Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 14
Технологии сбора тромбоцитов 14
Методы сбора тромбоцитов 18
Тромбоциты из лейкоцитарной плёнки (ТЛП) 18
Тромбоциты из обогащенной тромбоцитами плазмы (ТОТП) 19
Тромбоциты от одного донора (ТОД) 20
Сравнение методов 22
Тромбоциты от одного донора (ТОД) и тромбоциты из лейкоцитарной плёнки (ТЛП) 22
Тромбоциты от одного донора (ТОД) и тромбоциты из обогащенной тромбоцитами плазмы (ТОТП)...23
Сравнение систем сбора тромбоцитов от одного донора (ТОД) 24
Многокомпонентный сбор посредством афереза 29
Стратегии сбора крови и польза для пациентов 31
Лейкоредукция концентратов тромбоцитов 31
Доза тромбоцитов 34
Минимальная доза 34
Расчет дозы 35
Высокая или низкая дозы 35
Преимущества тромбоцитов от одного донора (ТОД) перед тромбоцитами обогащенной тромбоцитами плазмы (ТОТП) и лейкоцитарной плёнки (ТЛП) 39
Преимущества тромбоцитов от одного донора (ТОД) перед тромбоцитами из обогащенной тромбоцитами плазмы (ТОТП) 40
Технологии инактивации патогенов, основной принцип действия 42
Принцип действия системы Мирасол 44
Эффективность технологии ИП Mirasol по инактивации патогенов 46
Эффективность технологии ИП Mirasol по инактивации аллогенных лейкоцитов 47
Преимущество ИП перед гамма/рентгеновским облучением в дозе 25 Грей 48
Новые направления: концентраты тромбоцитов с пониженным содержанием плазмы (ТПСП) 53
Концентрация сбора 54
Вынос плазмы 54
Виды растворов для хранения з
Выбор времени для добавления добавочного раствора 57
Частота образования остаточных агрегатов в концентратах тромбоцитов с пониженным содержанием плазмы (ТПСП) 57
Выбор времени для добавления добавочного раствора 58
Содержание работы 59
Основные этапы исследования 59
Материалы и методы 60
Лабораторная диагностика образцов КТ 62
Результаты 66
Морфологические изменения тромбоцитов в КТ, заготовленных и обработанных разными способами .66
Результаты по исследованию биохимических параметров тромбоцитов, заготовленных разными
способами 73
КТ, заготовленный в 100% плазме (КТ-П) 73
КТ, заготовленный с использованием 30% аутологической плазмы и 70% ДР 74
Сравнение свойств КТ, заготовленных разными способами 75
Исследование спонтанной экспрессии маркеров активации и апоптоза на поверхности тромбоцитов в КТ, заготовленных разными способами 78
Анализ спонтанной экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов в КТ, заготовленных
разными способами 79
Анализ экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах в КТ, заготовленных разными способами 80
Анализ спонтанной экспрессии маркеров активации и апопотоза на поверхности тромбоцитов в КТ, в зависимости от способа обработки 84
Анализ спонтанной экспрессии Р-селектина на тромбоцитах в КТ, обработанных ИП 84
Анализ спонтанной экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах в КТ, обработанных разными способами . 85
Спонтанная экспрессия маркера фосфатидилсерина (связывание аннексии V) тромбоцитами в
зависимости от способа обработки и сроков хранения КТ 88
Анализ индуцированной экспрессии маркеров активации и апоптоза на поверхности тромбоцитов
(активация CRP) в зависимости способа обработки КТ 89
Исследование индуцированной экспрессии Р-селектина (связывание CD62P] 89
Исследование экспрессии фосфатидилсерина (аннексии V) под влиянием индуктора 92
Результаты по сравнению двух методов обработки КТ для инактивации алогенных лекоцитов, присутствующих в компонентах крови 94
Результаты сравнительного анализа клинической эффективности КТ, заготовленных разными способами и обработанных разными методами 96
Сравнительный анализ АПТ и СПТ переливаний КТ, заготовленных разными способами и
обработанных УФ+РФ 97
Сранительный анализ числа неээфективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных разными способами, 100
Сранительный анализ числа неээфективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных разными способами и обработанных УФ+РФ 101
Сранительный анализ числа неээфективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных с ДР и обработанных УФ+РФ 101
Сранительный анализ числа неээфективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных в плазме и обработанных УФ+РФ 102
Заключение: 104
Выводы: 106
Практические рекомендации 108
Список литературы диссертационного исследования
- Тромбоциты из лейкоцитарной плёнки (ТЛП)
- Многокомпонентный сбор посредством афереза
- Преимущества тромбоцитов от одного донора (ТОД) перед тромбоцитами из обогащенной тромбоцитами плазмы (ТОТП)
- Выбор времени для добавления добавочного раствора
Тромбоциты из лейкоцитарной плёнки (ТЛП)
Актуальной задачей сегодня является обеспечение максимальной безопасности компонентов крови, в т.ч. концентратов донорских тромбоцитов. Залог безопасности гемотрансфузионной терапии - это получение высококачественных гемокомпонентов. Необходимо совершенствовать методы заготовки и обработки компонентов крови для уменьшения инфекционных рисков при гемотрансфузиях и профилактики осложнений, связанных с присутствием донорских аллогенных лейкоцитов.
Несмотря на соблюдение таких основных принципов как, создание единой донорской базы, строгая селекция доноров, совершенствование и стандартизация методик по заготовке крови, внедрение новых технологий по обработке компонентов крови, расширение лабораторного скрининга, сохраняется риск инфекционных и иммунологических посттрансфузионых осложнений [38]. Это объясняется рядом причин.
Остается высоким риск получения КТ по гемотрансмиссивным инфекциям (маркеры вирусов гепатитов В и С, ВИЧ) от доноров в период «серологического окна». Остаточный риск трансфузионного инфицирования - ОРТИ (по результатам исследования в 2012 году) составил: ВИЧ - 162 на 1млн. донаций, гепатит В - 337 на 1 млн. донаций, гепатит С - 971 на 1млн. донаций. ОРТИ В США составили: для ВИЧ-2,03; гепатит В - 15,83; гепатит С - 9,70 на 1 млн. донаций.
На основании этих данных видно, что ОРТИ при переливании крови доноров России для ВИЧ, гепатита В и С - соответственно, в 80, 61 и 35 раз выше, чем в США[6]. Этот период серологического окна сокращен с помощью NAT-технологий, но не исключен полностью. Так, использование NAT сокращает период «серологического окна» для ВИЧ до 5 дней, гепатита С - до 3 дней, гепатита В -до 15 дней, при условии проведения индивидуального тестирования. А в большинстве стран, использующих современные методы NAT исследования, проводятся в пулах от 6 до 16, что, в свою очередь, уменьшает чувствительность детекции из-за разведения небольшого количества вируса и увеличивает период «серонегативного окна». В 2014 году Японский Красный Крест полностью перешел на индивидуальное NAT тестирование образцов донорской крови и первыми в мире внедрили обязательное NAT тестирование вируса гепатита Е.
Ограниченный спектр тестируемых вирусов (ВИЧ, вирусные гепатиты В и С, вирус лихорадки Западного Нила), фактически допускающий передачу герпесвирусов, Т-лимфотропного вируса человека (HTLV), вирусов других гепатитов, включая вирусы, неизвестные современной науке [37]. Новые патогены широко распространяются по планете из-за изменений климата, когда в регионах с умеренным климатом происходит потепление, что создает благоприятную среду для существования и размножения вирусов. Дополнительным фактором распространения служит ежегодное увеличение миграционных потоков - сотни тысяч людей ежедневно перемещаются по всему миру, создавая возможность для передачи новых неизвестных патогенов [159].
В связи с этим Министерство Здравоохранения Российской Федерации расширяет спектр тестов: 19 мая 2013 года вышло постановление №52 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Об утверждении СП 3.1.7.3107-13 «Профилактика лихорадки Западного Нила». Пункт 7.4 предусматривает обязательный скрининг методом полимеразной цепной реакции доноров крови и органов в эпидемический сезон на территориях с высоким уровнем эпидемического риска.
Современные серологические тесты в службе крови не предназначены для выявления различных паразитарных заболеваний. Неэкономно и фактически невыгодно продолжать добавлять новые тесты каждые несколько лет в ответ на появление новых агентов.
Сохраняется риск бактериальной контаминации КТ. Для среднего гематологического пациента, который в среднем получает 6 единиц КТ за курс лечения, риск переливания контаминированного КТ составляет Г.250. На основании добровольных отчетов риск возникновения сепсиса после переливания КТ может быть в пределах от 1:50000 до 1:80000. Но, в повседневной практике, случаи сепсиса либо не выявляются, либо не описываются. По данным системы гемонадзора частота случаев передачи сепсиса при переливании КТ в 10 раз может превышать значение, указанное в добровольных отчетах. Следовательно, риск возникновения посттрансфузионного сепсиса в расчете на пациента находится в пределах от 1:833 до 1:1333 [91].
Хранение КТ при комнатной температуре создает благоприятные условия для пролиферации бактерий [40]. Соответственно, риск контаминации КТ увеличивается с каждым днем хранения.
Актуальной проблемой остается не только инфекционная, но и иммунологическая безопасность гемотрансфузионной терапии. Неинфекционные (иммунологические) трансфузионные осложнения связаны с присутствием в компонентах крови жизнеспособных аллогенных лейкоцитов, не смотря на внедрение фильтрации донорской крови. К ним относятся: негемолитические лихорадочные реакции, ТРАЛИ, аллоиммунизация к лейкоцитарным антигенам, формирование рефрактерности к трансфузиям КТ, болезнь «трансплантат против хозяина» [122], [146], [131],[66], [77].
Обеспечение максимальной иммунологической безопасности гемотрансфузий особенно актуально для больных с иммунодепрессией. Это достигается только при строгом соблюдении показаний к переливанию компонентов крови, что ведет к сокращению количества трансфузий, и обеспечении безопасности переливаемых компонентов крови. В большинстве стран Европы, а также в США, в системе учреждений ААВВ, применяется обязательная 100 % лейкодеплеция всех компонентов крови [73]. В РФ внедрение и расширение фильтрационных технологий компонентов крови находятся на начальном этапе внедрения.
Поэтому необходимо постоянно искать и совершенствовать пути обеспечения безопасности гемотрансфузионной терапии.
Существуют различные методы получения концентрата тромбоцитов: из цельной крови и методом афереза. За последние годы во многих изданиях было опубликовано большое число результатов исследований, посвященных анализу различных методик заготовки КТ. Эффективность разных технологий заготовки КТ рассматривают не только с точки зрения качества, эффективности и безопасности продуктов крови, но и обсуждают проблемы безопасности доноров и производительности пунктов взятия крови. Там, где возможно, это сделано с помощью сравнительных исследований, что позволяет смотреть на проблему шире. Поскольку банки крови часто использует сочетание различных методов сбора и некоторые из них не основаны на аферезе, проведена сравнительная оценка афереза с другими методами.
Многокомпонентный сбор посредством афереза
После лейкоредукции содержание лейкоцитов донора в компонентах крови снижается с lxl(Р до менее чем 1х106 в 1 л. Во многих странах Европы, в Австралии, Японии и Канаде лейкоредукция проводится в обязательном порядке; в США она является факультативной, но частота ее применения возрастает [27]. Другие страны применяют лейкоредукцию избирательно для поддержки определенных категорий пациентов, преимущественно для больных со злокачественными образованиями с нарушениями функции иммунной системы, а также для новорожденных. Во избежание развития ПТ-РТПХ у пациентов с серьезными нарушениями иммунной системы перед трансфузией проводится стандартная обработка компонентов крови гамма-излучением (доза 25-30 Гр). После обработки гамма- излучением содержание жизнеспособных лейкоцитов в крови донора снижается на 5-6 log [122].
С целью предотвращения ПТ-РТПХ применение системы ИП с УФ+РФ является безопасной"альтернативой"обработке гамма-излучением.
Проводилось сравнение способности к пролиферации в ответ на ряд стимулов для трех категорий лейкоцитов: не прошедших обработку, обработанных гамма-излучением и обработанных в УФ+РФ. В качестве стимулов применялись стимулирующие аллогенные клетки, фитогемагглютинин (ФГА) и антитела к рецептору Т-лимфоцитов (aHTH-CD3/CD28). В отличие от лейкоцитов из контрольной группы, не подвергавшихся обработке, лейкоциты, обработанные УФ+РФ, не были способны пролиферировать в ответ на какой-либо из трех применявшихся стимулов [59], [58]. Следует также отметить, что уровень пролиферации лейкоцитов, обработанных ИП, был значительно ниже, чем уровень пролиферации лейкоцитов контрольной группы, обработанных гамма-излучением. В дополнение к этому было проведено измерение жизнеспособности лейкоцитов, обработанных ИП, с применением метода серийных разведений (МСР). После обработки в системе ИП с применением УФ+РФ лейкоциты были инактивированы до предела обнаружения МСР ( 6 log) [59] Необходимо было подтвердить полученные результаты in vivo в опытах, измеряющих отвечаемость in vivo как для обработанных, так и для необработанных лейкоцитов. В исследовании авторов Fast и др. было показано, что у животных, которым была проведена трансфузия лейкоцитов, обработанных ИП с применением УФ+РФ, реакция ТПХ не развивалась, о чем свидетельствовало отсутствие характерных для реакции симптомов, не было выработки антител и повышения уровня цитокинов человека. Помимо этого в исследованиях in vitro и in vivo было продемонстрировано, что обработка по данной технологии в цельной крови до разделения ее на компоненты позволяет эффективно инактивировать лейкоциты [60].
Значит, обработка КТ по технологии ИП обладает такой" же эффективностью для предотвращения ПТ-РТПХ, что и обработка гамма-излучением. Во многих центрах переливания крови таких стран, как Франция, Испания, Австрия, Люксембург и Катар, после обработки КТ на основе УФ+РФ гамма-облучение больше не применяется.
Пациент при переливании компонентов крови подвергается воздействию широкого спектра аллоантигенов, расположенных на поверхности лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов донора. У многих реципиентов после трансфузии возникает рефрактерность к последующим переливаниям тромбоцитов, развивающаяся в результате выработки аллоантител. Частота развития аллоиммунизации среди гематологических больных, которым систематически требуется переливание тромбоцитов, составляет от 20% до 60% [146], [131]. В клиническом исследовании, в котором изучалось снижение частоты развития аллоиммунизации к тромбоцитам, выработка аллоантител наблюдалась у 17— 21% пациентов, получавших лейкоредуцированные КТ, и у 45% пациентов, получавших КТ без лейкоредукции [156].
Были проведены исследования in vitro и in vivo для изучения аллоиммунизации к компонентам крови. In vitro воспроизводился иммунный ответ реципиента на антигены клеток донора при помощи смешанной культуры лимфоцитов. Была доказана неспособность клеток, прошедших обработку в системе Мирасол, стимулировать пролиферацию лейкоцитов реципиента (клетки-ответчики) [82п
А при воздействии на лейкоциты гамма-облучения, клетки продолжают вырабатывать антигены и активируют аллогенные лейкоциты [82], [59]. Для доказательства этого факта были проведены исследования in vivo. При переливании необработанных клеток мышам и крысам наблюдали выработку аллоантител в организме животных, а при переливании клеток, обработанных в системе ИП (УФ+РФ), этого не наблюдалось [23], [81].
На основании данных клинического исследования (MIRACLE) были получены следующие выводы: показатель CI при переливании КТ, обработанных УФ+РФ, был ниже вначале (за 1ч и 24ч), чем в контрольной группе, где КТ не подвергались обработке. Но, при последующих трансфузиях КТ в контрольной группе отмечается неуклонное снижение CI, а при переливании КТ, обработанных УФ+РФ, средний показатель прироста тромбоцитов оставался на прежнем уровне.
Причина снижения CI при переливании необработанных КТ заключается в развитиии аллоиммунизации, что подтверждается результатами исследования TRAP- эффект снижения CI сопровождался высокими уровнями антител HLA [156], [83].
Соответственно, доказано на сегодняшний день, что лейкоциты, обработанные по технологии с применением УФ+РФ, не способны к стимуляции аллогенных клеток в организме реципиентов, что предотвращает аллоиммунизацию, а, следовательно, и развитие рефрактерности при множественных трансфузиях КТ.
Фебрильные негемолитические трансфузионные реакции возникают у больных при переливании КТ в среднем с частотой 1:20 и вызваны цитокинами (их называют эндогенные пирогены), продуцируемые аллогенными донорскими лейкоцитами [66],[77]. Лейкоредукция снижает, но не исключает полностью
Преимущества тромбоцитов от одного донора (ТОД) перед тромбоцитами из обогащенной тромбоцитами плазмы (ТОТП)
Можно видеть, что в обоих КТ сохранялась высокая метаболическая активность тромбоцитов. В КТ с ДР в течение первых 24 часов хранения регистрировался «всплеск» образования лактата, который в сочетании с умеренным потреблением глюкозы (по степени уменьшения ее концентрации) свидетельствовал, что в этот период в тромбоцитах превалировали процессы анаэробного метаболизма. Процесс аэробного окисления глюкозы становился наиболее выраженным к 5 суткам хранения [11.] При заготовке КТ с добавочным раствором уровень глюкозы и содержание лактата несопоставимы с такими же параметрами в КТ-Плазма (согласно разведению). При сравнении скорости метаболических процессов в обеих КТ отмечается снижение метаболизма в КТ-ДР, что проявляется уменьшением скорости потребления глюкозы и образования лактата в динамике по сравнению с КТ-Плазма (рис.14,15).
Интегральным показателем жизнеспособности переливаемых тромбоцитов является рН среды, в которой они хранятся. Значение рН может служить косвенным индикатором бактериальной контаминации КТ. Приснижении рН раствора - жизнеспособностьтромбоцитов падает.
Качество тромбоцитов зависит и от способа их приготовления и условий хранения, включая продолжительность хранения, тип контейнера и среду хранения (плазма или взвешивающий раствор) [168]. Показатели рН, взвешенных в плазме, вначале увеличиваются до пикового значения примерно на 2-й день хранения, по причине выхода СОг из контейнера с тромбоцитами. Затем рН постепенно снижается по причине образования молочной кислоты в процессе гликолиза, что является основной причиной окисления. Данный процесс может варьироваться в зависимости от того, из какого материала изготовлен контейнер для хранения крови [53] [48]. В исследованиях Picker et al. и Macher et al. значения рН для всех КТ находились значительно выше минимальных значений, установленных нормативными стандартами (6,4)- по стандартам Европы [43]. В России - нормативы по рН составляют 6,4-7,4 [13].
При сравнении двух платформ заготовки КТ более низкие значения уровня лактата в сочетании с более высокими значениями рН и глюкозы были в КТ в конце периода хранения, полученных с помощью платформфы Trima Accel (ТА), по сравнению с Amicus и MCS +. Это говорит о лучшей газопроницаемости контейнера для тромбоцитов, используемого в технологии ТА, которая поддерживает аэробный метаболический гликолиз, а не гликолиз для выработки энергии в тробоцитах [174]. Высокая газопрницаемость позволяет сохранить приемлемое качество тромбоцитов в течение семи дней [56]. Российские нормативы качества контейнеров проницаемость газов не регламентируют [5] и М Исследование спонтанной экспрессии маркеров активации и апоптоза на поверхности тромбоцитов в КТ, заготовленных разными способами
Маркеры активации тромбоцитов являются важными показателями in vitro качества тромбоцитов (их жизнеспособности и функциональной активности). Функциональное состояние переливаемых тромбоцитов имеет первоочередное значение для купирования геморрагического синдрома (остановки кровотечения) [9]. На посттрансфузионную активность тромбоцитов оказывает влияние любое воздействие на клетку в процессе заготовки и хранения КТ, а также в процессе обработки клеток, что может приводить не только к изменениюбиохимических параметров среды, окружающую тромбоциты, но и к выраженным изменениям самих тромбоцитов - активации тромбоцитов, стимуляции реакции высвобождения содержимого гранул. Поэтому исследование in vitro маркера активации в КТ поможет прогнозировать его посттрансфузионные свойства. Доказана обратная корреляция экспрессии Р-селектина с величиной посттрансфузионного восстановления тромбоцитов через 15-60 минут после трансфузии и величиной СПТ через 1 час после переливания [135]. Важным прогностическим признаком функциональной активности и жизнеспособности тромбоцитов после трансфузии является определение связывания аннексина V с фосфатидилсерином [39].
Другие исследователи [114] считают, что ни один из маркеров активации тромбоцитов не оказался эффективным предиктором восстановления или выживаемости тромбоцитов после переливания. Таким образом, этот вопрос остается открытым на сегодняшний день.
Следующим этапом нашего исследования было изучение и сравнение спонтанной экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина в зависимости от способа заготовки АКТ. По результатам исследования антигенной структуры тромбоцитов в обеих группах (КТ-Плазма и КТ-ДР) наблюдалось статистически значимое увеличение уровней экспрессии Р-селектина (связывание CD62P) и фосфатидилсерина (связывание аннексинаУ) в течение всего периода наблюдения (таблица 14, рисунок 16, 17). Сразу после заготовки в обеих группах КТ наблюдался одинаково низкий уровень экспрессии Р-селектина в КТ-Плазма - 0,2-5,7 % и в КТ-ДР - 0,3-5,1%. Далее (1-й и 3-й дни ) в процессе хранения отмечается достоверное повышение степени активации тромбоцитов в КТ, заготовленных в плазме, по сравнению с КТ, заготовленных в ДР (р=0,01 и р=0,0004). Содержание С062Р-положительных клеток в КТ-Плазма на 1-й день после заготовки составляет 0,5-7,9%, на 3-й день 1,3-12%; в КТ-ДР соответсвенно 0,3-6,2%) и 0,5-6,3% (рис. 16.,табл. 14).
Выбор времени для добавления добавочного раствора
Результаты клинической эффективности, полученные в нашем исследовании, согласованы с зарубежными данными. В рамках исследования [103] по оценке безопасности и эффективности обработанных тромбоцитов с помощью системы на основе УФ+РФ, не было выявлено преимуществ одного метода по сравнению с другим. Автор утверждает, что для соответствия критериям отсутствия преимуществ одного метода по сравнению с другим абсолютное различие между двумя группами по величине CCI должно быть менее 2940. С учетом этого между переливаниями КТ в группе обработанных ИП и контрольной группой не было различий в среднем числе дней между трансфузиями, в среднем числе трансфузий концентрата тромбоцитов на одного пациента, а также в дозе перелитых тромбоцитов и по количеству посттрансфузионных осложнений.
Slichter S. J. и Jackman R. Р. провели клиническое испытание (MIRACLE) по клинической оценке переливаний КТ, обработанных ИП. Пациенты, получавшие тромбоциты, обработанные ИП, вначале показывали более низкий средний показатель прироста тромбоцитов (CI) за периоды 1 ч и 24 ч по сравнению с контрольной (необработанные) группой КТ. В ходе последующих трансфузий показатель прироста КТ-М не снижался. В противоположность этому величины показателей прироста тромбоцитов в контрольной группе неуклонно понижались по мере увеличения количества трансфузий. Одна из возможных причин такого результата при переливании тромбоцитов в динамике заключается в развитии аллоиммунизации пациента; в клиническом исследовании TRAP этот эффект сопровождался высокими уровнями антител HLA [156], [82]. Для пациентов, получающих аллогенный концентрат тромбоцитов, повышается вероятность выработки более высокого уровня антител в организме реципиента, что приведет к выведению тромбоцитов из кровотока. В настоящее время проводятся клинические исследования, направленные на изучение наличия корреляции между показателями прироста тромбоцитов и выработкой аллоантител при переливании КТ, обработанных ИП.
Повышенный интерес к заготовке концентратов тромбоцитов с применением добавочных синтетических растворов отмечался еще с начала 90-х годов прошлого века. Первоначально такая технология внедрялась в качестве плазмосберегающей, но на сегодняшний день все больше рассматривают такой способ заготовки КТ с целью снижения аллоиммунизации на фоне роста числа трансфузий пациенту. С другой стороны, применение добавочных растворов должно обеспечивать лучшую сохранность тромбоцитов в процессе хранения.
Мы проанализировали морфологические и функциональные характеристики КТ, заготовленные методом афереза с использованием добавочного раствора. Полученные результаты показали, что использование добавочного раствора по сравнению с плазмой снижает спонтанную активацию тромбоцитов и способствует сохранению функциональной активности и жизнеспособности клеток при хранении КТ. Морфологические признаки тромбоцитов при обоих способах заготовки КТ были неизменными, а интенсивность процессов метаболизма в КТ с добавочным раствором была ниже, чем в КТ, заготовленных в плазме. В целом, можно сделать заключение, что условия хранения КТ с добавочным раствором обеспечивают стабильность метаболических процессов в течение всего периода хранения КТ. С помощью оптимизированных синтетических взвешивающих растворов в сочетании с оптимизированными сетами для заготовки КТ и контейнерами для хранения, качество тромбоцитов во время хранения улучшается. Этим самым решается важная практическая задача службы крови - максимальное сохранение жизнеспособности целевых клеток.
Морфологических изменений не выявлено при обработке КТ, заготовленных обоими способами и подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 25 Гр.
Метод обработки клеток Rg-облучением не приводит к увеличению экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина в течение всего периода хранения.
При исследовании антигенной структуры тромбоцитов были выявлены более низкие уровни экспрессиии маркеров Р-селектина (связывание с CD62P) и фосфатидилсерина (связывание с аннексином V) в КТ, заготовленных с добавочным раствором и не наблюдалось значимых изменений по экспрессии указанных маркеров в течение всего периода хранения обоих групп КТ при их обработке рентгеновским облучением.
Данные выводы были подтверждены результатами клинического исследования по переливаниям КТ, заготовленных разными способами. Не смотря на то, что по таким параметрам оценки клинической эффективности, как абсолютный и скорректированный прирост тробоцитов, группа КТ с добавочным раствором показала более низкие значения, чем КТ в плазме, но величина межтрансфузионного интервала была одинаковой в обеих группах КТ. По количеству неээфективных трансфузий и посттрнасфузионных осложнений (фибрильные негемолитические реакции) КТ с добавочным раствором показали явное превосходство по отношению к КТ в плазме.
Нами было доказано, что обработка КТ по технологии инактивации патогенов с применением ультрафиолетового облучения с рибофлавином, влияет на морфофункциональные характеристики тромбоцитов, что проявляется в увеличении морфологических параметров клеток к пятому дню хранения. Обработка КТ по технологии инактивации патогенов приводит к активации тромбоцитов и запуску в них апоптоза в течение хранения. И эти процессы нарастают к пятым суткам.
Выявленные изменения тромбоцитов при обработке по технологии инактивации патогенов находят свое отражение при последующем анализе клинического применения КТ, заготовленных двумя способами и подвергнутых обработке ультрафиолетовым облучение и рибофлавином. Переливания КТ, подвергнутые инактивации патогенов, характеризуются более низкими значениями абсолютного и скорректированного приростов по сравнению с необработанными КТ, более коротким межтрансфузионным интервалом и большим количеством неэффективных трансфузий.
Нами была доказана равнозначность обоих методов обработки КТ с целью профилактики РТПХ у пациентов: Rg-облучение, как и инактивация патогенов, эффективно снижает способность аллогенных лимфоцитов к пролиферации. Поэтому необходимо наряду с новым способом инактивации лимфоцитов (ИП) активно применять и стандартный метод облучения клеток в дозе 25 Гр, учитывая его меньшую степень воздействия на клетки.
Доказав и подтвердив лучшую сохранность тромбоцитов при заготовке КТ с помощью автоматизированного афереза с использованием добавочного раствора, данный метод заготовки аферезных концентратов тромбоцитов в педиатрической практике можно считать приоритетным. Данный способ заготовки КТ решает проблему уменьшения трансфузионной нагрузки на пациента и проблему снижения вероятности развития посттрансфузионных реакций.
Данная работа имеет большое практическое значение для клинических трансфузиологов и гематологов. Наши выводы и рекомендации помогут врачам выбрать правильную тактику трансфузионной терапии пациентам.
