Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Нерезонансная спектроскопия комбинационного рассеяния белков и пептвдов. современное состояние . 6
1.1. Колебания полипептидной цепи белковых молекул 8
1.2. Колебания боковых цепей 15
1.3. Изучение пространственной структуры белковых молекул в различных агрегатных состояниях объекта 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 34
ГЛАВА 3. Колебания боковых цепей белковых молекул. закономерности изменения колебаний доульфвдных мостиков в зависимости 45
3.1. Расчеты нормальных колебаний , 45
3.2. Экспериментальное изучение модельных соединений и белков, в области колебаний дисуль-фидных мостиков 60
ГЛАВА 4. Применение спектроскопии кр для изучения пептидов и белков 77
4.1. Анализ спектров КР апамина 77
4.2. Изучение кальций-связывающих белков на примере кальмодулина и фосфолипаз Ао из различных источников 93
ГЛАВА 5. Применение спектроскопии кр для изучения гамма-облученных растворов инсулина и альбумина ISO
Выводы 159
Литература 162
- Колебания боковых цепей
- Изучение пространственной структуры белковых молекул в различных агрегатных состояниях объекта
- Экспериментальное изучение модельных соединений и белков, в области колебаний дисуль-фидных мостиков
- Изучение кальций-связывающих белков на примере кальмодулина и фосфолипаз Ао из различных источников
Введение к работе
Одной из важных проблем химической физики является изучение пространственного строения молекул и его влияния на механизмы и скорости процессов с их участием. В ряду различных физико-химических методов исследования макромолекул, важнейшими из которых, в частности, являются молекулы пептидно-белковой природы, лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) зарекомендовала себя за последнее время как один из наиболее информативных оптических методов. В настоящее время спектроскопия КР переживает бурное развитие, связанное как с расширением и усложнением типов изучаемых объектов и систем, так и с развитием новых методических подходов и технических усовершенствований в нерезонансных и резонансных методах спектроскопии КР света. Одной из отличительных черт этого метода, обеспечивших его применимость и большую значимость, является возможность получения и сопоставления спектров в различных агрегатных состояниях вещества: растворах, порошках, кристаллах и т.д. в том числе, что принципиально важно для биологических систем, в интактном состоянии. Это преимущество особенно важно при изучении пространственной структуры белков и пептидов, ее сопоставлении в растворах и кристаллах, при исследовании влияния воды и растворенных веществ на конформации этих объектов. Достоинством метода при изучении белков и пептидов является и то, что в их спектрах КР сочетается информация о пространственной упаковке полипептидной цепи и зачастую уникальные сведения о состоянии и контактах ряда боковых цепей отдельных аминокислотных остатков. Особо следует отметить в этом отношении колебания с еру содержащих аминокислотных остатков и дисульфидных мостиков, важную информацию о конфигурации которых можно было _ 4 - получить только в кристаллическом состоянии образца на основе данных рентгеноструктурного анализа. Это само за себя говорит о том, что такая информация может быть получена не всегда и с большим трудом. Причем решение вопросов о количестве с еру со держащих групп, их состоянии и превращениях в процессе функционирования молекул или в интактном состоянии сложных систем до сих пор является сложной проблемой. Множество различных химических методов определения серусодержащих групп наделено тем принципиальным недостатком, что они связаны с необходимостью реакционного вмешательства. Развитие метода КР-спектроскопии с использованием его возможностей и преимуществ для этих целей становится особо актуальным и сулит заманчивые перспективы. В настоящее время, спектроскопия КР белков и пептидов является мало разработанной в методическом отношении и в плане интерпретации спектров по сравнению с другими традиционными методами оптической спектроскопии, такими как флуоресценция, поглощение, круговой дихроизм и др. Информация, получаемая из анализа спектров КР на основе современных спектрально-структурных корреляций имеет, главным образом, качественный характер, причем не всегда данные авторов различных методических работ (посвященных, в частности, анализу спектров серусодержащих остатков) находятся в согласии, имеется ряд нерешенных вопросов, связанных с возможностью получения количественной информации. В этой связи особую актуальность приобретают работы, направленные на повышение информативности анализа спектров КР белков и пептидов и расширение возможностей применения метода. Изучение на основе спектров КР особенностей пространственной структуры белковых молекул в сопоставлении с активностью и их изменении под влиянием различных факторов среды или физических воздействий (УФ-свет, ионизирующие излучения) представляет инте- pec не только в фундаментальном плане (так как дает информацию для формирования представлений о структурно-функциональных связях), но и актуально рядом своих прикладных аспектов. Так, большой интерес вызывает вопрос о радиационной модификации структуры молекул белков в растворах, важный как для радиобиологии, так и для некоторых отраслей промышленности, использующих излучения. В частности, в последнее время появились обоснованные перспективы использования в ближайшие годы в производстве лекарственных препаратов нового метода стерилизации, основанного на облучении замороженных растворов. Спектры КР отражают целостность конформа-ции полипептидных цепей белковых молекул, в значительной мере определяющих активность лекарственной формы на их основе, и могут дать детальную информацию о других наиболее уязвимых элементах структуры этих соединений.
В соответствии с задачами настоящей работы был осуществлен и выбор объектов исследования. Среди различных молекул белково-пептидной природы, структура и функции которых, в настоящее время, являются предметом интенсивных исследований и данные спектроскопии КР, в соответствии с используемым в нашей работе подходом, представляют значительный интерео, предпочтение было отдано тем молекулам, физико-химические свойства которых наиболее благоприятствовали развитию и применению спектрально-структурных корреляций.
Колебания боковых цепей
Благоприятной особенностью спектров КР белков является активность той или иной мере,различных колебаний всех боковых остатков . Подробное отнесение этих колебаний на основе спектров аминокислот и пептидов было проведено в работе /24/. Особо интенсивными и резкими (узкополосными) колебаниями характеризуются остатки ароматических аминокислот и гистидина, серусодержащие остатки (Cys,Met) и карбоксилсодержащие остатки. Изучение спектрально-структурных корреляций для этих остатков представляет интерес не только потому, что они реакционно способны и входят в состав различных функционально важных центров белков, но и по той причине, что эта информация может быть ценна для представления о третичной структуре белковых молекул.
Наибольший прогресс достигнут при изучении колебаний остатка тирозина. Ранее состояния остатков тирозинов изучались, главным образом, методами спектрофотометрии и химической модификации.. И хотя различные параметры спектров УФ-поглощения и флуоресценции в некоторой степени могут быть чувствительны к изменениям состояния остатков тирозина и его окружения, однозначные и надежные отнесения спектральных изменений могут быть даны при их ионизации. Таким образом, рН титрование позволяет определять значения рК различных остатков, и для этих характеристик сложились термины "нормальное" и "аномальное" рК в зависимости от окружения остатка. "Нормальные" рК 10 характерны для остатков тирозина, доступных растворителю и различным химическим реагентам так же, как и свободные аминокислоты. "Аномально" высокие рК ( П.0) от вечают остаткам либо недоступным растворителям и реагентам и углубленным в гидрофобную область белка, либо по каким-то другим причинам, как, например, близость зарядов, ионогенных групп или наличие водородной связи.
Использование спектров КР позволяет в значительной мере детализировать сведения о состоянии остатков тирозина, его окружения и причинах возможных аномалий. В значительной мере,это стало возможным благодаря работе Сиамвизы и коллег /25/, где были изучены спектры КР тирозина, его производных и соединений, моделирующих его остаток, а также выполнены расчеты нормальных колебаний и привлечены данные рентгеноструктурного анализа и других методов. Авторами дана интерпретация линий спектра, в частности, показано, что дублет около 850 и 830 см х является Ферми-резонансом колебаний обертона 2\?i(jQ и основным колебанием 0. (см. рис. 1.3), а отношение интенсивностей полос дублета зависит от возмущений этих частот. Были подробно исследованы факторы, способные повлиять на отношение интенсивностей дублета: возможное влияние изменения окружения бензольного кольца при изменении растворите- . лей; состояния фенольной гидроксильной группы (свободное, водород-носвязанное и ионизованное); возможное влияние конформации аминокислотного остова. На основе экспериментального изучения этих -факторов и привлечения данных рентгеноструктурного анализа было показано, что интенсивность полос дублета определяется,главным образом состоянием фенольной гидроксильной группы и малочувствительно к окружению и конформации аминокислотного остова. Зависимость отношения интенсивностей в дублете от состояния гидроксильной группы на основе данных /25/ представлена нами на рис. 1.4. В силу правил отбора эти колебания неактивны в ИК спектрах, поэтому эти данные уникальны.
В районе 1600-1620 см лежат колебания остатков Туг , активные как в ЙК, так и в КР спектрах, и также чувствительные к изменению состояния ионизации остатка. В работе Чиргадзе и др. /26/ определены молярные экстинкции для полос 1616 см"1 и 1601 см"1, относящихся к нормальному и ионизованному состояниям, соответственно, что позволяет определять рК различных остатков и по ИК спектрам. В спектрах КР отношение T1Go1 /J so более ярко отражает ионизацию остатков тирозинов, чем это проявляется в Ферми-резонансном дублете /27/. Однако, следует отметить, что при рН титровании в определенных случаях конформационные изменения _т могут влиять на интенсивную полосу около 1450 см , которая использовалась выше в качестве эталона, как это наблюдалось при денатурации инсулина /4/. Для этих целей, на наш взгляд, более под т ходила бы полоса около 624 см х остатка фенилаланина, колебания которого конформационно-нечувствительны.
Ряд узких интенсивных линий характеризует остаток триптофана, среди них наиболее информативны, по имеющимся данным, полосы 1341 и особенно IS6I см . Природа наиболее интенсивных полос изучена в /28/, в частности ,в полосу 1361 см значительный вклад дает деформационное N-K колебание, т.к. она сильно смещается при дейтерозамещении индольного кольца. С чувствительностью этой полосы к окружению остатка связывалось резкое уменьшение ее интенсивности при изменении рН от 6,6 до 2,1.и лиофилизации раствора с/.-лактальбумина /29/. Высокая интенсивность этой полосы, сравнимая с 1340 см у в спектре КР белка (I1J6j /Т 0 1 ) свидетельствует о наличии гидрофобных контактов триптофана с неполярными боковыми цепями алифатических остатков /30,31/. Кроме того, к. окружению чувствительны полуширины этих полос, так что в гидрофобном окружении минимум между ними относительно глубже, и как бы заполняется при переходе в более экспонированное растворителю состояние. Такая картина наблюдалась при необратимой денатурации лизоцйма, что было связано с переходом остатка триптофана в более гидрофильное окружение /31/. Таким образом, интенсивность полосы 1361 см"1 может служить чувствительным индикатором полярности окружения остатка триптофана.
Полосы колебаний остатков гистидина в спектрах КР белков проявляются относительно слабо по сравнению с остатками ароматических аминокислот и оказываются конформационно-нечувствительныгли. Однако, ионизация остатка сказывается на его спектре. Как было показано в работе /32/, в спектрах КР дейтерозамещенных белков обнаруживается достаточно интенсивная и слабо маскируемая.другими белковыми колебаниями при кислых рн полоса около 1408 см х, отнесенная к остатку 1т+(М-Б) , по которой можно определять рК гистидина. При переходе к щелочным рН кроме исчезновения этой полосы наблюдается смещение полос 1602 к 1565 см и ІІІ0 см . к 1098 см""1, которые тоже, если не будут перекрыты другими колебаниями, могут быть использованы для оценки состояния ионизации остатка.
Изучение пространственной структуры белковых молекул в различных агрегатных состояниях объекта
Одним из наиболее важных достоинств спектроскопии КР является принципиальная возможность получения спектров в различных агрегатных состояниях вещества и, что особенно важно для биологических систем, в их интактном состоянии. Это позволяет получать очень ценные сведения как в теоретическом аспекте о влиянии среда и, в частности, связанной воды на пространственное строение биомолекул, так и практически важные данные о переносимости данных рентгеноструктзгрного анализа о пространственном строении молекул в кристалле к их состоянию в нативной среде. Эта возможность КР спектроскопии уникальна.
Целый ряд работ в этом направлении, опубликованных в последние годы, служит практическим тому подтверждением. Детальное изу - ЗО чение вопроса о пространственной структуре белков в водных растворах, лиофилизированном состоянии и в кристаллах было предпринято Най-Тень Ю с коллегами /47-50/. Спектры КР монокристалла.рибонуклеази А заметно отличаются от спектров КР в водном растворе в области колебаний остатков тирозина и дисульфидных мостиков, тогда как в области .Амид III они не отличаются друг от друга /47/. Это свидетельствует о схожести пространственной упаковки полипептидных цепей в целом с некоторыми локальными различиями в областях дисульфидных мостиков и остатков тирозинов. Ярковыраженные отличия спектров КР в областях колебаний как боковых цепей, так и основной цепи наблюдались для кристаллов и растворов карбокси-пептидазы А и инсулина, что указывает на отличие конформаций этих белков в кристаллах и (усредненной) в растворенном состоянии /47, 48/. В то же время конформаций е - лакгальбумина в кристалле и растворе не обнаруживают различий в спектрах КР /49/. Исследования этих белков в лиофилизированном состоянии с различной насыщенностью связанной водой свидетельствуют о существенном ее влиянии в ряде случаев не только на ориентацию боковых цепей аминокислотных остатков, но иной раз и на упаковку поверхностных фрагментов полипептидной цепи.
В качестве примеров использования этой техники при изучении надмолекулярных биологических структур в интактном состоянии можно привести ряд работ, посвященных изучению хрусталиков глаза человека, некоторых млекопитающих и птиц /48,51-53/. Спектры КР дали информацию о пространственном строении семейства белков (d , р , f ,8 -кристаллины), являющихся основным строительным материалом этих хрусталиков. Причем белки, находящиеся в сердцевине хрусталиков (nucleus) имеют иное пространственное строение, чем белки, находящиеся ближе к поверхности ( cortex ). Важным резуль - ЗІ татом было и то, что спектры КР показали наличие свободных сульф-гидрильных функционально важных групп, которые при биохимических методах исследования в процессе выделения белков подвергались аэробному окислению. При изучении эффектов старения было показано участие в них 2SH-»S-S замыканий, скорость которых имела видовую специфичность. Эти же группы принимают участие в процессах метаболизма. Большая практическая ценность этих результатов заключалась также и в той информации, которую они дали,например, для понимания процессов развития катаракты хрусталиков глаза, и возможности ее ранней диагностики /53/ с помощью спектроскопии КР.
Одним интересным направлением применения КР-спектроско-пии для изучения, интактных биологических систем является изучение молекулярных механизмов мышечных сокращений. В работе /54/ было показано, что белки, входящие в состав мышечных волокон, находятся в -спиральных конформациях и в процессе сокращения степень спирализации, как оказалось, практически не меняется, тогда как заметные изменения наблюдались в колебаниях ряда аминокислотных остатков, в частности, триптофанов и карбоксилсодержащих. Уменьшение интенсивности С00 " валентных симметричных колебаний около см при добавлении АТФ и Са , приводящего к сокращению мышц, дало важную информацию для проверки гипотезы о значительной роли в генерации сократительных напряжений ослабления электростатического расталкивания между одноименными зарядами в белках, следовательно и между карбоксилсодержащими остатками, концентрация которых доходит до 25$. Наблюдавшиеся спектральные изменения $ (СОСГ), по мнению авторов, могли быть результатом сильного взаимодействия карбоксильных групп с какими-либо противоионами.
Экспериментальное изучение модельных соединений и белков, в области колебаний дисуль-фидных мостиков
Таким образом, при учете изменений параметров связи и кинематического фактора можно видеть понижение частоты 9(5 S) при уменьшении fl GS-se) от 90 до 0. В то же время, точно предсказать поведение \)(s-s) при увеличении %(в$ с) от 90 до 180 затруднительно, т.к. упомянутые выше два фактора, влияющие на \)(s-S) приводят к противоположным тенденциям ее изменений, компенсируя друг друга. Экспериментальных данных для этой области изменений %(CS $c) в работе Ван Варта и Шераги /42/, к сожеланию, не приведено, хотя они предсказывают на основе расчетов по методу C/Vfto/z понижение частоты 9(s-s) . Повороты вокруг связи S-S при неизменных ее параметрах, как видно из рис ,3.2В, не приводят к существенным изменениям интенсивностей КР, даже Tes/lSS( меняется мало, а сумма интенсив-ностей этих полос практически постоянна, что также говорит о некоторой компенсации их изменений. Отметим, забегая вперед, что по данным рентгеноструктурного анализа в белках резко встречаются такие напряжения, которые могут привести к сильным изменениям двугранного угла ґ/6(Є$-&е) и практически во всех случаях их значения укладываются в интервал 70-110. Замещения атомов Н на С в С04-позиции изменяют частоту S)(S s) примерно на I см и практически не влияют на интенсивность этой полосы, поэтому для сравнения спектры КР в зависимости от вариации es-S cj были посчитаны при использовании в качестве модели молекулы диэтилдисульфи-да.
Конформационный анализ свидетельствует о том, что одновременное присутствие #(CS-SC) 60 в дисульфид-ных мостиках энергетически не выгодно. Однако, даже в случае реализации такой конформации, возможные частотно-конформационные неоднозначности решаются за счет анализа интенсивностей. Кроме того, в отдельных случаях значение двугранного угла Х?(Сs-$с) может быть установлено из спектров КД. Эта возможность будет проиллюстрирована и обсуждена в следующей главе.
Валентное S-S колебание практически не обнаруживает зависимости от величины двугранного утла #(се-е$) (рис.3.2 ), в то время как валентное антисимметричное d s колебание при гош-транс переходе возрастает на 50 см , что согласуется с экспериментальными данными, полученными Сугетой и др. /36,37/, при этом симметричное колебание )(C-S) также меняется мало. Заметим, что основной вклад в полосу антисимметричного колебания (C-s) дает валентное колебание -$ связи, соседствующей с С-С связью, относительно которой и меняется двугранный угол #(C-cs) . Такие результаты были получены при расчете молекулы ES c с двумя замещениями атомов Н на С в Соположении. При вариации двугранного угла ЖСС-Cs) относительно С-С связи в молекуле Q.SSE. без замещений изменений V(c-s) не наблюдалось, что свидетельствует об определяющей роли в изменениях частоты \)(c-s) ориентации тяжелого заместителя у С атома (в белках-атома С илиІМ , см. рис.3.1). Как видно из рис.3.2С, сумма интенсивностей S-S и C-S валентных колебаний 2ІІ также меняется мало, немного уменьшаясь около 120, где имеется потенциальный барьер вращения относительно С-С связи. Как будет показано дальше, такие конформации практически не встречаются.
Вариации валентного угла CSS в пределах 10 для различ ных конформаций приводят к незначительным изменениям VYs-s) в пределах от 6 см""1 для гош-гош-гош и до 2 см для транстранс-транс конфигурации относительно связей 2 S-s-C . При этом интенсивности полос валентных S s и (S-S колебаний малочувствительны к вариации i-SSC : z меняется в пределах 1($. Отметим, что реально искажения /.ess в белках должны происходить в меньших, чем 10 пределах.
Таким образом, полученные из расчетов закономерности изменения частот колебаний с конформацией дисульфидных мостиков хорошо описывают экспериментальные данные уже в приближении, когда параметры связей (силовые постоянные) считаются независимыми от конформаций (кроме S-S связи). Приемлемость такого предположения следует, например, и из полуэмпирических квантовомеханичес-ких расчетов (ел/до/2) /41/j она в определенной мере будет проиллюстрирована на гистограммах встречаемости различных двугранных углов, которые отражают потенциальную поверхность вращения относительно соответствующих связей.
Изучение кальций-связывающих белков на примере кальмодулина и фосфолипаз Ао из различных источников
Одним из обширных классов белковых молекул, включающих, например, различные ферменты, регуляторные белки или белки, входящие в состав мышечных тканей, являются связывающие кальций белки. Различные функции этих белков, активизируются после связывания кальция, приводящего к тем или иным изменениям их структуры. Ярким примером такой инициации структурных изменений, определяющих способность белка к последующему связыванию значительного числа различных белков с активизацией их функций, является функционирование кальмодулина.
Заманчивым было также применение КР для изучения особенностей пространственного строения фосфолипаз к из различных источников, выполняющих одну и ту же гидролитическую фракцию, но обнаруживающих различную специфичность к физическому состоянию субстрата. Наряду с этими вопросами, важными для формирования представлений о структурно-функциональных связях конкретных объектов, особое внимание уделялось и особенностям спектральных проявлений взаимодействия белка с катионами кальция, их моделированию, а также изучению влияния агрегатного состояния на конформацию, вопросам, обогащающим методические возможности применения КР-спектроскопии для изучения подобных объектов.
Множественные функции кальмодулина, широко распространенного в эукариотических клетках кальций-зависимого регуляторного белка, по-видимому, в значительной мере связаны с его лабильностью и способностью к образованию комплексов с катионами кальция. На основании гомологии в первичной структуре с тропонином С и пар-вальбумином карпа, кристаллическая структура которого известна, предложена модель кальмодулина, содержащая богатые карбоксильны « 24-МИ группами четыре Салт-связывающих центра, с примыкающими к каждому из них с обеих сторон оС -спиральными участками /97/. Эти четыре высокоаффинных места связывания катионов, как показано, например, в работе /98/, близки по связывающей способности (Кщ = 2,4 10 М) в то время как в тропонине С имеются два цент 7 Т ра с высокой константой связывания ( = 2 10 М ) и два с относительно более низкой (Ккаж = 5 10 М"1) /99/. Связывание различных катионов (К , Na , Mg , Са + и др.) изучалось методами ЯМР, флуоресценции, КД, УФ-поглощения /97-101/ и если спектральные характеристики, например, остатков тирозинов в определенной мере чувствительны ко многим катионам, то именно катионы кальция приводят к заметным изменениям спектров Щ в области пептидных хромофоров. В этом случае комплексообразование сопровождается возрастанием содержания -спиральных участков на 10-15% /98,101/, изменением окружения и флуоресцентных свойств остатков Туг и их доступности модифицирующим агентам и т.д. /100/. Недавно с помощью метода КР-спектроскопии было исследовано влияние связывания Са2+ на структуру тропонина С /102/ и показано непос - 95 редственное участие в связывании остатков Asp и G2u , изменение вторичной структуры и состояния ряда остатков, в частности CLJS $8 И ОДНОГО ИЗ тирозинов.
В настоящей работе метод КР-спектроскопии был использован для получения дополнительной и независимой информации о пространственной структуре полипептидной цепочки, состояний ряда боковых групп и их изменениях при связывании кальция кальмодулином. Интерес представляло в первую очередь изучение особенностей спектрального проявления взаимодействия кальмодулина с катионами кальция.
Спектры КР кальмодулина в водном растворе и в присутствии избытка кальция приведены на рис. 4.7. Интерпретация полос на основе литературных данных и съемки некоторых фрагментов спектров при различных рН и в тяжелой воде приводится в таблице 4.3. Можно видеть, что обзорные спектры несут все признаки наличия в белке существенной доли оС-спиральных участков. Образование комплекса с катионами кальция сопровождается заметными изменениями во многих областях спектра: полоса Амид I становится более резкой и ее максимум смещается от 1657 к 1654 см , выраженные рельефные изменения претерпевает высокочастотная область Амид III, усиливаются и несколько меняют свой контур валентные и деформационные С-С колебания скелета, кроме того обнаруживается чувствительность колебаний ряда боковых групп к присутствию катионов. Эти спектральные области были изучены нами более подробно.
Похожие диссертации на Спектрально-конформативные корреляции в спектроскопии комбинационного рассеяния белков и пептидов в применении к изучению влияния внешних воздействий на их структуру
