Содержание к диссертации
Введение
1. Метод молекулярной динамики. 6
1.1.1. Расчет траекторий движения. 6
1.1.2. Методы ускорения расчётов молекулярной динамики. 11
1.1.3. Методы интегрирования уравнений движения. 14
1.1.4. Ошибки интегрирования и способы их коррекции. 14
1.1.5. Внешние воздействия на систему, расчёт при постоянной температуре. 15
1.1.6. Изучение гиперповерхностей потенциальной энергии и построение карт уровней потенциальной энергии. 25
1.1.7. Авто- и кросскорреляционные функции двугранных углов. 28
1.1.8. Построение двумерных и одномерных распределений вероятностей значений торсионных углов. 32
1.2. Теоретические основы рассеяния рентгеновских лучей. 33
1.2.1. Рассеяние объектами, содержащими один тип атомов. 33
1.2.2. Рассеяние объектами, содержащими атомы нескольких типов. 36
1.2.3. Использование моделей, для получения информации о структуре объекта, при обработке индикатрис рентгеновского рассеяния. 37
2. Молекулярная динамика изгибных флуктуации элементов вторичной структуры белков. 40
2.1. Использование континуальной модели при описании динамики элементов вторичной структуры белков. 40
2.2. Динамические свойства а-спиралей и р-слоя. 42
2.3. Динамика а-спирали и р-слоя в белке. 51
3. Метод молекулярной динамики как вычислительный эксперимент по сравнительному изучению динамических свойств лизоцима при направленной вариации его структуры. 54
3.1. Постановка вычислительного эксперимента по изучению влияния дисульфидных мостиков на конформационную подвижность лизоцима. 54
3.2. Динамика а-спиралей в большом домене лизоцима. 55
3.3. Динамические корреляции большого и малого доменов лизоцима. 58
3.4. Сравнение пространственных характеристик лизоцима с дисульфидными связями и без них. 60
4. Получение пространственных корреляционных функций биомакромолекул с помощью фурье-анализа данных диффузного рассеяния рентгеновских лучей. 66
4.1. Методика фурье-анализа данных диффузного рассеяния рентгеновских лучей. 66
4.2. Исследование с помощью фурье-анализа ДРРЛ глобулярных белков: миоглобина и лизоцима. 68
4.3. Исследование с помощью фурье-анализа ДРРЛ мембранных белков: белков реакционного центра (РЦ) пурпурных бактерий. 73
4.4. Метод молекулярной динамики как инструмент для обработки экспериментальных данных по ДРРЛ лизоцимом с различными степенями гидратации. 82
Заключение и выводы. 88
- Теоретические основы рассеяния рентгеновских лучей.
- Динамические свойства а-спиралей и р-слоя.
- Динамика а-спиралей в большом домене лизоцима.
- Исследование с помощью фурье-анализа ДРРЛ глобулярных белков: миоглобина и лизоцима.
Введение к работе
В течение последних десятилетий исследование динамики биополимеров привлекает большое вниманиех [1-4]. Однако, в отличие от низкомолекулярных структур, в биополимерах взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами существенно сложнее [5]. В настоящее время общепринято, что фундаментальные принципы функционирования биомакромолекул обусловлены также их динамическими свойствами [6-10]. Пространственное строение молекул белков, наличие элементов вторичной структуры непосредственно сказывается на организации динамического поведения глобулы. Протяженные упругие элементы полипептидного каркаса организуют флуктуационную динамику белковой . макромолекулы, что весьма важно для функциональной активности. В известном смысле молекулу белка можно представить как армированную каплю, состоящую из упругих элементов различной протяженности и формы, погруженных в плотную среду из боковых групп и молекул растворителя (К.В. Шайтан, А.Б. Рубин) [11]. Элементы этой конструкции испытывают ограниченное броуновское движение с параметрами, определяемыми константами жесткости упругого каркаса и микровязкостью внутрибелковой среды. Понимание физических принципов механического устройства белковых глобул и сходных наноструктур необходимо для развития технологии молекулярного конструирования и биоинженерии.
Динамические свойства белков исследуются многими современными физическими методами, такими как водородный обмен [12,13], метод спиновых меток [14-16], рассеяние нейтронов [17,18], люминесценция [19], ЯМР [20-23], мессбауэровская спектроскопия [24-27], рэлеевское рассеяние мёссбауэровского излучения (РРМИ) [28-31], лазерная спектроскопия [32-34], рассеяние синхротронного излучения [35], диффузное рассеяние рентгеновских лучей (ДРРЛ) [36-39]. Одним из важных инструментов исследования структуры и закономерностей конформационного поведения биологических макромолекул является метод молекулярной динамики (МД) [40-44], позволяющий получать детальную информацию о процессах, происходящих в системе на уровне движений отдельных атомов. В его основе лежит расчет классических (ньютоновских) траекторий движения макромолекулы в фазовом пространстве координат и импульсов ее атомов. Этот метод очень быстро развивается вместе с прогрессом в компьютерных технологиях и становится все более популярным инструментом исследований для молекулярных биологов, биохимиков, биофизиков и представителей смежных специальностей. В настоящее время этот метод оказывается чрезвычайно полезным при постановке вычислительных экспериментов по сравнительному изучению динамических свойств белков при направленной вариации их структуры. Таким образом, использование метода молекулярной динамики для изучения временных корреляций, характеризующих динамику белков и фрагментов их вторичной и третичной структуры, а также пространственных корреляций, сопровождающих конформационные перестройки биомакромолекул при изменении внешних условий, актуально и необходимо для детального понимания процессов, происходящих в живых системах на молекулярном уровне. При этом самостоятельный интерес представляет задача обработки экспериментальных данных по рассеянию рентгеновского излучения с использованием результатов молекулярной динамики и применением фурье-преобразования к анализу экспериментальных кривых.
Целью работы является сравнительное исследование динамики элементов вторичной структуры в составе молекул белка и в виде изолированных молекулярных структур, изучение пространственных и временных корреляций атомных групп, характеризующих динамику биомакромолекул при изменении внешних условий, сравнительное изучение роли дисульфидных связей в конформационной подвижности белков, использование результатов молекулярной динамики для обработки данных ДРРЛ, а также разработка методов фурье-анализа данных ДРРЛ и соответствующего программного обеспечения для получения информации о динамике водно-белковых систем.
Теоретические основы рассеяния рентгеновских лучей.
Рассеяние рентгеновского излучения - дифракционный метод, который широко используется для изучения надатомной структуры. Этот метод применяется в физике конденсированного состояния, при физико-химическом анализе дисперсных систем, при исследовании полимерных веществ, в молекулярной биологии и биофизике. Важнейшей особенностью метода является возможность анализа внутренней структуры разупорядоченных систем, и зачастую его применение - единственный способ получения прямой структурной информации о системах с хаотическим расположением неоднородностей плотности. Использование рентгеновского рассеяния для структурных исследований ведет свое начало от ставших классическими работ П. Дебая, А. Гинье, О. Кратки, Ф. Цернике, Д. Принса, Б. Уоррена и др. [92-95]. Дебай в 1925г. впервые отчетливо показал, какое значение для создания дифракционных эффектов имеет простое отклонение от совершенно беспорядочного расположения. В очень важной статье о дифракции рентгеновских лучей в газах он ввел представление о функции вероятности, выражающей вероятность появления какого-либо определенного межмолекулярного расстояния. Аналогичные представления были высказаны Цернике и Принсом в их основной статье, послужившей исходным пунктом для работ по интерпретации дифракционных узоров в жидкостях. Эти авторы рассмотрели вид функции вероятности в случае одномерного расположения линейных молекул конечной длины и показали, как связана эта функция с дифракционной картиной, которая может получиться в результате такого расположения. Кроме того, они показали, как использовать интеграл Фурье при определении функции вероятности по наблюдаемой дифракционной картине. Первая количественная проверка этого представления была проделана Дебаем и Менке на примере жидкой ртути. Тарасов и Уоррен [96] произвели аналогичные наблюдения на жидком натрии. Позднее Уоррен и его сотрудники положили эти формулы в основу очень важной работы по структуре стеклообразных твердых тел. Пусть кристаллический порошок, состоящий из очень большого числа всевозможно ориентированных частичек, рассеивает монохроматические рентгеновские лучи. Получающаяся рентгенограмма представляет собой обычную систему колец Дебая-Шерера [97]. Ее можно рассматривать также и как среднее распределение рассеянного излучения, которое получилось бы от единственной кристаллической частицы, если бы ей была дана возможность, принимать в пространстве всевозможные ориентации. Предположим, что все частицы одинаковы, а также что каждая из них содержит очень большое число элементарных ячеек кристалла, и рассмотрим среднюю интенсивность рассеяния, приходящуюся на одну кристаллическую частичку.
Расстояния между соответствующими точками соседних частиц в таком скоплении будет велико по сравнению с длиной волны излучения, а ориентировки разных частиц -произвольны. Поэтому можно пренебречь внешними интерференционными эффектами, зависящими от расстояний между частицами. Интересующую нас интерференционную картину формально можно объяснить как внутренний интерференционный эффект или молекулярное рассеяние от газа, молекулы которого являются кристаллическими частичками. В каждой из таких молекул имеется очень большое число одинаковых межатомных расстояний расположенных закономерно и периодично. Так, в рассеянном излучении появляются отдельные отчетливые максимумы - кольца Дебая-Шерера. Интенсивность рассеянного излучения для такой совокупности атомов, в точке на расстоянии R имеет вид [93]: Здесь fp - характеристическая функция атомного рассеяния (атомный фактор рассеяния) для атома р, rpq - расстояние между атомами р и q, Q — (—) sin в- волновой вектор, длина волны для /С -линии меди составляет 1.54А, 20 - угол рассеяния. Предположим, что кристаллическая решетка простая и что в каждой частичке имеется N атомов только одного рода с функцией рассеяния тогда: „sin Or /(0 = (0 1-7 -, (1.50) р УҐР где интенсивность рассеяния, приходящаяся на один атом в частице (молекуле): Расстояние между любыми двумя атомами в кристалле фиксировано. Возьмем какой-нибудь атом р и допустим, что кристалл может ориентироваться по отношению к нему как угодно. Тогда мы можем определить сферически симметричную функцию распределения атомов р(г) так, что4ЯГ p(r)dr атомов находятся на расстояниях от г до r+dr от центра атома р. Если число атомов в каждой частичке очень велико, можно предположить, что для всех атомов величина р(г) одинакова, потому что атомы на краю частиц составляют лишь малую долю от атомов всего скопления. Поэтому суммирование по всем атомам можно заменить умножением на N. Модифицируем формулу (1.50): KQ) = p(Q)Nll + )A7w2p{r) -dr\. (1.52) Г Интегрирование здесь нужно проводить по всему объему средней кристаллической частички. Пусть i(Q) = ( ) — 1, тогда: N p(Q) 00 QKQ) = 4я- \rp(r) s mQrdr. (1.53) о Выражение (1.53) представляет собой интеграл Фурье. Решение обратной задачи — нахождения р(г) при известной функции i(Q) — дается обратным преобразованием: S 7- шл гр(г) = 7ГТ Ніякої) sin QrdQ. (1.54) 2л" о Таким образом, преобразования Фурье лежат в основе расчетов интенсивности рассеяния по заданной системе рассеивающих центров и функции плотности атомного распределения, если, разумеется, выполнены условия первого борновского приближения. При определении атомной и молекулярной структуры вещества стараются всегда так поставить эксперимент, чтобы это приближение выполнялось (и тем самым взаимные интегральные фурье-преобразования тоже). Интегрирование интенсивности рассеяния производится в (1.54) от значений угла рассеяния 0 и, следовательно, включает в себя соответствующий дифракционный максимум, который невозможно наблюдать экспериментально.
Поэтому представим 1(0)=Г(0)+1(0), где I (Q) - интенсивность рассеяния при 0, a I(Q)- наблюдаемая интенсивность рассеяния, тогда получим: 2ж2гр{г) )Q{- L)smQrdQ + )Qi{Q)smQrdQ (1.55) о N(p(Q) І Первый интеграл имеет одно и то же значение 1к гр0к для кристаллических и для аморфных веществ, и его легко посчитать, если предположить, что функция вероятности нахождения атомов в образце сферически симметрична. Здесь ро - средняя плотность образца. В окончательном виде получаем: 4яг2(р(г)-А) = — \Qi{Q)smQrdQ. (1.56) Я" о Если можно определить i(Q) в результате эксперимента, то для каждой серии значений г можно численно оценить интеграл (1.56), а значит и разность между истинной радиальной атомной плотностью и плотностью, соответствующей однородному распределению, т.е. р(г)-ро. Эта разность приближается к нулю, когда г становится большим. 1.2.2. Рассеяние объектами, содержащими атомы нескольких типов. Если кристалл состоит из атомов нескольких типов, тогда для применения преобразования Фурье приходится использовать приближения. Примем за элемент структуры группу, содержащую атомы типов т, п, ..., и положим, что в каждой кристаллической частичке имеются N таких групп. Тогда среднюю величину рассеяния одной частицей можно записать в виде: /(0=ЕЛ2 + Е Е /,/, ! rk- (1-57) и Р,Р Я Я,Р Ч Уря Первая сумма берется по всем атомам в группе, а две другие - по каждой паре разных атомов в кристаллической частице, независимо от того к какой из групп они относятся. Мы можем ввести нормированную функцию плотности Рт(г) которая определяется следующим образом. Из центра атома типа т опишем сферы радиусами г и r+dr и предположим, что среднее число атомов типов т, п, ..., находящихся между этими сферами,равно атап ...,тогда: 4 V ) = 2X/ffl. (1.58) Эта сумма берется по всем атомам группы, принятой за элемент структуры. Так как таких групп имеется N, формулу (1.57) можно записать в виде: [ т я» О \JX (1.59) Суммирование опять производится по всем атомам данной группы. В формуле (1.59) рт(г) и/т являются функциями Q, так что прямое преобразование Фурье невозможно. Тем не менее, следующее приближение дает возможность перейти к полезным результатам. Допустим, что можно записать функцию рассеяния для атома т в виде [98]: Здесь Кт - постоянная для данного атома величина (приблизительно равная атомному номеру), а /е - некоторая средняя функция рассеяния на один электрон для рассматриваемой группы атомов. Иначе говоря, это сумма функций рассеяния для атомов данной группы, деленная на число всех электронов в группе.
Динамические свойства а-спиралей и р-слоя.
Изучалось влияние температуры на модуль Юнга, амплитуды флуктуации и времена корреляции отклонения оси а-спирали от ее среднего положения. В качестве модельных объектов были взяты полилизин и полиглицин (PolyLys, PolyGly) в а-спиральной конформации (длина спирали L=44A), состоящие из 30 аминокислотных остатков, а также самая протяженная (Н) а-спираль миоглобина (L=35.5A), состоящая из 26 остатков 13 различных типов. Полилизин в отличие от полиглицина имеет достаточно объемные боковые радикалы и напоминает "щетку . В таблице 2.1 представлены результаты обработки траекторий этих полипептидов, рассчитанных при температурах 300К и 400К. N- и С- концы а-спиралей в данном случае фиксировались. Приведенные в табл.2.1 значения параметров соответствуют центральной части а-спирали. Видно, что при повышении температуры от 300К до 400К наблюдается уменьшение значений модуля Юнга и увеличение амплитуды смещения центральной части а-спирали относительно ее оси. При этом, как и следовало ожидать, большие значения модуля Юнга характерны для полилизина Е=9.4 1012эрг/см3 (для полиглицина Е=4.1 1012 эрг/см3). При 400К отклонение центра а-спирали от оси составляет 1.1-1.2А для всех исследованных полипептидов, тогда как время корреляции этого отклонения существенно различается. Несколько парадоксальным выглядит увеличение характерного времени изгибных флуктуации с повышением температуры. Это обусловлено, по-видимому, нелинейным изменением упругой энергии спирали при больших деформациях. На рисунках 2.2 и 2.3 изображены амплитудные флуктуационные профили полипептидов для 300К и 400К соответственно. Следует отметить, что с повышением температуры профиль изгибных флуктуации полиглицина не меняется, тогда как у полилизина и восьмой (Н) а-спирали миоглобина этот профиль существенно деформируется и становится ближе к профилю изгибных флуктуации полиглицина. Амплитуды флуктуации в N-концевой части а-спирали выше, чем в центральной и в С-концевой части. То есть N-концевой участок а-спирали более динамически лабилен, чем центральный и С-концевой. Поэтому представления об а-спирали как об однородном упругом стержне (трубке) нуждаются в определенном пересмотре [11]. Проследим далее динамику разворачивания миоглобиновой (Н) а-спирали с незакрепленными концами в виртуальной вязкой среде при повышении температуры.
Молекулярно динамические траектории рассчитывались как в тяжелоатомном, так и в полноатомном приближениях. В таблице 2.2 приводится сравнение соответствующих параметров для центральной части а-спирали. Заметное плавление а-спирали в тяжелоатомной модели за время наблюдения 5 нс происходит при температуре 500К. В полноатомной модели эта температура выше - 700К. Обращает внимание значительное замедление динамики флуктуации в полноатомной модели, что обусловлено существенным увеличением "шероховатости" поверхности потенциальной энергии при явном включении в расчет атомов водорода. Парадоксальным кажется уменьшение модуля Юнга и увеличение амплитуд флуктуации при добавлении атомов водорода. Это указывает на значительную чувствительность отдельных динамических параметров полипептидов к вариациям параметров используемого силового поля даже в том случае, если равновесные характеристики макромолекулы остаются неизменными. Эти эффекты при наличии надежных экспериментальных данных об упругих характеристиках элементов вторичной структуры, по-видимому, могут быть использованы для уточнения силовых полей. Возможно также, что в полноатомной модели за разумные времена могут возникать более точные подстройки системы (с меньшей энергией) при движении в конфигурационном пространстве существенно большей размерности. Как известно, в а-спиральной конформации заданы определенные значения торсионных углов ф и у. Детали процесса плавления а-спирали можно увидеть на картах двухмерных распределений по углам р и \/ плотности вероятности нахождения системы в соответствующей части конфигурационного пространства. На рис. 2.4 представлены соответствующие карты для N- и С-концевой части миоглобиновой а-спирали (Н) при температурах 300К, 600К и 700К (расчет проводился для спиралей со свободными концами). Видно, что уже при температуре 300К выбранные пары углов значительное время проводят в области, отвечающей Р-конформации. Вклад этой области с повышением температуры быстро растет. При 600К аминокислотные остатки А1а2 и Leu26 практически все время находятся в состоянии, соответствующей р-конформации. На рисунке 2.5 на примере аминокислотных остатков Gln5 и Leu 12 из центральной части миоглобиновой а-спирали (Н) показан переход из чисто а-спиральной конформации при температуре 300К в а/р-конформацию при повышении температуры до 700К. В таблице 2.3 представлены данные по плавлению а-спирали (Н) миоглобина для каждой из аминокислот. При ЗООК вероятность нахождения в конформации а-спирали превышает 50% для 20 аминокислот, при 600К таких аминокислот — 18, а при 700К таких аминокислот только 12. При этом визуально полипептид практически уже не находится в конформации а-спирали (т.е. наступает момент плавления). Следует отметить, что плавление а-спирали начинается с N-конца. Так при 600К 4 аминокислоты с N-конца находились в состоянии расплавленной а-спирали, а с С-конца — 1. Соответствующие цифры для 700К составляют 7 и 3, то есть 2 витка а-спирали с N-конца и 1 виток с С-конца. Этот результат находится в хорошем согласии с приведенными выше данными по увеличению амплитуды флуктуации в большей степени у N-концевой части а-спирали. Процесс плавления а-спирали зависит от качественного состава аминокислот в полипептидной цепи. В случае миоглобиновой а-спирали (Н) присутствие двух аминокислот Gly через 1,5 витка ускоряет процесс плавления с N-конца, а наличие аминокислот Arg и пары Ala-Lys в центральной части создает дополнительные очаги разрушения а-спирали.
Отметим, что процесс плавления для тяжелоатомной модели а-спирали практически повторяет аналогичные стадии плавления в полноатомной модели. Проводилось также изучение влияния условий закрепления концов а-спирали на ее динамику. Для этого, в дополнение к моделям с жесткой фиксацией концов а-спирали и а-спирали с незакрепленными концами, рассматривался случай, когда концы миоглобиновой а-спирали (Н) в полноатомной модели были соединены с массивными частицами, масса каждой из которых составляла 1кДа (порядка 1/3 от массы всей спирали). При этом динамическое поведение в целом для всех трех случаев не менялось, модуль Юнга, амплитуда и характерное время флуктуации оставались практически без изменения как для а-спирали с незакрепленными концами, так и для а-спирали с дополнительными массивными частицами. В то же время для а-спирали с сированными концами модуль Юнга был больше в 2.5 раза, а амплитуда и іктерное время флуктуации меньше в 1.5 и 3 раза соответственно, чем параметры, /ченные в двух других случаях. Для изучения динамических свойств р-слоя в качестве объекта был выбран участок размером 25.6x23А протяженного Р-листа в белке GFP [111-112]. р-слой содержал 6 антипараллельных Р-цепей и состоял из 100 аминокислот. Динамика р-слоя изучалась в полноатомной модели при температуре ЗООК. Длина траектории составляла 5нс. Влияние растворителя моделировалось виртуальной вязкой средой с теми же параметрами, что и при изучении динамики а-спирали. Периметр Р-слоя не закреплялся. Как было показано выше, фиксация элементов вторичной структуры придает им дополнительную жесткость, но принципиально не меняет их динамического поведения. В центре Р-слоя динамические параметры изгибных флуктуации имели следующие величины: В=0.75А, тр =220пс. В рамках континуальной модели это соответствует модулю Юнга: Е=7.5 10 эрг/см . Таким образом, упругие характеристики р-слоя практически те же, что и у а-спирали. На рис. 2.6 изображен амплитудный флуктуационный профиль р-слоя. Для изучения динамики а-спирали и Р-слоя внутри молекулы белка был выбран а+Р- белок барназа [113], состоящий из 108 аминокислот. Длина молекулярно динамической траектории белка, исследовавшегося в полноатомном приближении, составляла 10нс. Влияние растворителя моделировалось виртуальной вязкой средой, температура термостата была равна 300К. В табл. 2.4 представлены значения параметров, соответствующих центральной части а-спирали (1а) (13 аминокислот, длина 15.5А) и р-слоя (4 антипараллельные Р-цепи, размер 8.5x13А).
Динамика а-спиралей в большом домене лизоцима.
В работе проводилось сравнение и обработка корреляционных функций, характеризующих изгибные флуктуации самых длинных а-спиралей лизоцима 1а (10 аминокислот); За (12 аминокислот); 5а (11 аминокислот) [119]. Если следить за отклонением центральной части а-спиралей от ее оси, то следует отметить, что -\ амплитудные характеристики практически не меняются для обоих вариантов лизоцима, но меняются характерные времена. В лизоциме с разрушенными S-S-связями характерные времена изгибных флуктуации а-спиралей За и 5а увеличиваются приблизительно в 2-3 раза. Интересно, что две из четырех дисульфидных связей лизоцима соединены с центральной частью именно этих а-спиралей. У 1а-спирали S-S-связь приходится на N-концевую часть, и для этой спирали динамические характеристики для двух обсуждаемых вариантов молекулы лизоцима практически не менялись. На рисунке 3.2 в качестве примера показаны автокорреляционные функции отклонения центральной части За-спирали от ее оси. В таблице 3.1 приведены результаты обработки этих автокорреляционных функций для трех а-спиралей из большого домена. Обработка проводилась в континуальной модели, в которой а-спираль моделируется упругим стержнем с подпертыми концами [11]. Отметим, что значения эффективного модуля Юнга для двух а-спиралей увеличились при разрушении S-S-связей, что свидетельствует об общем повышении жесткости белковой конструкции. В случае отсутствия S-S-связи анализ кросскорреляционных функций для отклонений центральной части а-спиралей от их осей обнаруживает появление заметных корреляций с длительными временами релаксации 400-700 пс для спиралей 1а и За, a также 5а и За. В большом домене лизоцима с дисульфидными связями взаимная корреляция между а-спиралями сохраняется на временах до 50 пикосекунд (на рисунке 3.3 в качестве примера изображены кросскорреляционные функции изгибных флуктуации между спиралями 1а и За). Иными словами, флуктуации а-спиралей относительно друг друга в большом домене лизоцима при наличии S-S-связей становятся независимыми существенно быстрее, за времена порядка десятков пикосекунд. Сходная картина наблюдается и для кросскорреляционных функций изгибных флуктуации а-спиралей 4а и За с р-слоем из малого домена. То есть, как это ни парадоксально, наличие дисульфидных связей разрыхляет белковую глобулу и делает флуктуации отдельных элементов структуры более независимыми. Можно сказать, что дисульфидные связи одновременно и скрепляют участки молекулы и удерживают их от излишнего сближения, выполняя функцию "распорок".
При разрыве S-S-связей происходит нарушение функционально значимой конформации лизоцима и элементы вторичной структуры в большей степени "наезжают" друг на друга при движении. 3.3. Динамические корреляции большого и малого доменов лизоцима. Чувствительность к взаимным движениям в молекуле лизоцима с S-S-связями и без них можно оценить также при изучении кросскорреляционных функций отклонений от средних расстояний между Са-атомами аминокислотных остатков, находящихся в вершинах петель большого и малого домена. Следует отметить, что за времена -50 пикосекунд наблюдается быстрое исчезновение взаимных корреляций в присутствии дисульфидных связей между аминокислотными остатками Arg21-Lysll6 и Arg21-Aspl01 из большого домена (рисунок 3.4). В случае лизоцима без S-S-связей наблюдается рост устойчивой корреляции между движениями этих петель на временном интервале 800 пикосекунд. Аналогичная ситуация наблюдается для взаимных корреляций отклонений от средних расстояний между петлями большого и малого домена, т.е. между аминокислотными остатками Asp48-Aspl01 и Gly71-Aspl01. Этот факт подтверждает вывод о том, что в отсутствие дисульфидных связей нарушается взаимное расположение элементов вторичной и третичной структуры (большого и малого доменов) лизоцима. Это должно вести к искажению нативной конформации молекулы и в итоге к нарушению ее функции. В таблице 3.2 представлены результаты обработки автокорреляционных функций отклонений от средних расстояний между боковыми радикалами аминокислотных остатков Тгр62-Тгр63 и Glu35-Asp52, участвующих в процессе взаимодействия лизоцима с субстратом. Следует отметить, что при разрушении S-S-связей, прежде всего, увеличиваются времена корреляции отклонений от средних расстояний между этими аминокислотными остатками (в 7-12 раз), а для остатков Тгр62-ТгрбЗ и величины отклонений от средних расстояний (в 1.5 раза), что также обусловлено существенным изменением формы и размера молекулы. Конформация "щели" между большим и малым доменом лизоцима непосредственно связана с наличием дисульфидных связей. При разрушении дисульфидных связей сильно меняется характер кросскорреляций между изгибными флуктуациями спирали 5а и поворотом вокруг торсионного угла % в аминокислотных остатках ТгрбЗ (рисунок 3.5) и AsplOl, участвующих в ферментативной реакции. Путем усреднения по последнему 2нс участку траектории были получены две усредненные структуры лизоцима: с дисульфидными мостиками и без них. Далее было проведено сравнение этих структур и стартовой структуры, определяемой данными ренттеноструктурного анализа. Часть результатов представлена в таблице 3.3. Радиус инерции, непосредственно характеризующий размеры молекулы, рассчитывался по формуле [42]: я = N (3.1) где г7 - радиус-вектор, соответствующего атома в структуре белка, гст - радиус-ветор центра масс молекулы. Зачастую форму глобулярных белков характеризуют с использованием коэффициентов анизотропии Л/ и А2: А\ = 2Е«Л2 (2 Уіа+5 л2) -і, (3.2) I 2 A2= — - - --1, (3.3) где ті - масса соответствующего атома, Х/ - проекция радиус-вектора на соответствующую координатную ось. В отсутствии S-S-связей меняется форма молекулы лизоцима (главной осью становится не Z, а X) и ее размеры (объем молекулы уменьшается примерно на 2% по сравнению с не модифицированной и на 1.5% по сравнению со стартовой структурой молекулы). Отметим, что различия по этим же параметрам между стартовой структурой лизоцима с S-S-связями и усредненной по последним 2 не траектории составляют примерно 0.5%. Следует отметить, что минимальные расстояния между Са-атомами в молекуле лизоцима, определяемые рентгеноструктурными данными, в среднем, на 0.08А меньше, чем соответствующие расстояния в обеих структурах, получаемые из траекторий молекулярной динамики.
То есть аминокислотные остатки в структуре лизоцима по данным рентгеноструктурного анализа оказываются сближены. Введение в явном виде атомов водорода в тяжелоатомную структуру молекулы приводит к достаточно быстрой ее релаксации (за десятки пикосекунд). Вследствие того, что аминокислотные остатки в стартовой структуре сближены, количество контактов между Са-атомами (при одинаковых пространственных размерах) должно увеличиваться по сравнению со структурой лизоцима с дисульфидными мостиками, что, и наблюдается в табл. 3.3. Вычислялось число контактов между Са-атомами, для которых расстояние составляло менее 14,23А (радиуса инерции лизоцима с дисульфидными связями). Без дисульфидных связей количество таких контактов возрастает, что согласуется с выводом об уменьшении объема молекулы (при сохранении минимальных расстояний между Са-атомами). Наибольшим значением радиуса инерции характеризуется лизоцим с S-S-связями, а наименьшим - без дисульфидных связей. Коэффициент анизотропии А1, демонстрирующий отклонение от сферической формы, минимален для молекулы лизоцима, определяемой рентгеноструктурными данными, а коэффициент анизотропии А2, демонстрирующий отклонение от цилиндрической формы, минимален для лизоцима без S-S-связей. Средний квадрат смещения Ах2 Са-атомов между стартовой структурой лизоцима и структурой лизоцима с S-S-связями, определяемый после совмещения этих структур, составляет 1.39А2, тогда как аналогичный Дх2 после совмещения молекул с дисульфидными связями и без них - 1.75А2. Совмещение карт контактов (изображений всех областей молекулы, для которых расстояния между Ca-атомами будут меньше некоего выбранного R=14.23A (радиус инерции лизоцима с S-S-связями)) для двух вариантов лизоцима с дисульфидными мостиками и без них (рисунок 3.6) демонстрирует появление новых областей на карте контактов для лизоцима без S-S-связей.
Исследование с помощью фурье-анализа ДРРЛ глобулярных белков: миоглобина и лизоцима.
Методика фурье-анализа данных ДРРЛ была применена для исследования глобулярных и мембранных белков. В качестве глобулярных белков были взяты миоглобин и лизоцим. Выбор был не случаен, так как при помощи диффузного рассеяния рентгеновских лучей изучение структуры этих белков уже проводилось ранее [99-102, 117, 128], однако в основном применялись прямые методы обработки интенсивности рентгеновского рассеяния, такие как "метод шаров" и "метод кубиков". При этом белки изучались только в растворе, и не исследовались изменения в структуре, происходящие при последовательном повышении степени гидратации. Важно также, что эти глобулярные белки имеют различную структурную организацию: миоглобин - сс-белок, имеющий в качестве элементов вторичной структуры только ос-спирали, лизоцим - (сс+Р)-белок, в котором сс-спирали и р-структуры не чередуются, а скорее группируются с себе подобными так, что часть молекулы приобретает пространственную укладку чисто сс-спирального типа, другая чисто - р-типа. На рис.4.1(a) изображены угловые зависимости интенсивности рентгеновского рассеяния на образцах миоглобина, а на рис.4.2(а) - угловые зависимости интенсивности рентгеновского рассеяния на образцах лизоцима для разных степеней гидратации. Вышеописанная методика позволила обнаружить четкую корреляцию между сдвигом "первого" максимума функции радиального распределения (или ослаблением внутриглобулярных водородных связей) и возрастанием внутримолекулярной подвижности как в миоглобине (см. рис. 4.1(6)), так и в лизоциме (см. рис. 4.2(6)). В случае миоглобина "первый" пик плавно сдвигается во всем диапазоне степеней гидратации от 2.4А (степень гидратации й=0.05(г(Н2О)/г(белка))) до 2.9А (степень гидратации Л=0.89). Величины и положения максимумов четырех пиков на функции радиального распределения для миоглобина, а также другие значения представлены в таблице 4.1. В случае лизоцима данный пик сдвигается от 2.5А (Л=0.05) до 2.9А (й=0.45). При дальнейшей гидратации лизоцима положение "первого" максимума не изменяется. Величины и положения максимумов четырех пиков на функции радиального распределения для лизоцима, а также некоторые другие значения представлены в таблице 4.2. Надо отметить, что для обоих белков в функционально активном (гидратированном, /г 0.45) состоянии положение "первого" максимума достигает предельного значения в 2.9А.
При этом, с повышением гидратации, растет интенсивность этого максимума. "Второй" пик не меняет своего положения (в случае лизоцима пик лежит при 4.6А) или слабо сдвигается в сторону меньших значений от 4.8А до 4.6А (при Л=0.37) в случае миоглобина (см. рис.4.1(6) и рис.4.2(б)). Неоднородное уширение данного пика для обоих белков сильно уменьшается с повышением гидратации. Мы связываем это явление с упорядочением структуры глобулы при гидратации. На этих же рисунках хорошо заметно постепенное с повышением степени гидратации формирование "третьего" максимума. "Третий" пик у обоих белков с добавлением воды быстро сдвигается в сторону меньших значений и стабилизируется около 6.7 А, при этом также уменьшается его неоднородное уширение. Этот факт существенно отличает вид функции радиального распределения для чистой воды [129-130] и водно-белковых систем. Из таблиц 4.1 и 4.2 видно, что поведение "четвертого" максимума при повышении гидратации в целом похоже на поведение "третьего", однако он окончательно стабилизируется при значениях 9.0А (миоглобин) и 9.3 А (лизоцим). "Третий" и "четвертый" пики, по-видимому, отвечают за формирование гидрофобного ядра и дальних взаимодействий между элементами вторичной структуры соответственно. Отличие в окончательных положениях "четвертого" максимума для лизоцима ((сс+р)-белок) и миоглобина (а-белок) можно объяснить разной третичной структурой, которая обусловлена функциональными особенностями этих белков и в случае миоглобина позволяет сформировать более компактную упаковку элементов вторичной структуры при добавлении воды. Результаты изучения функции радиального распределения, полученной с помощью Фурье-преобразования на основании данных по диффузному рассеянию рентгеновских лучей, позволяют сделать вывод о том, что вода, в процессе гидратации белка, ослабляет внутриглобулярные водородные связи и разрыхляет белок, что приводит к увеличению внутримолекулярной подвижности. Данная методика позволила обнаружить четкую корреляцию между сдвигом "первого" максимума интенсивности рассеяния, ослаблением внутриглобулярных водородных связей, возрастанием внутримолекулярной подвижности, как в лизоциме, так и в миоглобине и появлением заметной функциональной активности [12, 15-16, 19-22, 131]. Эти результаты хорошо коррелируют с другими экспериментальными данными по увеличением теплоемкости лизоцима, изменению диамагнитной восприимчивости, логарифма времени вращательной релаксации ЭПР метки, частоты растяжения О-D связи и т.д. [132-137]. В тоже время действие воды [138-143] приводит к упорядочению макромолекулы, которая переходит из стеклообразного состояния (при h=0.2) в нативное (при /2=0.4-0.7). 4.3. Исследование с помощью фурье-анализа ДДРЛ мембранных белков: белков реакционного центра (РЦ) пурпурных бактерий. Методика фурье-анализа данных ДРРЛ была применена для исследования мембранных белков. Выбор в качестве объекта исследования РЦ Rh. sphaeroides удачно позволил изучить вклад в функцию радиального распределения белков разных типов (L+M-субъединицы РЦ - сс-белки, имеющие в качестве элементов вторичной структуры только ос-спирали, Н-субъединица РЦ - (а+Р)-белок) [144-145]. Ранее изменения в структуре этих белков, сопутствующие повышению гидратации, при помощи ДРРЛ не изучались.
Первичные процессы фотосинтеза проходят в реакционных центрах, представляющих собой комплекс порфириновых пигментов (хлорофилла) и некоторых кофакторов со специфическими белками, которые являются частью хроматофор [146-147]. Состав РЦ таков: белковая часть с тремя полипептидами L, М и Н с молекулярными массами 19000, 22000 и 28000 соответственно. L и М включают порфириновые пигменты - 4 молекулы бактериохлорофилла и 2 молекулы бактериофеофитина, а также 2 молекулы хинонов - убихинонов Q-10 и 1 атом железа в негемовой и неферредоксиновой форме координации. Установлено, что две из четырех молекул бактериохлорофилла выполняют роль фотохимического донора электрона, а одна из двух молекул бактериофеофитина действует как промежуточный переносчик электронов между парой молекул бактериохлорофилла и одним из хинонов, первичным акцептором QA- С реакционным центром в мембране тесно ассоциированы цитохромы с, которые представляют собой электронные доноры для РЦ. Общий путь переноса электрона в хроматофорах носит замкнутый характер. При действии света электрон от Вг (пары молекул бактериохлорофилла) переходит на QA, затем на вторичный акцептор QB И цитохром с, который затем отдает электрон на Е$2 [34]. В фотосинтетических РЦ светопоглощающий пигмент (хлорофилл), электронно-транспортная цепь, АТФ-система находятся в нерастворимой мембране. Исследования проводятся путем выделения соответствующих компонент детергентами. На рисунках 4.3(a) и 4.4(a) изображены угловые зависимости интенсивности рентгеновского рассеяния для разных степеней гидратации на образцах L+M-субъединиц РЦ и Н-субъединицы РЦ соответственно, а на рисунках 4.3(6) и 4.4(6) соответствующие им функции радиального распределения. Хорошо заметно, что в обоих случаях поведение "первого" максимума, связанного с ослаблением водородных связей и возрастанием внутримолекулярной подвижности, в целом имеет сходную с наблюдавшейся для глобулярных белков миоглобина и лизоцима картину (см. также таблицы 4.3 и 4.4). Для белков РЦ в функционально активном (гидратированном, /г 0.27) состоянии положение "первого" максимума достигает предельного значения в 2.9А. "Второй" максимум также как в случае глобулярных белков достаточно быстро с повышением степени гидратации стабилизируется при значении 4.6А.
