Введение к работе
Актуальность темы. Основная задача делящейся клетки - обеспечить равное разделение генетического материала между дочерними клетками (Алов 1972). Каждая из двух сестринских хроматид в хромосоме должна уйти в свою клетку. Это возможно с помощью полярных белковых полимеров -микротрубочек, которые во время митоза образуют веретено деления. Микротрубочки являются механическими элементами цитоскелета, и в то же время высоко динамичны. Своими минус-концами они прикрепляются к полюсам веретена деления, а плюс-концы постоянно удлиняются и укорачиваются, и способны присоединяться к хромосомам и двигать их. Хромосомы присоединяются к микротрубочкам с помощью белкового суперкомплекса, называемого кинетохором (Mcintosh et al. 2002, Maiato et al. 2004, Westermann et al. 2007). Каждая хроматида из пары, составляющей хромосому, прикрепляется к микротрубочкам, идущим от своего полюса. Кинетохоры крепко связываются с динамическими концами (плюс-концами) микротрубочек, однако субъединицы тубулина по-прежнему могут добавляться или отсоединяться от концов микротрубочек. Понимание механизма, который бы позволял этому закреплению быть одновременно стабильным (нестабильные закрепления приводят к потере хромосом и анеуплоидии) и в то же время динамичным (нарушение динамики микротрубочек останавливает митоз) - один из основных вопросов в области биологии, изучающей деление клетки. Сегодня известно более 100 белков, входящих в состав кинетохора, однако ясной картины механической машины, обеспечивающей его связь с микротрубочкой, до сих пор нет. Сложность связана как с разнообразием теоретических представлений о потенциальном принципе работы такого устройства, так и с тем, что экспериментальная проверка подобных гипотез зачастую была невозможна из-за отсутствия биохимических кандидатов на роль этих устройств.
В связи с этим актуальны исследованиия сопрягающих свойств наиболее вероятных кандидатов на роль посредника между микротрубочкой и кинетохором. Такими кандидатами в настоящее время считаются комплекс а
Daml/DASH, а также компоненты супер-комплекса KMN (KNL-1, Misl2, Ndc80). Комплекс Daml/DASH может существовать в виде колец и спиралей, также предполагается существование олигомеров меньшего размера. Компоненты суперкомплекса KMN Ndc80 и KNL1 имеют форму фибрилл. В качестве необходимого этапа такие исследования должны включать сравнение полученных данных с математическими моделями передвижения груза разбирающейся микротрубочкой посредством кольца (Efremov et al., 2007) или фибрилл (Mcintosh et al., 2008).
Цель работы: Экспериментальное исследование движения белковых комплексов Daml, Ndc80, Misl2 и белка KNL1 за деполимеризующимися микротрубочками.
Задачи исследования:
-
Исследовать свойства кольцевых и иных комплексов Daml, взаимодействующих с деполимеризующимися микротрубочками. Выяснить возможный механизм сопряжения движения груза с деполимеризацией микротрубочки при помощи кольцевых комплексов Daml.
-
Выяснить экспериментальную возможность работы такого сопрягателя на основе фибриллярных белковых комплексов.
Научная новизна.
В работе впервые установлено, что комплекс Daml образует на динамических микротрубочках как кольца, так и комплексы меньшего размера. Показано, что максимальный размер олигомера, который способен двигаться под действием деполимеризации микротрубочки, не превышает одиночного кольца. Установлено, что кольца замедляют разборку микротрубочки, причем размер и скорость двигающегося комплекса не изменяются во время движения. При этом, если олигомеры большего размера образуются спонтанно или в результате столкновения двух колец, то разборка микротрубочки приостанавливается до тех пор, пока кольцо, находящееся ближе к плюс-концу
микротрубочки, не разрушится. Показано, что существует два различных механизма движения груза (стеклянного шарика) за концом микротрубочки с участием комплексов Daml. В случае, когда шарик прикреплен к микротрубочке через кольцо, шарик двигается медленно, не меняя своей ориентации относительно микротрубочки. Если же шарик, покрытый Daml, прикреплен без участия кольца, то он двигается быстро и катится по поверхности микротрубочки. На основании совокупности полученных данных сделан вывод, что движение хромосом в клетке почкующихся дрожжей происходит с участием колец. Методами флюоресцентной и электронной микроскопии установлено, что комплексы Daml, которые не образуют колец, весьма разнообразны по своему размеру и форме. Показано, что такие комплексы также способны двигаться с концом разбирающейся микротрубочки. Установлено, что фибриллярные белки, которые не могут образовывать колец в принципе, также способны преобразовывать усилие, развиваемое при деполимеризации микротрубочки, в движение груза. Этот результат подтверждает опубликованные данные о разной роли компонентов суперкомплекса KMN в связывании кинетохора с микротрубочкой.
Научно-практическое значение.
Фундаментальным результатом данной работы является вклад в понимание механизмов присоединения кинетохоров к микротрубочкам во время деления клетки.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Описаны два принципиально отличающихся механизма взаимодействия комплекса Daml с микротрубочкой: кольца (19 ± 3 гетеродекамеров), и более мелкие олигомеры (9 ± 1 гетеродекамеров). Более крупные олигомеры не двигаются по микротрубочке.
-
Охарактеризованы два механизма, с помощью которых Daml трансформирует энергию деполимеризации микротрубочки в
движение груза. Первый механизм существует в отсутствие колец, и шарик в этом случае быстро катится по микротрубочке. Второй механизм представляет собой медленное скольжение шарика, связанного с кольцом на микротрубочке.
3. Фибриллярные комплексы, входящие в состав суперкомплекса KMN, охарактеризованы в отношении их сопрягающих свойств. Наилучшими сопрягателями из них являются белок KMN и комплекс Ndc80, которые обеспечивают непрерывное движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Daml (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.
Апробация работы состоялась 15 февраля 2011 г. на заседании межлабораторного семинара лаборатории молекулярных механизмов гемостаза и лаборатории физиологии и биофизики клетки в Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Материалы диссертации докладывались на международной конференции 48th annual meeting of American Society for Cell Biology (San Francisco, СА, США, 13-17 декабря 2008 г.) и международной конференции 54th Annual Meeting of the Biophysical Society (San Francisco, СА, США, 20-24 февраля 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 2-х конференций и 3 статьи.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах
