оказывают влияние на биологические характеристики криоконсервированных ГСК ПК.
-
Комбинированный отечественный криопротектор ДМСО+реополиглюкин, предложенный в Московском банке стволовых клеток, является эффективным криоконсервирующим раствором и может использоваться для длительного криохранения ГСК ПК.
-
Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT, усовершенствует
работу общественных регистров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в подобных учреждения.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации
Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки.
Апробация диссертации проведена 4 марта 2014 г. на расширенном заседании Проблемной комиссии №3 ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.
Материалы диссертации доложены на: XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011г.), международном симпозиуме «ACUTE LEUKEMIAS XIII Biology and Treatment Strategies» (Мюнхен, 2011г.), 37 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Париж, 2011г.), на V международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых памяти Раисы Горбачевой» (Санкт-Петербург, 2011г.), на V научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2011г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии» (Беларусь, 2011г.), на XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013г.), на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013г.), 8th East-West «Immunogenetics conference» (Вена, 2014).
Внедрение результатов в практику
Результаты исследования были внедрены в практику работы Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Банка стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы» и Научно-Исследовательского института детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова (ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова).
Результаты диссертационной работы войдут в Методические рекомендации “Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT.
Публикации результатов исследований
По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
Создание банков пуповинной крови
Для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов ПК для клинического применения были созданы банки ПК. История развития банков ПК началась с лаборатории микробиологии и иммунологии штата Индиана (США) под руководством профессора Broxmeyer H.J., который стал инициатором развития данной программы. В его лаборатории на хранение были заложены первые образцы ПК от родственных доноров. Были разработаны методы сбора и хранения цельной ПК, которые продемонстрировали возможность транспортировки образцов ПК между различными центрами, оценили биологические свойства ГСК и их пролиферативный потенциал [16;31]. В последующем, с ростом числа алло-ТГСК ПК, для расширения коллекции криоконсервированных образцов ПК и улучшения качества подборов пары донор-реципиент, появилась необходимость развития программ по безвозмездному донорству и открытию государственных банков ПК [119]. Первые государственные банки ПК появились в начале 90-х годов Нью-Йорке, Милане и Дюссельдорфе [20], а в последующем и во многих странах мира. В Нью-Йоркском центре крови под руководством Р. Rubinstein, был разработан первый протокол по обработке, криоконсервированию, хранению и разморозке криоконсервированных образцов ПК [120], который до настоящего времени является основным документом при заготовке ПК во многих странах мира. Сегодня по данным Всемирной организации доноров костного мозга (Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW) в различных странах мира насчитывается 158 государственных банков ПК где на криохранении находится более 600 000 полностью тестированных образцов ПК [URL:http://www.bmdw.org/; 87;102;124;136].
В связи с появлением большого числа банков ПК в 1998 году была учреждена группа NETCORD, призванная обеспечить соблюдение условий криохранения ПК, в соответствии со стандартами GMP (Good Medical Practice), создать международную сеть и облегчить поиск доноров ГСК ПК, улучшить качество трансплантационного материала и стандартизировать их в международном масштабе, и, что особенно важно, установить процедуры аккредитации банков ПК совместно с Международным Фондом Аккредитации Клеточной Терапии (FACT) [URL:http://www.netcord.org/].
В 2000 году группой NETCORD-FACT впервые были разработаны международные стандарты для аккредитации банков ПК по сбору, обработке, тестированию, заготовке, подбору и выдачи образцов ПК для клинического применения – International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release [URL:http://www.factweb.org/http://www.factweb.org/]. В настоящее время в мире 18 банков ПК уже получили аккредитацию в NETCORD-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации [URL:http://www.netcord.org/,109].
Таким образом, на сегодняшний день вся информация о доступных криоконсервированных образцах ПК, заготовленных в банках ПК, содержится в двух взаимосвязанных международных регистрах: в NETCORD - информация только о криоконсервированных образцах ПК, и во всемирной организации доноров костного мозга (BMDW), где содержится информация как о донорах костного мозга, так и о доступных единицах ПК [102].
Первостепенной задачей, которая стоит перед современными банками ПК является усовершенствование методов забора, выделения, криоконсервирования, хранения и разморозки ПК, с соблюдением контроля качества на каждом этапе согласно стандартам NETCORD, чтобы обеспечить трансплантационные центры высококачественным и безопасным материалом с максимальным количеством жизнеспособных стволовых клеток. Это приведет к дальнейшему прогрессу в области клеточной терапии и позволит улучшить клинические результаты [110].
1.3. Сбор и обработка пуповинной крови
Учитывая, что наиболее существенным ограничением широкого использования ПК является лимитированное количество ГСК в одном образце ПК, которое строго коррелирует с объемом заготовленного материала [1;12;140], основной задачей на данном этапе является сбор максимально возможного количества стволовых клеток для получения качественного трансплантационного материала [112;117]. Как правило, объем ПК, подлежащей обработке и дальнейшему криоконсервированию, устанавливается в каждом банке индивидуально в соответствии с программами их работы и требованиями трансплантационных центров [102]. Однако, учитывая, что скорость восстановления гемопоэза после трансплантации ГСК ПК напрямую зависит от количества заготовленных ГСК [62;135], большинство банков ПК предпочитают оставлять на долгосрочное криохранение образцы с чистым весом более 40-70 г и количеством выделенных ядросодержащих клеток (ЯСК) не менее 3х107/кг [58;64;135].
Сбор ПК осуществляется после получения информированного согласия роженицы, рождения ребенка и отделения его от последа в закрытые системы для сбора крови с гемоконсервантом CPDA (цитрат-фосфат-декстроза-аденин) [URL:http://www.netcord.org/; 120]. На сегодняшний день в литературе практически отсутствуют данные о влиянии гемоконсерванта CPDA на качество ГСК ПК. Единственное исследование, которое было проведено польскими исследователями, выявило умеренную токсичность CPDA на CD45+/CD34+ клетки при увеличении времени его взаимодействия с ПК [93].
Транспортировка ПК должна осуществляться при температуре от +4С до +22С; обработка полученных образцов проводится не позднее, чем через 24 часа от момента сбора, так как при увеличении сроков хранения жизнеспособность ГСК существенно снижается [URL:http://www.netcord.org/; 13;31;32;126] Первоначально, для обработки ПК и выделения ЯСК использовали протоколы, разработанные для выделения МНК КМ. При этом ПК подвергалась криоконсервированию без предварительной обработки сразу после добавления криоконсерванта ДМСО. Это позволяло сохранить до 100% ЯСК [31], однако привело к ряду существенных проблем [120]: 1. Большой объем заготавливаемого материала требовал большого криогенного хранилища и существенных финансовых затрат. 2. Криоконсервирование цельной ПК подразумевало введение больших объемов криопротектора ДМСО, что снижало его защитные функции на стволовые клетки и увеличивало риск развития побочных эффектов при трансплантации ГСК ПК. 3. Продукты лизиса эритроцитов и гранулоцитов, образующиеся во время процессов замораживания и размораживания, неблагоприятно влияли на жизнеспособность ГСК. 4. Увеличивался риск развития реакции несовместимости между донором и реципиентом по эритроцитарным антигенам. После проведения серий успешных трансплантаций ГСК ПК, получения доказательств ее эффективности и безопасности, во многих банках ПК начались разработки по модификации протоколов криоконсервирования. В 1995 году в качестве основного протокола обработки ПК для клинического применения, был предложен неавтоматический метод (ручной способ) сепарации ПК, основанный на увеличении скорости седиментации эритроцитов путем добавления к цельной ПК 6% гидроксиэтилкрахмала с последующим двойным центрифугированием на низких скоростях и сепарацией ЯСК [26;48;71;106;120]. Данный метод позволил сократить объем цельной ПК до 20 - 21 мл с сохранением до 90% ЯСК в жизнеспособном состоянии, существенно сократить объемы вводимого криоконсерванта, уменьшить финансовые затраты на криохранение [86;112;120]. На сегодняшний день ручной способ обработки пуповинной крови остается одним из наиболее распространенных во многих странах мира.
Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови
Оценка качества криоконсервированных ГСК ПК и возможность их применения в клинической практике – это задача, которая стоит перед банками ПК всего мира. Для этого ГСК ПК должны быть разморожены. В 1995 году Р. Rubinstein разработал методику по размораживанию ГСК ПК, которая является общепринятой и до настоящего времени [120]. Первоначально, возможность длительного хранения образцов в криоконсервированном состоянии и их последующее использование в клинической практике подвергалась сомнениям. Но, в ходе проведенных исследований, было установлено, что стандартные протоколы криоконсервирования ГСК ПК при температуре жидкого азота с использованием криопротектора ДМСО в конечной концентрации 10% и методов программного замораживания позволяют в течение десятилетий сохранять более 80% ЯСК в жизнеспособном состоянии и более 90% предшественников гемопоэза [101] . Данные выводы были подтверждены и в научных работах H.E Вroxmeyer, где он со своими коллегами продемонстрировал высокий процент сохранения ЯСК ПК и клеток предшественников гемопоэза после 10-ти, 15-ти и 24-х лет хранения в жидком азоте [32-34;40] (Таблица 3)
Процент сохранения КОЕ-ГМ (M±SD) 92±11 95±15 Группой итальянских ученых [147] в претрансплантационном периоде было проведено исследование по оценке качества 40 криоконсервированных образцов ПК из 40 различных банков, которые были отобраны для реципиентов ГСК. Средний срок криохранения в исследовании составил 43,3±26,2 месяца, процент сохранения ЯСК - 78,9±15,41%, из них жизнеспособных 85,5±10,59%, СD45+/CD34+ клеток – 96,83±71,96%.
Похожее исследование по оценке качества было выполнено в институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины. Они показали высокий уровень сохранения ЯСК и CD45+/СD34+ клеток в жизнеспособном состоянии - до 98% и 94-98%. При оценке колониеобразующей активности клеток ПК их пролиферативный потенциал так же оставался достаточно высоким (общее количество колоний составило 247,6±36,8) [2]. Однако в данном исследовании отсутствовала информация о количестве размороженных образцов ПК, их количестве и сроках криохранения.
В России было проведено только одно подобное исследование на 231 образце ГСК ПК по оценке сохранности CD45+, CD45+/СD34+ клеток, колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток и длины теломер в зависимости от различных способов криоконсервирования (программное и неконтролируемое замораживание). Было показано, что криоконсервирование ПК необходимо проводить в программном замораживателе, а длительное криохранение должно осуществляться в диапазоне температур от – 130С до – 196С. Количество ГСК ПК с иммунофенотипом CD34+/CD45+ в образце ПК прямо пропорционально зависит от исходного количества ЯСК [6]. Таким образом, представленные данные не охватывают весь комплекс ПО оценке качества криоконсервированных ГСК ПК.
Благодаря уникальным свойствам ПК, относительной простоте и безопасности ее заготовки, развитию глобальной сети банков ПК, усовершенствованию методов заготовки и улучшению качества подборов, на сегодняшний день ПК является одним их наиболее востребованных альтернативных источников ГСК для алло-ТГСК во многих странах мира [123]. Это существенно расширило возможность применения трансплантации ГСК, особенно в терапии тех пациентов, которым ранее данный вид терапии был недоступен (представители расовых и этнических меньшинств) или они нуждались в срочном проведении алло-ТГСК. В настоящее время в мире ежегодно проводится 2000-3000 новых трансплантаций ГСК ПК пациентам с различными заболеваниями, а в 2009 году впервые число проведенных алло-ТГСК ПК превысило количество трансплантаций ГСК КМ [36]. Согласно данным Международного регистра трансплантаций костного мозга (International Bone Marrow Transplant registry - IBMTR) сегодня около 20% от всех алло-ТГСК, которые были проведены молодым пациентам в возрасте менее 20 лет, выполнены с использованием ПК. В Японии этот показатель приближается к 50%.
Эффективность первых трансплантаций ГСК ПК у пациентов с различными заболеваниями, вызвала огромный интерес со стороны многих ученых и привела к дальнейшему развитию клинических исследований в данной области [58;81;82;121;134]. Результаты этих и последующих трансплантаций ГСК ПК продемонстрировали, что ПК во многом отличается от традиционных источников ГСК (костного мозга и периферической крови).
Было отмечено, что трансплантация ПК ассоциирована с задержкой восстановления нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с другими источниками ГСК [58;113;121]. Однако, в ходе дальнейших исследований, стало ясно, что скорость восстановления гемопоэза и эффективность трансплантации ПК существенно зависит от качества подборов пары донор-реципиент, а так же от количества и качества трансплантируемых ГСК [61;89;115;136]. Благодаря сравнительному анализу между различными источниками ГСК было показано, что проведение трансплантации ГСК ПК возможно с менее строгими критериями отбора пары донор-реципиент по генам HLA-системы по сравнению с донорами КМ или периферической кровью. Несоответствие по 1-2 аллелям HLA-антигенов не приводило к увеличению риска развития острой/хронической РТПХ и снижению общей выживаемости [113]. Это стало особенно важным для тех пациентов, которые длительное время ожидали подходящего донора, а так же для больных с быстро прогрессирующими заболеваниями. До 1993 года алло-ТГСК ПК в основном проводились от родственных доноров. Открытие общественных банков ПК в Европе и расширение коллекции криоконсервирванных образцов ПК привело к первым неродственным трансплантациям клеток ПК [81;134]. С тех пор стало ясно, что ПК является безопасным и эффективным источником ГСК для трансплантаций, который способен обеспечить длительное восстановление гемопоэза у пациентов после миелоаблативной терапии.
Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Показатель ЯСКx107/мл МНКх107/мл Нейтрофилы х107/мл До После % сох-я До После % сох-я До После % сох-я M±SD 3,67±0,97 3,13±0,80 87,01±13,30 1,72±0,56 1,79±0,60 100,4±9,20 1,94±0,62 1,46±0,51 78,60±12,20 р 0,02 0,08 0,03 Клеточный состав концентратов пуповинной крови до и после криохранения (n=600) Количество ЯСК в концентрате ПК после криохранения достоверно снижалось: с 3,67±0,97x107/мл до 3,13±0,80x107/мл (р=0,02). Процент сохранения общей фракции ЯСК составил 87,01±13,30%. При анализе субпопуляционного состава ЯСК было выявлено перераспределение соотношения между лимфоцитами и гранулоцитами до и после криохранения (Рисунок 4). Рисунок 4. Субпопуляционный состав ядросодержащих клеток пуповинной крови до и после криохранения
Абсолютное количество МНК после криохранения концентратов ПК достоверно не изменялось: 1,72±0,56x107/мл и 1,79±0,60x107/мл соответственно. Процент сохранения МНК составил 100,4±9,20%. Абсолютное количество нейтрофилов после криохранения концентратов ПК статистически значимо снижалось с 1,94±0,62x107/мл до 1,46±0,51x107/мл (р=0,03). Процент сохранения составил 78,60±12,2%. Достоверного влияния криохранения клеточных концентратов в автоматизированной системе «BioArchive» на жизнеспособность ЯСК (CD45+7AAD-) выявлено не было (Таблица 7).
Абсолютное количество СD45+/CD34+ клеток после криохранения клеточного концентрата ПК достоверно снижалось с 0,13±0,08х106/мл до 0,089±0,05х106/мл (р=0,035). Процент сохранения СD45+/CD34+ клеток составил 93,70±5,3% (Таблица 8). При оценке колониеобразующей активности ГСК ПК было показано, что количество колоний КОЕ-mix, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-ГМ и КОЕ-Эр после криохранения ПК достоверно снижалось, процент сохранения составил: 99,30±3,38%, 85,03±5,56%, 81,30±3,28%, 82,34±9,80% и 69,40±5,7% соответственно (Таблица 9). При проведении регрессионного анализа были обнаружены значимые положительные корреляционные зависимости между количеством ЯСК и МНК до криохранения и количеством СD45+/СD34+ клеток после криохранения концентратов ПК (Таблица 10). Таким образом, проведенное исследование показало, что после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» отмечается достоверное снижение количества ЯСК, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, уменьшение количества СD45+/CD34+ клеток и всех КОЕ. Влияние методов лейкоконцентрации на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» Мы изучили влияние различных методов обработки ПК на клеточный состав концентратов ПК и биологические характеристики ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive».
Все криоконсервированные концентраты ПК были разделены на две группы в зависимости от метода лейкоконцентрации: Ш Криоконсервированные концентраты ПК, полученные МАВК - 256 концентрата Ш Криоконсервированные концентраты ПК, полученные МДЦ - 344 концентрата При анализе показателей клеточного состава концентрата ПК в зависимости от метода лейкоконцентрации нами были получены следующие данные (Таблица 12). Таблица 12 Клеточный состав концентрата пуповинной крови до и после криохранения в зависимости от метода лейкоконцентрации Метод ЯСКx107/мл(M±SD) МНКх107/мл(M±SD) Нейтрофилы х107/мл(M±SD)
Процент сохранения нейтрофилов в концентратах ПК после криохранения был достоверно ниже в группе образцов, обработанных МДЦ 80,21±2,10% по сравнению с группой образцов, обработанных МАВК 85,31±3,80% , р=0,0006. При сравнении жизнеспособности ЯСК (CD45+7AAD-) в обеих группах криоконсервированных образцов ПК значимых различий до и после выявлено не было .
При оценке колониеобразующей активности ГСК после криохранения концентратов ПК в обеих группах достоверных различий выявлено не было (Таблица 15). Таким образом, криоконсервированные концентраты ПК, полученные методом автоматического выделения клеток, после долгосрочного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» содержат достоверно больше нейтрофилов и CD45+/CD34+клеток, по сравнению с концентратами ПК, полученными методом двойного центрифугирирования. Таблица 15 Влияние методов лейкоконцентрации на колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Все размороженные образцы ПК были разделены на две группы в зависимости от величины гематокрита после лейкоконцентрации: Ш Криоконсервированные концентраты ПК с гематокритом от 12% до 39% - 286 концентратов ПК Ш Криоконсервированные концентраты ПК с гематокритом от 40% до 69% - 314 концентратов
Влияние величины гематокрита на клеточный состав концентратов ПК после криохранения представлен в таблице 16. Процент сохранения общей фракции ЯСК после криохранения был достоверно выше в группе с гематокритом от 40% до 69% -89,51±4,54%, чем в группе концентратов ПК с более низкой величиной гематокрита- 84,83±4,98% (р=0,01). Таблица 16
Абсолютное количество CD45+/СD34+ клеток ПК после криохранения концентратов ПК в обеих группах образцов статистически значимо не различалось (Таблица 18). Процент сохранения CD45+/СD34+ клеток после криохранения в концентрате ПК с величиной гематокрита от 12% до 39% был достоверно выше, чем в группе с более высокой величиной гематокрита - 96,32±3,46% и 90,06±5,83% соответственно, р=0,006. Таблица 18 Влияние величины гематокрита на количество CD45+/СD34+ клеток в концентрате пуповинной крови Гематокрит (%) CD45+/СD34+ х106/мл (M±SD)
В ходе проведенного исследования было выявлено, что ПК, криоконсервированная с величиной гематокрита от 12% до 39% после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» содержит достоверно больше CD45+/CD34+ клеток и меньше ЯСК, по сравнению с криоконсервированной ПК с большей величиной гематокрита: процент сохранения 96,32±3,46% против 90,06±5,83% и 84,83±4,98% против 89,51±4,54%, р=0,01 и соответственно.
Проводилась для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики в программах Microsoft Excel, Microsoft Access, Statisticav 6.0, «Biostat» с двупольной таблицы при помощи программы «OpenEpi» (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Частоты встречаемости гаплотипов определяли прямым подсчетом. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р 0,05.
Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
На сегодняшний день отсутствуют нормативные документы по использованию ДМСО в качестве криопротектора, поэтому большинство банков ПК разрабатывают свои собственные протоколы для криоконсервации ГСК ПК.
Для оценки влияния отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реоплогиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, было изъято из автоматизированной системы «BioArchive» 100 ранее криоконсервированных концентратов ПК с применением данного криоконсервирующего раствора. В качестве контрольной группы было изъято 100 образцов ранее криоконсервированных с использованием общепринятого криопротектора ДМСО+декстран 40.
Как видно из представленной таблицы, медиана криохранения в обеих группах концентратов ПК составила 2 года (1-3). Методом автоматического выделения клеток в группе ДМСО + реополиглюкин было обработано 64 образца и 54 образца в группе ДМСО + декстран 40. 36 образцов ПК из группы ДМСО + реополиглюкин и 46 из группы ДМСО + декстран 40 были обработаны методом двойного центрифугирования. Концентрация ДМСО в первой группе концентратов ПК составила 10,1%(9,8-10,2), во второй группе - 10% (9,7- 10,1). При анализе абсолютного количества до и после криохранения, а так же процента сохранения клеток в концентрате ПК после криохранения в зависимости от вида используемого комбинированного криопротектора достоверных различий получено не было (Таблица 25).
При оценке абсолютного количества CD45+/СD34+ до и после криохранения, а так же процента их сохранения после криохранения концентратов ПК в обеих группах криоконсервированных образцов статистически значимых различий получено не было (Таблица 27).
Таким образом, в проведенном исследовании достоверных различий в клеточном составе концентратов ПК, количестве СD45+/CD34+, жизнеспособности ЯСК и колониеобразующей активности ГСК ПК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» при использовании двух видов криопротекторов выявлено не было. .
За период с 2004 г. по октябрь 2013 г. в Московский банк стволовых клеток поступило 11565 образцов ПК. В процессе тестирования (первичная и вторичная отбраковка) 5733 (49,57%) образцов ПК были отбракованы, из них 441 образца (7,69%) в связи с наличием инфекционных маркеров (116 образцов (2,0%) – наличие серологических маркеров острой HBV и HСV-инфекции и/или выявления ДНК вирусов в цельной крови при ПЦР - диагностике; 38 (0,66%) – в связи с обнаружением маркеров сифилиса (антитела к Treponema pallidum); 287 (5,0%) образцов в связи с бактериальной контаминацией). 5832 концентратов ПК (50,43%) были заложены на криохранение в автоматизированную систему «BioArchive» (Рисунок 5).
В регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК было передано 4800 (41,50%) криоконсервированных концентратов ПК, прошедших инфекционный контроль и типированных по пяти генам HLA-системы на уровне базового разрешения: HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1. На каждый концентрат ПК, переданный в безвозмездный регистр ГСК ПК, был оформлен паспорт образца для неперсонифицированного хранения с указанием клеточного состава и биологических характеристик ГСК ПК (Рисунок 6). ГБУЗ «Банк стволовых клеток ДЗМ» Паспорт гемопоэтических стволовых клеток ПК Заполняемая форма 115516 Москва, ул. Бакинская, 31Тел./Факс. (495) 327-18-53 e-mail: crlpv@mail.ru Дата обработки: Родильный дом: Объем конечного продукта мл Количество WBC х 10 6/unit Количество MNC х 10 6/unit Группа крови и резус-принадлежность Количество CD 34+ клеток в концентрате х 10 5/мл Количество CD45+7-ADD-клеток % Количество клеток предшественников в 1 мл концентрата
При анализе количественного распределения ЯСК в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в общественный регистр ГСК ПК, были получены следующие данные: 720 (15%) образцов ПК содержали от 363,05 до 999,9х106 ЯСК, что позволяет их использовать для трансплантации у пациентов с весом до 30 кг; 2880 (60%) образцов ПК содержало от 1000,0 до 1999,9 х106 ЯСК, что дает возможность их использовать для пациентов с весом более 30 кг; 1200 (25%) образцов содержали от 2000,0 до 4628,0х106 ЯСК, что позволяет их использовать для пациентов с весом более 60 кг (Таблица 30).
Известно, что частота встречаемости аллелей/групп аллелей, а также их неравновесное сцепление в гаплотипах различаются в различных этнических популяциях. Для быстрого и эффективного поиска совместимого донорского образца ГСК в различных региональных банках ПК необходимо учитывать и частоту распределения их HLA-гаплотипов [4].
В данном исследовании была проанализирована частота встречаемости 2-х локусных (B/C и DRB1/DQB1), 4-х локусных (B/C/DRB1/DQB1) и 5-ти локусных (A/B/C/DRB1/DQB1) гаплотипов. Наиболее часто встречаемыми вариантами гаплотипов B/C были – В 35/С 04 (8,9%), В 08/С 07 (8,4%), В 13/С 06 (8,4%), В 07/С 07 (7,9%), В 44/С 05 (5,6%) и В 18/С 12 (5,1%). По гаплотипам DRB1/DQB1 - DRB1 11/DQB1 03 (14,4%), DRB1 04/DQB1 03 (13,0%), DRB1 07/DQB1 02 (13,0%), DRB1 01/DQB1 05 (11,1%), DRB1 15/DQB1 06 (11,1%), DRB1 13/DQB1 06 (10,2%) и DRB1 03/DQB1 04 (8,9%). Среди 4-х локусных гаплотипов B/C/DRB1/DQB1 с наибольше частой встречаемости были B 13/C 06/DRB1 07/DQB1 02 (8,45%), B 08/C 07/DRB1 03/DQB1 02 (7,46%), B 18/C 07/DRB1 11/DQB1 03 (3,48%),B 07/C 07/DRB1 15/DQB1 01(3,48%), B 15/C 03/DRB1 04/DQB1 03 (3,01%). По 5-ти локусным гаплотипам A/B/C/DRB1/DQB1 были выявлены различные варианты их различных сочетаний, из которых с наибольшей частотой встречаемости были: A 01/B 08/C 07/DRB1 03/DQB1 02 - 3,92%, A 24/B 13/C 06/DRB1 07/DQB1 02 - 2,29%, A 25/B 18/C 12/DRB1 15/DQB1 06 - 1,96%, A 24/B 18/C 07/DRB1 11/DQB1 03 - 1,63%, A 30/B 13/C 06/DRB1 07/DQB1 02 - 1,63%.
Технология поиска совместимого донорского образца ГСК ПК в общественном регистре Московского банка стволовых клеток основана на индивидуальном подборе пар донор-реципиент, совместимых по 3 генам HLA-системы (А, В и DRB1) и состоит из ряда последовательных этапов, необходимых для получения положительного результата.
![Оценка слабости и качества жизни у онкогематологических больных [Электронный ресурс]](/i/i/4508/193299.png "Оценка слабости и качества жизни у онкогематологических больных [Электронный ресурс] Успенская Ольга Семеновна")
