Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Особенности лишайникового симбиоза 9
1.1.1 Вторичные метаболиты лишайников 11
1.2 Клеточная стенка нелихенизированных и лихенизированных грибов 13
1.2.1 Хитин 17
1.3.1.1 Методы выделения хитина и хитин-глюканового комплекса 21
1.2.3 Глюканы 24
1.2.4 Хитозан 26
1.3 Особенности строения клеточной стенки фотобионта 28
1.3.1 Белки клеточной стенки водоросли (фотобионта) 29
1.4 Особенности строения клеточной оболочки цианобионта 31
1.5 Методы определения и анализа белков клеточной стенки гриба (микобионта) 37
1.5.1 Способы гликозилирования белков клеточной стенки 37
1.5.2 Методы анализа белков, выделенных из клеточных стенок грибов 38
1.5.3 Способы выделения белков из клеточных стенок грибов 40
1.5.4 Гидрофобные белки клеточной стенки грибов 44
1.5.5 Функции белков клеточных стенок 45
1.6 Роль клеточной стенки в минеральном обмене лишайников 47
Экспериментальная часть 51
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1 Световая и электронная сканирующая микроскопия 51
2.2 Выделение клеточных стенок таллома лишайника 53
2.3 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп клеточных стенок таллома лишайника 54
2.4 Определение содержания свободных аминогрупп в клеточных стенках и слоевищах лишайника методом неводного титрования в уксусной кислоте 56
2.5 Определение содержания воды в интактных слоевищах лишайника и весового коэффициента набухания клеточных стенок лишайника в воде и растворах 57
2.6 Получение хитин-глюканового комплекса лишайника P. aphthosa 57
2.7 Количественная характеристика белковых фракций 58
2.8 Определение эндогенного содержания ионов в талломе лишайника P. aphthosa 60
2.9 Элементный анализ 61
2.10 Электрофоретические методы. Подготовка материала 61
2.11 Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях 62
2.12 Окрашивание белков в полиакриламидном геле при помощи кумасси 63
2.13 Вестерн-блот анализ 63
2.14 Визуализация белков на нитроцеллюлозной мембране 63
2.15 Флюоресценция амилоидоподобных белков с Тиофлавином Т 64
2.16 Визуализация амилоидоподобных белков с помощью Конго красного 64
Результаты и обсуждение 65
Глава 3. Изучение особенностей анатомо-морфологической структуры и биохимического состава таллома лишайника 65
3.1 Особенности анатомо-морфологической структуры трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa 65
3.2 Общее содержание белка в талломе лишайника 79
3.3 Эндогенное содержание ионов калия, натрия, кальция, нитрат-ионов и хлорид- ионов в талломе лишайника P. aphthosa 85
Глава 4. Исследование ионообменных свойств и белков клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa в зависимости от возраста 92
4.1 Определение чистоты выделенных препаратов клеточных стенок 92
4.2 Качественный и количественный состав ионообменных групп клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa 95
4.2.1 Характеристика оводненности слоевища и набухания клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa 107
4.3 Определение количества свободных аминогрупп в клеточных стенках методом неводного титрования 112
4.4 Анализ хитин-глюканового комплекса, вьвделенного из трехкомпонентного лишайника P. aphthosa 117
4.5 Характеристика состава белков клеточных стенок апикальной, медиальной и базальной зон таллома лишайника P. aphthosa 131
4.5.1 Анализ SEP-фракции белков, полученной из измельченных частей таллома лишайника P. aphthosa 132
4.5.2 Анализ SEP-фракции белков, полученной из целых частей таллома лишайника P. aphthosa 135
4.5.3 Вестерн-блот анализ экстракта SEP-фракции белков, предварительно меченных модифицированным биотином 139
4.6 Выявление амилоидоподобных белков в талломе лишайника P. aphthosa 150
Заключение 154
Выводы 157
Список литературы 158
- Клеточная стенка нелихенизированных и лихенизированных грибов
- Особенности анатомо-морфологической структуры трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa
- Характеристика оводненности слоевища и набухания клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa
- Выявление амилоидоподобных белков в талломе лишайника P. aphthosa
Введение к работе
ктуальность проблемы. В настоящее время не возникает сомнений, что клеточная
нка - одна из важнейших динамичных структур клеток микроорганизмов и высших стений (Горшкова, 2007). В талломах симбиотических организмов - лишайников, ормированных гифами гриба, клетками микроводорослей и/или цианобактерий, еточные стенки компонентов выполняют разнообразные функции: селективного навшшя и специфического контактного взаимодействия партнеров, формирования икальной морфофизиологической структуры таллома, определяют устойчивость шайников к неблагоприятным абиотическим факторам, участвуя в осуществлении мплекса взаимодействий между компонентами симбиотической системы и окружающей
дой (Nieboer, 1978; Loppi et al, 1997; Wosten and Wessels, 1997; Бязров, 2005; Sacristan al, 2007; Феоктистов и др, 2009).
Ввиду того, что лишайники представляют целостную систему из нескольких мпонентов, которые трудно разделимы, то изолированная из такой сложной системы
«точная стенка» является суммой клеточных стенок отдельных ее компонентов. Однако едует учитывать, что в составе препарата «клеточной стенки» таллома лишайника еобладает клеточная стенка микобионта, т.к. грибной компонент составляет основную лю (90-98%) биомассы таллома (Palmqvist, 2000; Бязров, 2005).
Одним из лимитирующих факторов формирования и роста лишайников in vivo является ажность среды обитания. Известно, что границы влажности, в которых организм изиологически активен, определяют ареал его распространения в наземных экосистемах almqvist, 2000). Можно предположить, что, не имея специализированных структур для глощения и транспорта ионов, ионообменные группы клеточных стенок компонентов шайников играют ключевую роль в процессах поступления в талломы минеральных ществ и воды из атмосферных осадков. Однако механизмы толерантности лишайников к
сушиванию, а также процессы поглощения и транспорта ионов талломами лишайников учены недостаточно. Можно предположить, что в этом процессе определенную роль грают белки, относящиеся к классу гидрофобинов, и ионообменные группы клеточных
нок.
Хитин-глюкановый комплекс является основным структурным компонентом клеточных
нок грибов, участвующих в формировании лишайникового симбиоза, а его состав оотношение компонентов) свидетельствует о важнейших структурных изменениях в ставе клеточных стенок гриба в зависимости от возраста таллома. Необходимо отметить, і хитин-глюкановый комплекс у грибов участвует в процессах поступления и акопления минеральных веществ из атмосферных осадков (Ugrozov et al, 2008). Данные итературы о структурных изменениях в хитин-глюкановом комплексе в зависимости от зраста таллома лишайника отсутствуют.
Процесс формирования талломов лишайников in vivo связан с селективным узнаванием партнеров и их специфическим взаимодействием. Механизмы взаимодействия микобионта с циано- и фикобионтами различны. У цианолишайников ведущая роль в этом процессе отводится лектинам, белкам или гликопротеинам, способным связывать олигосахаридные остатки с высокой специфичностью, а у фиколишайпиков - специфическим АВР-белкам (algal binding protein) микобиоптов, являющихся компонентами их клеточных стеиок (Sacristan et al., 2007). В литературе мало данных о специфических АВР-белках микобионтов в составе талломов лишайников. Известно, что они, взаимодействуя с рецепторами клеточных стенок водорослей, приводят к структурной перестройке как клеточных стенок фикобионта, так и цитоплазмы, вызывая деградацию хлоропластов (Sacristan et al., 2007). Можно предположить, что у трехкомпонецтного лишайника Peltigera aphthosa в состав клеточных стенок молодых частей таллома (апикальная и медиальная зоны) входят как специфические АВР-белки, участвующие в связывании фикобионта таллома - зеленой водоросли рода Соссотуха, так и лектины, осуществляющие селективное узнавание цианобактерий рода Nostoc, формирующих поверхностные цефалодии. Специфические белки клеточных стенок лишайников до настоящего времени изучены недостаточно.
Цель работы. Комплексное изучение состава и функциональной роли ионообменных групп и специфических белков клеточных стенок лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd в связи с особенностями структурной организации его таллома.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
изучить морфоструктурные особенности строения таллома лишайника P. aphthosa;
охарактеризовать состав ионообменных групп клеточных стенок таллома лишайника Р. aphthosa;
3) определить роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках
лишайника P. aphthosa;
4) изучить участие в ионообменном процессе хитин-глюканового комплекса микобионта;
выявить специфические нековалентно закрепленные и закрепленные при помощи дисульфидных связей белки, входящие в состав клеточных стенок таллома P. aphthosa;
установить функциональную роль ионообменных групп и специфических белков клеточных стенок таллома лишайника.
Научная новизна. В работе предложен новый подход к изучению таллома лишайника Р. aphthosa (L.) Willd, основанный на выделении структурно-функциональных зон, которые различаются анатомо-морфологическим строением и биохимическим составом. Впервые установлено, что в составе клеточных стенок лишайника P. aphthosa присутствуют четыре типа функциональных групп, из них три являются катионообменными (два типа карбоксильных групп и фенольные ОН-группы), и одна - анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, характеризующие количественный и
качественный состав ионогенных групп клеточных стенок P. aphthosa, а также интервалы рН, в которых эти группы ионизированы и способны вступать в ионообменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Определены параметры, количественно характеризующие способность к набуханию клеточных стенок P. aphthosa. На основании значений коэффициентов набухания клеточных стенок и таллома лишайника установлена важная роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника. Впервые выделен и проанализирован хитин-глюкановый комплекс из клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa. Показано, что его состав изменяется в зависимости от зоны таллома, т.е. от возраста лишайника.
Впервые проведено комплексное исследование нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков, входящих в состав клеточных стенок лишайника P. aphthosa. Показано, что качественный и количественный состав белков клеточных стенок изменяется в зависимости от зоны таллома. Установлено, что у Р. aphthosa некоторые из нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности представлены белками со свойствами амилоидов.
Практическое значение. Предложен метод для выделения и анализа хитин-глюканового комплекса P. aphthosa, который может быть применен для анализа хитин-глюканового комплекса других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. Разработан новый подход к исследованию белков клеточных стенок P. aphthosa, который может быть использован в микологических исследованиях.
Полученные в работе результаты о присутствии в составе клеточной поверхности лишайника P. aphthosa нековалентно закрепленных белков со свойствами амилоидов необходимо учитывать при биотехнологическом использовании биомассы лишайников.
Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по «Общей симбиологии» для студентов биологического факультета МГУ.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедр физиологии микроорганизмов и микологии и альгологии биологического факультета МГУ; семинаре кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ; Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А. С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург, 2005; Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы, Казань, 2006; Междисциплинарном микологическом форуме с международным участием, Москва, 2009; конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» с международным участием, Москва, 2009.
Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 5 работ. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно
с автором в процессе выполнения работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена їй 173 стр. машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 203 наименования (из них 162 па иностранных языках). Работа содержит 18 таблиц и иллюстрирована 77 рисунками.
Клеточная стенка нелихенизированных и лихенизированных грибов
Клеточные стенки вегетативных клеток грибов, за исключением самых примитивных представителей хитридиомицетов и гифохитридиомицетов, имеют сложную многослойную структуру, состоящую из аморфного матрикса и микрофибрилл (рис. 1.2.1). Основными компонентами клеточной стенки большинства грибов являются: хитин, глюканы и хитозан (Феофилова, 1983). Клеточные стенки содержат до 80-90% полисахаридов (гексозы, аминосахара, гексуроновые кислоты, пентозы, метилпентозы), связанных с белками и липидами, и, в ряде случаев, с пигментами. Клеточная стенка грибоподобных организмов (гифохитридиомицеты и оомицеты) содержит целлюлозу. Клеточная стенка составляет 15-30% от массы сухого мицелия грибов, а её толщина - около 0,2 мкм (Феофилова, 1983; Gooday, 1995; Klis et al., 2007).
Клеточная стенка грибов имеет четыре важные функции:
1. Стабилизация внутреннего осмотического давления. Осмотическое давление цитоплазмы грибной клетки обычно выше, чем снаружи. Она противодействует внутреннему давлению цитоплазмы и препятствует избыточному току воды в клетку.
2. Защита от внешних стрессовых факторов. Сочетание прочности и высокой эластичности клеточных стенок позволяет передавать и перераспределять стрессовые воздействия и избегать механических повреждений. Клеточная стенка определяет микроокружение около плазматической мембраны и создает условия для последующего обмена между клетками и окружающей средой (Gooday, 1995; Duran, Nombela, 2004; Klis et al., 2006).
3. Поддержание клеточной формы, что является важным для морфогенеза.
Клеточная стенка участвует в образовании выростов (Abramova et al., 2001).
4. В защите от проникновения чужеродных агентов (De Nobel et al., 1990).
Клеточная стенка талломов лишайников участвует в узнавании компонентов и в дальнейшем формировании сложной структуры таллома. Не имея специализированных структур для транспорта воды и минеральных веществ, клеточная стенка у лишайников выполняет определяющую роль в этом процессе.
У грибов различают первичную и вторичную клеточную стенку. Первичная клеточная стенка образуется на кончике гифы и по мере её роста становится внутренним слоем зрелой клеточной стенки (Феофилова, 1983). Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что рост гифы в ее апикальной зоне происходит за счет тургорного давления на кончике гифы. В этом процессе принимают участие хитосомы и содержащиеся в них белки (Sietsma, Wessels, 2006). Было показано, что основным компонентом клеточной стенки апикальной части гифы является хитин (Sietsma, Wessels, 2006). Первичная стенка апикальной клетки гифы, содержащая хитин, и, возможно, расположенный над хитином слой белка, составляет только 0,13 мкм в толщину. Микрофибриллы хитина являются первичным «скелетом», на котором строится клеточная стенка. По мере удаления от апекса гифы клеточная стенка заметно утолщается (0,28 мкм), и у неё образуется вторичный слой, включающий глюканы, маннаны, и другие полимеры (Феофилова, 1983).
Полисахаридный состав клеточной стенки у различных представителей грибов может значительно различаться, однако все компоненты клеточной стенки можно разделить на две группы. Это - структурные (опорные) компоненты и компоненты, заполняющие пространство между ними. Первые представлены полиаминосахаридами (хитином, хитозаном) и глюканами, а вторые - являются маннопротеинами, галактоманнопротеинами, ксиломаннопротеинами, глюкурономаннопротеинами и а-1,3-глюкан (Феофилова, 2002; Cabib et al., 1982; Cabib, 1987).
О роли со-1,3-глюкана известно мало. Некоторые авторы относят этот компонент клеточной стенки к структурным (Sietsma, Wessels, 2006). Структурными единицами опорных компонентов являются N-ацетил-О-глюкозамин, D-глюкозамин и глюкоза. Структурные полисахариды образуют комплексы с белками и липидами (Феофилова, 1983; Gooday, Trinci, 1980).
В клеточных стенках большинства дрожжей присутствуют маннаны, которые ковалентно связаны с другими полисахаридами клеточной стенки (рис. 1.2.1) (Latge, Calderone, 2006). Структурными компонентами клеточной стенки являются также остатки фукозы, маннозы, галактозы и глюкуроновой кислоты, которые входят, например, в состав клеточной стенки зигомицетного гриба Мисог mucedo в молярном соотношении компонентов 5:1:1:6 соответственно. К структурным компонентам клеточных стенок относят и пигменты (например, меланин), которые защищают клетку от неблагоприятных факторов внешней среды (солнечная радиация, высушивание, ферментативный лизис и др.) (Gooday, 1995).
Цитохимические и электронно-микроскопические исследования, а также данные химического и ферментативного анализов показывают, что клеточная стенка грибов состоит из нескольких слоев. Наружный слой является гладким или слегка гранулированным и включает аморфный матрикс, построенный обычно из гликопротеидов. Внутренние фибриллы, как правило, ориентированы по главной оси клетки, наружные - под углом к ней. Микроскопический опорный слой клеточной стенки прилегает непосредственно к плазмалемме, а внутрифибриллярное пространство в этом слое заполнено аморфным материалом, по своему строению часто соответствующим наружному слою (Bartnicki-Garcia, 1968; Farkas, 1979). Фибриллы хитина представляют собой агрегаты макромолекул диаметром 25-50 нм, состоящие, в свою очередь, из микрофибрилл диаметром 2,5-2,8 нм. Такое строение этого полимера обеспечивает выполнение важной биологической функции - армирование тканей. Наружная поверхность клеточной стенки, как правило, состоит из аморфного матрикса и поэтому выглядит гладкой или слегка сетчатой (Wessels, Sietsma, 1981; Kuhn et al., 1990). Число слоев в клеточной стенке и её строение во многом зависят от возраста мицелия (Бязров, 2005).
Клеточная стенка гриба является динамичной структурой и, в зависимости от сигналов из внешней среды, может изменять структуру и свойства. В процессе изменения клеточной стенки важную роль играют белки, которые связаны с клеточной стенкой и могут участвовать в гидролизе хитина и полисахаридов (Adams, 2004). В формировании клеточной стенки и регуляции ее физиологического состояния участвуют около 1200 генов (De Groot et al., 2001).
Состав и толщина клеточной стенки во многом зависят от условий роста, температуры, рН среды и уровня кислорода. При выращивании Saccharomyces cerevisiae на различных средах доля клеточных стенок от массы клеток изменяется в пределах от 10,8 до 24,5%. При этом масса хитина составляла от 2,4 до 7,9% от массы клеточных стенок. Содержание маннана и р 1,6-глюкана также различалось в зависимости от условий культивирования (Aguilar-Uscanga, Francois, 2003). Влияние состава среды выращивания, возраста и фазы развития на состав и образование клеточных стенок было показано для мицелиальных грибов (Феофилова, 2002).
В лишайниковом симбиозе в зоне водорослей оболочка гиф значительно тоньше, чем в других участках слоевища; она примерно в 2-4 раза тоньше, чем в сердцевинном слое, и самая тонкая в местах контакта с клеткой фотобионта (Peveling, 1969b).
Клеточные стенки грибов, образующих лишайниковый симбиоз, по строению и химическому составу мало отличаются от клеточных стенок свободноживущих грибов, хотя и претерпевают некоторые изменения. Следует отметить, что и у свободноживущих грибов отмечается относительное однообразие в составе клеточных стенок внутри крупных систематических групп. Однако лишайниковые вещества, откладывающиеся на поверхности клеточных стенок лишайников, существенно влияют на физические и химические свойства клеточной поверхности (Вайнштейн, 1982; Дьяков, 2000; Lawrey, 1977; Gooday, 1995).
Особенности анатомо-морфологической структуры трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa
Изучение анатомо-морфологической структуры с помощью световой и электронной сканирующей микроскопии позволило выделить три зоны, которые существенно различаются структурной организацией компонентов (рис. 2 б). Это апикальная зона (порядка 1 см от края лопасти), медиальная зона (2-4 см до конца лопасти, исключая апикальную зону) и базальная зона (основная масса слоевища).
Апикальная зона
Длина апикальной зоньк таллома лишайника P. aphthosa составляет в среднем 7,62 ±1,2 мм. Это растущая и наиболее динамично развивающаяся часть таллома лишайника. Диагностирующим признаком апикальной зоны можно считать наличие на ее поверхности ищущих гиф (рис. 3.1). Длина ищущих гиф варьирует и по мере приближения к медиальной зоне уменьшается, так же как и их количество. На поверхности апикальной зоны ищущие гифы часто формируют ряды (рис. 3.1). Наличие ищущих гиф увеличивает поверхность контакта апикальной зоны с внешней средой.
На поверхности» ищущих гиф располагается большое количество клеток бактерий разной формы (кокки, мелкие и крупные палочки), которые часто показывают ориентированное прикрепление (рис. 3.2). Интересно отметить, что максимальное скопление клеток бактерий находится у основания ищущих гиф (рис. 3.2).
На поверхности апикальной зоны происходит закладка цефалодиев (рис. 3.3, рис. 3.6), специализированных структур, сформированных азотфиксирующими цианобактериями. Цефалодии апикальной зоны легко отделяются от поверхности таллома, так как прикреплены к ней только кончиками ищущих гиф. Возможно, в зоне ищущих гиф происходит выделение специфических веществ, участвующих в процессах специфического связывания цианобактерий и закладки цефалодиев. Результатами исследований было показано, что эту функцию могут выполнять вещества гликопротеиновой природы - лектины (Феоктистов и др., 2009; Sacristan et al., 2007).
Под цефалодиями сохраняется неизмененная пигментированная верхняя кора таллома лишайника (рис. 3.4).
На поперечном срезе апикальной зоны присутствуют одиночные, мелкие клетки фотобионта, равномерно рассеянные по толщине таллома (рис. 3.5). Причём в нижней его части наблюдается большее количество клеток водорослей и более хаотичное их расположение. Чем ближе к поверхности таллома, тем слой водоросли более структурирован, а отдельные клетки фотобионта отделены друг от друга гифами микобионта (рис. 3.5). Снаружи клетки фотобионта покрыты чехлом. Тонкие гифы микобионта в этой части таллома сильно ветвятся. Клеточная стенка гиф микобионта в апикальной зоне тоньше, чем в двух других зонах, что, возможно, связано с отсутствием вторичной клеточной стенки, которая появляется на более поздних этапах развития гиф.
Медиальная зона
Медиальная часть таллома лишайника расположена между концом апикальной зоны и основанием лопасти (рис. 2 б). Ее размеры, в среднем, составляют 2-4 см. На поверхности медиальной зоны отсутствуют ищущие гифы. Многочисленные мелкие цефалодии в виде извитых палочек или мелких дисков погружаются в поверхность таллома, а при их отделении на поверхности таллома остаются бесцветные пятна, т.е. под цефалодиями отсутствует пигментация. Изучение под световым микроскопом срезов таллома в таких местах показало отсутствие пигментов в .слое верхней коры и зоны фотобионта под ней (рис. 3.7).
Поверхность медиальной зоны таллома усеяна множеством клеток бактерий различной формы (кокки, палочки) (рис. 3.8, рис. 3.9). Они часто оказываются погруженынными в поверхностный матрикс. Интересно отметить, что клетки бактерий на поверхности этой зоны развиваются в виде микроколоний.
Зона фотобионта в медиальной части таллома более структурирована, чем в апикальной зоне. Микроводоросли образуют группы кластеров по 3-5 клеток в каждом (рис. 3.10), объединенные в общем чехле, иногда видны делящиеся клетки (рис. 3.10). На поверхности медиальной зоны практически везде встречается межклеточный матрикс, с погруженными в него бактериями (рис. 3.9). Гифы микобионта тесно прилегают к клеткам или кластерам фотобионта. На гифах микобионта располагается большое количество кристаллов и/или каплевидных включений округлой формы, по-видимому, отложений лишайниковых веществ (рис. 3.11). Гифы гриба сильно ветвятся, но плотность их упаковки меньше (рис. 3.12), чем в апикальной зоне. Клеточные стенки гиф гриба этой зоны часто утолщены, что может свидетельствовать о процессе образования вторичной клеточной стенки. Кроме того, гифы микобионта в зоне фотобионта образуют сотовую структуру, обособляя клетки фотобионта и увеличивая, тем самым, площадь контакта с ними.
Базальная зона
Базальная зона составляет основную часть таллома лишайника P. aphthosa (рис. 2 б). На поверхности этой зоны также располагаются многочисленные клетки бактерий, для которых характерен микрозональный рост. Микробные микроколонии часто погружены в матрикс верхней коры (рис. 3.13). Цефалодии на поверхности этой зоны выявляются в виде крупных до 3 мм в диаметре, дисков, погруженных в таллом лишайника. При их отделении наблюдается повреждение поверхности таллома. Под цефалодиями отсутствуют слои верхней коры и фотобионта (рис. 3.14). Гифы микобионта в этой части лишайника рыхло расположены и сильно ветвятся. Клеточная стенка толще, чем в апикальной и медиальной зонах, что, возможно, свидетельствует об образовании вторичной клеточной стенки. На срезах таллома видны крупные, одиночные клетки фотобионта различной формы, расположенные плотными группами (рис. 3.15). Некоторые клетки повреждены, на фотографиях они выявляются в виде смятых эллипсов или шариков (рис. 3.15, рис. 3.16). Повреждение клеток фотобионта, возможно, связано с процессом подготовки препарата для микроскопического анализа. Однако популяция фотобионта не выглядит деградирующей, так как встречается большое количество делящихся клеток водоросли. Контакт гиф гриба и клеток фотобионта осуществляется по типу апрессорий (плотный контакт только оболочек, без повреждающего действия микобионта) (рис. 3.16). В базальной зоне основную часть таллома формирует массивный слой сердцевины микобионта (рис. 3.14), который на срезе таллома в световом микроскопе обычно имеет темную окраску. Гифы микобионта в этой части лишайника рыхло расположены и сильно ветвятся. Клеточные стенки клеток гриба значительно утолщены по сравнению с таковыми параметрами гиф апикальной и медиальной зон. Их поверхность слабо инкрустирована лишайниковыми веществами (рис. 3.15).
Характеристика оводненности слоевища и набухания клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa
Одним из важных физико-химических показателей, которые количественно характеризуют свойства полимеров КС, как ионообменника, является набухание. Количественной характеристикой этого процесса является весовой коэффициент набухания (Kcw), равный количеству воды в полимере, отнесенной к 1 грамму сухой массы вещества. Причиной набухания ионообменных материалов в водном растворе является наличие гидрофильных групп, причиной нерастворимости -существование поперечных связей между молекулами полимеров в структуре КС. Степень набухания ионообменного материала зависит от свойств ионита и состава внешнего раствора. Чем больший процент поперечных связей в структуре, тем плотнее и жестче полимерная сетка, и тем меньше ее способность к набуханию.
Полученные результаты показывают, что клетки микобионта лишайника имеют достаточно мощные КС (таблица 4.2.1.1). Значение этого параметра зависит от зоны и, соответственно, от возраста таллома и увеличивается от апикальной части к базальной.
На процесс поглощения минеральных веществ из окружающей среды влияет количество воды, поглощенное талломом лишайника. Коэффициент набухания принимает максимальное значение в базальной зоне (таблица 4.2.1.1). Количество поглощаемой влаги базальной зоной варьирует в более широких пределах, чем в апикальной и медиальной зонах. Возможно, это и является одной из причин большего накопления минеральных веществ в базальной зоне. В пользу этого утверждения- свидетельствуют данные зольности P. aphthosa (рис. 3.3.7), принимающие максимальное значение в базальной зоне.
Коэффициент набухания клеточных стенок таллома в воде ( к Г ) принимает максимальный значение в апикальной части таллома, тогда как минимальное - в базальной (таблица 4.2.1.1). Выявленные различия, вероятно, связаны с тем, что именно в апикальной зоне происходят основные процессы роста и формирования таллома лишайника.
Сравнение коэффициентов набухания КС вводе и оводненности слоевищ (таблица 4.2.1.1) показывает, что КС содержат в 2-2,5 раза больше воды, чем слоевища во всех зонах таллома (рис. 4.2.1.1). Это указывает на важную роль КС лишайника P. aphthosa в поддержании водного гомеостаза таллома.
Оводненность таллома P. aphthosa зависят от возраста и во всех зонах выше, чем у С. rangiferina (Любимова, 2005). Различия, возможно, связаны с анатомо-морфологическими особенностями строения талломов (у лишайника P. aphthosa отсутствует слой нижней коры), а также с особенностями среды обитания: Р. aphthosa встречается в более увлажненных местах, чем С. rangiferina. Необходимо отметить, что у С. rangiferina более массивная КС, чем у P. aphthosa, что также может определять большее значение оводненности таллома у С. rangiferina.
Как у P. aphthosa, так и у С. rangiferina коэффициент набухания КС значительно выше, чем оводненность таллома, что указывает на значительную роль КС в поддержании водного гомеостаза в клетках талломов исследуемых лишайников. Коэффициент набухания КС в воде выше у лишайника P. aphthosa (таблица 4.2.1.1) в сравнении с лишайником С. rangiferina (Любимова, 2005) (рис. 4.2.1.2). Вероятно, это связано с тем, что в КС P. aphthosa степень поперечной связанности полимеров меньше, чем у лишайника С. rangiferina. Необходимо отметить, что P. aphthosa обитает в более влажных местах, что может определять большее значение коэффициента набухания КС P. aphthosa, чем С. rangiferina.
На значения оводненности таллома и коэффициента набухания КС, возможно, влияет компонентность таллома. Так, лишайник P. aphthosa является трехкомпонентным и для его роста и развития необходимо больше влаги, чем для двухкомпонентного лишайника С. rangiferina.
Полученные данные (таблица 4.2.1.1) о доле КС P. aphthosa в общей сухой массе таллома согласуются с данными электронной сканирующей и световой микроскопии. Согласно данным электронной сканирующей микроскопии КС толще в базальной зоне (рис. 4.2.1.3а), нежели в двух других зонах (рис. 4.2.1.36). Возможно, это связано с образованием вторичной КС. Согласно полученным данным (таблица 4.2.1.1), наибольшая оводненность слоевища характерна для базальной зоны. Данные электронной сканирующей микроскопии свидетельствуют о том, что наибольшее количество гиф микобионта и меньшая плотность их упаковки характерны для базальной зоны таллома лишайника.
Выявление амилоидоподобных белков в талломе лишайника P. aphthosa
ДМСО позволяет экстрагировать нековалентно закрепленные белки КС. Для анализа белков, экстрагированных при помощи ДМСО из интактных частей таллома P. aphthosa, получали две пробы: 1) экстракт белков в ДМСО без встряхивания проб и 2) экстракт в ДМСО белков, полученных встряхиванием проб. Анализ полученных проб может указывать на тип взаимодействия амилоидоподобных белков с другими компонентами клетки. Обе пробы были проанализированы при помощи тиофлавина Т на наличие белков с Р-структурой и на окрашивание Конго красным.
Наличие Р-структуры в экстракте белков, полученном с использованием ДМСО из таллома лишайника P. aphthosa было показано при помощи тиофлавина Т. Был зарегистрирован пик флюоресценции при длине волны 490 нм (Рис. 4.6.1). После окрашивания экстракта Конго красным в световом микроскопе в поляризованном свете детектировались пятна с желто-зеленым свечением, что может свидетельствовать о присутствии в талломе амилоидоподобных белков.
Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 4.6.2 А) показал наличие в экстракте белков двух белковых полос - 24 Юа и порядка 9 Юа. При вестерн-блот анализе с модифицированным биотином эти полосы не детектировались (рис. 4.6.2 Б). Если пробы встряхивать, то на электрофорезе в тех же условиях проявляется 5 белковых полос с молекулярными массами в пределах от 9 до 24 kDa (рис. 4.6.3 А). При вестерн-блот анализе с модифицированным биотином эти полосы не детектировались (рис. 4.6.3 Б). Можно предположить, что лизиновые остатки или недоступны для модифицированного биотина, или они отсутствуют. Возможно, эти белковые полосы принадлежат внутриклеточному содержимому, но работ, показывающих, что ДМСО разрушает цитоплазматическую мембрану, нет. Вероятно, эти белки принадлежат белкам клеточной поверхности и не экстрагируются в буфер Леммли. Однако на вестерн-блот анализе (рис. 4.6.2 Б) выявлена белковая полоса, которая детектируется на вестерн-блот анализе белков КС (рис. 4.5.3.4). Можно предположить, что белок с молекулярной массой 67 kDa является амилоидным, а для флуоресценции с тиофлавином Т достаточно небольшое его количество.
При встряхивании пробы было детектировано на 3 белковые полосы больше, чем без встряхивания проб (рис. 4.6.3 А). Как в пробе без встряхивания, так и в пробе после встряхивания с помощью тиофлавина Т было показано наличие белков с р-структурой и свечение с Конго красным. Полученные данные указывают на то, что амилоидоподобные белки слабо закреплены и достаточно легко экстрагируются. При вестерн-блот анализе (рис. 4.6.3 Б) детектируются, помимо белковой полосы 67 kDa, другие белковые полосы. Интенсивность окрашивания белковой полосы 67 Ша выше в пробе без встряхивания (рис. 4.6.2 Б), чем в пробе при встряхивании (рис. 4.6.3 Б). Можно предположить, что при переносе белков на нитроцеллюлозную мембрану в случае встряхивания (рис. 4.6.3 Б), перенос проходил не полностью, и часть белков осталась в геле. Не исключается также вероятность того, что в полученных фракциях содержится больше белков, чем определено методами электрофореза в ПААГ и вестерн-блотом (рис. 4.6.2 и 4.6.3), что можно объяснить чувствительностью методов.
Следует заметить, что наличие Р-структуры у белков с молекулярной массой в пределах 15-24 kDa, было показано для гидрофобинов грибов и лишайников, входящих в состав КС (Wosten, Wessels, 1997). Возможно, описанные в литературе гидрофобины, являются амилоидоподобными белками. Лишайники постоянно испытывают фазы увлажнения и высушивания (Окснер, 1974; Бязров, 2005; Palmqvist, 2000). Можно предположить, что амилоидоподобные белки участвуют в защите лишайника от неблагоприятных условий обитания. Следует отметить, что белковая полоса 24 kDa не детектируется на электрофорезе SEP-фракции белков, полученной из интактных частей таллома лишайника (рис. 4.5.2.1). Возможно, это связано с тем, что применялся другой способ экстракции (ДМСО), и пробы после экстракции ДМСО концентрировались.
