Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 11
2.1. Общие сведения о стрептококках
2.2. Факторы патогенности стрептококков группы В 13
2.2.1. р антиген стрептококков группы В 14
2.2.2. Семейство Alp белков СГВ 16
2.2.3. С5а пептидаза стрептококков группы В 18
2.2.4. Другие факторы патогенности стрептококков группы В 20
2.3. Сведения о липопротеинах семейства Lral 24
2.3.1. Особенности строения липопротеинов грамположительных бактерий 26
2.3.2. АТФ-связывающие транспортные системы АВС-типа 27
2.3.3. Роль Мп транспортных систем АВС-типа в вирулентности 31
2.3.4. Другие функции липопротеинов семейства Lral 33
2.3.5. Липопротеины семейства Lral - компоненты вакцин против стрептококков 34
3. Материалы и методы 37
3.1. Бактериальные штаммы, плазмиды, культуральные среды и условия роста 37
3.2. Выделение хромосомной ДНК 38
3.3. Выделение плазмидной ДНК 39
3.4. Выделение ДНК из агарозного геля 39
3.5. Рестрикция и лигирование ДНК 40
3.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле 40
3.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40
3.8. Трансформация Escherichia col 42
3.9. Гибридизационный анализ ДНК 42
3.10. Создание фаговой библиотеки генома СГВ 43
3.11. Секвенирование ДНК 43
3.12. Электропорация стрептококков группы В 44
3.13. Метод адгезии СГВ на клетках вагинального эпителия 45
3.14. Методы выделения и очистки рекомбинантных белков 46
3.15. Электрофорез белков 47
3.16. Изучение иммунного ответа 47
3.17. Определение константы связывания антител к рекомбинантному белку ScaAB 48
3.18. Модельная СГВ инфекция 48
3.19. Исследование протективных свойств белков 49
3.20. Опсонофагоцитарная реакция макрофагов мыши с СГВ 49
3.21. Компьютерный анализ 51
4. Результаты и обсуждение 52
4.1. Клонирование гена возможного фактора адгезии СГВ 52
4.2. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности гена scaAB 57
4.3. Сравнительный анализ строения оперонов ABC-транспортных систем 62
4.4. Получение мутантов СГВ по гену scaAB 63
4.5. Анализ штаммов СГВ разных серотипов на присутствие гена scaAB 67
4.6. Получение рекомбинантного белка ScaAB 68
4.7. Оптимизация экспрессии белка ScaAB в рекомбинантном штамме Е. соН 74
4.8. Оценка титра антител к рекомбинантному белку ScaAB в сыворотке мышей после модельной СГВ инфекции
4.9. Изучение иммунного ответа на рекомбинантный белок ScaAB 78
4.10. Изучение протективных свойств рекомбинантного белка ScaAB
4.11. Исследование протективности иммунной сыворотки к белку ScaAB на
суточном слое мышиных макрофагов
5. Заключение
6. Выводы
7. Список литературы
8. Благодарности
- Другие факторы патогенности стрептококков группы В
- Липопротеины семейства Lral - компоненты вакцин против стрептококков
- Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности гена scaAB
- Изучение иммунного ответа на рекомбинантный белок ScaAB
Введение к работе
В настоящее время заболевания, вызываемые стрептококками группы В (СГВ), рассматриваются как важная медицинская и социальная проблема во всех странах мира. Это связано с увеличением числа случаев заболеваний, вызываемых СГВ, а также с увеличением уровня носительства стрептококков данной группы здоровыми людьми. Стрептококки группы В являются одной из основных причин неонатальных инфекций, чаще всего протекающих в форме сепсиса и менингита. СГВ инфекция у новорожденных обычно развивается в первые часы или дни после родов, при этом нередки случаи молниеносного течения болезни. Заражение ребенка происходит во время родов от матери с носительством СГВ или еще антенатально в случае наличия у матери скрытой инфекции СГВ. В связи с этим все большую актуальность принимает бессимптомное носительство, процент которого достигает в разных странах от 30 до 50%.
Стрептококки группы В вызывают также и ряд серьезных заболеваний у взрослых, таких как пиелонефрит, офтальмит, артрит, эндокардит, септицемия, причем в ряде развитых стран, например в США, СГВ инфекции взрослых превосходят уровень заболеваний новорожденных. В последние годы накопились данные о способности СГВ вызывать серьезные инвазивные поражения различных органов и систем человека с высокой частотой летальных исходов (до 30% случаев), которые сопровождаются токсическим шоком и некротическим фасцитом. Тревогу вызывают случаи появления штаммов СГВ, устойчивых к действию многих лекарственных препаратов. Проблема стрептококковой патологии и детской смертности особенно остро стоит в нашей стране, где в связи с ухудшением экономической ситуации и снижением уровня жизни населения резко понизилась рождаемость. Все вышесказанное определяет социально-экономическое и общемедицинское значение исследований стрептококков группы В.
Большинство исследователей рассматривает полисахаридную капсулу в качестве основного фактора патогенности СГВ. Кроме того, к факторам патогенности относят такие синтезируемые СГВ ферменты, как нуклеазы, протеазы, CAMP фактор, гемолизин, С5а пептидаза и др. В настоящее время значительное внимание уделяется изучению поверхностных белков СГВ, играющих важную роль на разных стадиях развития инфекции, в том числе и участвующих в процессах адгезии. Многие поверхностные белки, обладающие высокой иммуногенностью за счет непосредственного взаимодействия с системой иммунитета хозяина, в настоящее время рассматриваются в качестве потенциальных компонентов вакцин против стрептококков группы В. Более того, изучение поверхностных белков СГВ интересно с точки зрения некоторых проблем медицинской микробиологии, таких как механизмы адгезии к клеткам эпителия или взаимодействия с белками плазмы крови. Среди поверхностных белков СГВ следует отметить группу фибриллярных белков, семейство Alp-подобных белков, р антиген, а также липопротеины, в том числе и липопротеин Lmb. В настоящее время наиболее интенсивно ведутся исследования поверхностных белков, однако их роль в формировании вирулентного фенотипа и механизмы взаимодействия с иммунной системой хозяина изучены недостаточно. Особенно важным представляется изучение белков, задействованных на начальных этапах развития инфекции, а именно, в процессах адгезии, и проникновения в ткани организма хозяина (пенетрации).
В последнее десятилетие у многих видов стрептококков был выявлен ряд сходных по строению поверхностных липопротеинов, участвующих в процессах адгезии и агрегации. Все эти липопротеины относятся к семейству Lral и являются компонентами ABC транспортных систем, ответственных за транспорт Мп2+ в клетку. Последние исследования показали, что большинство известных стрептококковых липопротеинов семейства Lral обладают протективными свойствами, что позволяет рассматривать их как перспективные компоненты вакцин против стрептококковых инфекций. Нами было сделано предположение, что у стрептококков группы В также существует подобный липопротеин. Его обнаружению и исследованию свойств данного липопротеина посвящена настоящая работа.
Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования. Целью работы являлось клонирование гена липопротеина СГВ, гомологичного генам липопротеинов Lral стрептококков других групп и изучение свойств кодируемого данным геном белка. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
1. Идентификация и клонирование гена липопротеина СГВ ScaAB, гомологичного генам липопротеинов Lral стрептококков других групп.
2. Определение нуклеотидной последовательности идентифицированного гена.
3. Клонирование рекомбинантного белка ScaAB в экспрессионных векторах в системе Е. coli.
4. Выделение и биохимическая характеристика рекомбинантного белка ScaAB.
5. Получение изогенных мутантов с нарушенной экспрессией гена липопротеина ScaAB.
6. Изучение иммуногенности рекомбинантного белка ScaAB на модели лабораторных животных.
7. Изучение протективной активности рекомбинантного белка ScaAB. Научная новизна и теоретическая ценность работы.
1. Впервые в системе Е. coli осуществлено клонирование гена липопротеина Lral семейства scaAB. Определена нуклеотидная опследовательность данного гена, а также участка гена регулятора транскрипции scaR. Нуклеотидная последовательность депонирована в банк данных нуклеотидных последовательностей GenBank под номером AY 267033.
2. В результате клонирования в экспрессионной векторной системе pQE31 выделен и охарактеризован рекомбинантный белок ScaAB.
3. Показано, что рекомбинантный белок ScaAB подвергается процессингу в системе Е. coli.
4. Показана иммуногенность рекомбинантного ScaAB белка и наличие протективных свойств в отношение модельных СГВ инфекций in vivo и in vitro.
5. Впервые были сконструированы изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией гена липопротеина ScaAB.
Практическая ценность.
Сконструирован штамм Е. coli, продуцирующий рекомбинантный белок ScaAB. Доказано, что рекомбинантный белок ScaAB обладает иммуногенностью и протективностью в отношении СГВ инфекции. Это позволяет рассматривать данный белок как перспективный потенциальный компонент вакцин против СГВ. Положения, выносимые на защиту.
1. Изученный ген scaAB кодирует липопротеин СГВ, принадлежащий к семейству Lral липопротеинов.
2. Белок ScaAB является фактором, стимулирующим иммунный ответ на инфекцию СГВ и обеспечивает протективный иммунитет.
3. Липопротеин ScaAB участвует в процессе адгезии клеток СГВ к клеткам эпителия человека.
Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция, ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование ДНК) и иммунологических методов исследования (ELISA), которые позволяют однозначно трактовать полученные результаты. Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных работах и доложены на 4 симпозиумах и конференциях: 9 Симпозиуме Иммунологического общества Чехии и Словакии, 2000 г.; VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов микробиологов и паразитологов, Москва, 2002 г.; 14 Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням, Чехия, 2004 г.; XVI Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Австралия, 2005 г. Материалы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии ГУ НИИЭМ РАМН (2002, 2003,2004,2005 гг.).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 109 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главу собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 9 таблицами и 17 рисунками. Указатель литературы содержит 142 источника, в том числе 5 отечественных и 137 иностранных.
Другие факторы патогенности стрептококков группы В
Современные исследования показали, что С5а пептидаза является не единственным поверхностно локализованным ферментом СГВ, играющим важную роль в вирулентности микроорганизма. В настоящее время описано еще несколько ферментов, связанных с клеточной стенкой бактерии и обладающих протективными свойствами. Еще одной поверхностной протеазой СГВ является белок CspA массой около 153 KDa (Табл.1). Ген, кодирующий белок CspA, был обнаружен при секвенировании геномов СГВ III и V серотипов [56, 136], а также у большого числа клинических изолятов СГВ [63], что, указывает на физиологическую значимость данного белка СГВ. Протеаза CspA расщепляет а-цепь фибриногена человека и способствует устойчивости к фагоцитозу, однако последнее свойство не обусловлено способностью расщеплять фибриноген, так как сохраняется при инкубации бактерий и с нейтрофилами, и в сыворотке, в отсутствии фибриногена. Следует заметить, что инактивация CspA протеазы путем инсерционного мутагенеза приводит к существенному снижению вирулентности штаммов СГВ в экспериментальной модели неонатального сепсиса крыс.
К факторам, участвующим в формировании вирулентного фенотипа СГВ, можно отнести гиалуронидазу, способную расщеплять гиалуроновую кислоту соединительной ткани (Табл.1) [65]. Однако, несмотря на присутствие соответствующего гена гиалуронидазы, гиалуронидазная активность обнаружена далеко не у всех штаммов [55]. Анализ штаммов, не экспрессируюших гиалуронидазу, показал, что они содержат в структуре гена инсерционную последовательность ДНК IS 1548 размером 1317 н.п., приводящую к инактивации гена гиалуронидазы [58].
Среди прочих факторов патогенности следует отметить CAMP фактор, вызывающий совместно со стафилококковой сфингомиелиназой С гемолиз эритроцитов, что используется для лабораторной диагностики СГВ. CAMP фактор СГВ является экстрацеллюлярным белком массой 23,5 KDa, который вместе с бета-токсином (стафилококковой сфингомиелиназой) способен дестабилизировать и лизировать мембраны эритроцитов (Табл.1) [76]. CAMP фактор без р токсина не способен вызывать гемолиз эритроцитов. Ген с/Ь, кодирующий CAMP фактор, был клонирован в гетерологичной системе Е. coli и экспрессирован рекомбинантный белок [134]. Рекомбинантный белок на основе CAMP фактора способствует выработке антител, которые ингибируют САМР-зависимый феномен развития корпоративного гемолиза эритроцитов.
Недавно был идентифицирован поверхностный белок FbsA стрептококков группы В, который обладает способность связывать человеческий фибриноген (Табл.1). Было обнаружено, что ген fbs, кодирующий белок FbsA, выявлен в 25 из 27 взятых для анализа штаммов СГВ. В настоящее время показано, что мутантные по гену fbs СГВ теряют способность расти в крови человека, что указывает на возможное участие белка FbsA в формировании устойчивости к фагоцитозу [125]. Наряду с белком FbsA, был выявлен еще один белок СГВ, способный связывать фибриноген и обозначенный как FbsB [61] или Fgag [68]. Этот белок, в отличие от белка FbsA, не является поверхностным, но секретируется во внешнюю среду. Механизм действия белка FbsB/Fgag не известен, однако этот белок участвует в проникновении возбудителя в клетки человеческого эпителия [61].
К факторам патогенносте СГВ ряд исследователей относит и Sip белок массой 45 кДа, находящийся на поверхности клеток [24, 103, 115]. Важно отметить, что иммунизация мышей рекомбинантным белком Sip приводила к приобретению протективиого иммунитета против летальных инфекций, вызываемых СГВ [103]. У высоковирулентного штамма серотипа III был выявлен белок Spbl стрептококков группы В, который участвует в процессе адгезии бактериальных клеток к клеткам эпителия. Данный белок рассматривается рядом авторов как возможный фактор патогенности СГВ и поверхностный адгезии, однако следует отметить, что полные геномные сиквенсы стрептококков серотипа III и серотипа V не содержат гена, кодирующего белок Spbl [56, 136]. Данные о вышеописанных белках суммированы в таблице 1.
Протекание инфекционного процесса можно условно разделить на несколько стадий. Прежде всего для развития заболевания патоген должен попасть на поверхность слизистых оболочек организма хозяина. Далее происходит его прикрепление к эпителиальным тканям, т.е. адгезия, в которой участвует белок Spbl. После чего следует колонизация, пенетрация и формирование очага воспаления. В процессах взаимодействия с иммунной системой хозяина участвуют такие белки СГВ, как Вас белок, С5а пептидаза, CspA белок и другие (Табл. 1). Процесс взаимодействия с иммунной системой организма хозяина может приводить либо к ограничению очага инфекции и возможному выздоровлению, либо к его прогрессивному расширению. В последнем случае патоген поступает в ток лимфы и крови, что ведет к генерализации инфекции, сопровождающейся развитием вторичных, метастатических очагов. При неблагоприятном течении заболевания процесс заканчивается летально. Таким образом, белки, экспрессируемые СГВ, играют важную роль в развитии инфекции после проникновения бактериальной клетки в организм человека. На каждом этапе протекания инфекционного процесса с иммунной системой организма хозяина взаимодействуют разные белки СГВ (Табл. 1). Для колонизации тканей организма хозяина важную роль играют бактериальные факторы адгезии и агрегации. Адгезины грамположительных бактерий, в том числе и стрептококков группы В, в настоящее время изучены недостаточно. Некоторые авторы условно разделяют уже известные адгезины грамположительных бактерий на две большие группы (Табл. 2) [72]. В одну группу включают белки, подобные антигену I/II Streptococcus mutans, а также ряд белков, связывающих фибронектин. К другой группе адгезинов относятся белки семейства Lral (lipoprotein receptor antigen I), являющиеся липопротеинами. Липопротеины семейства Lral впервые были идентифицированы у стрептококков ротовой полости {Streptococcus mutans). Впоследствии представители данного семейства липопротеинов были описаны и у стрептококков других групп, а также у других видов грамположительных бактерий. К липопротеинам данного семейства относят PsaA Streptococcus pneumoniae, SsaB Streptococcus sanguis, FimA Streptococcus parasanguis, SloC Streptococcus mutans, MtsA Streptococcus pyogenes, ScaA Streptococcus gordonii, EfaA Enterococcus faecalis, SitC Staphylococcus epidermidis, LpeA Listeria monocytogenes [6, 13, 35, 53, 71, 79, 99, 109, 110, 113]. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей семейства Lral липопротеинов стрептококков выявил, что все липопротеины обладают массой около 35 KDa, включают 305-310 аминокислот, а гомология между ними составляет 75-90%. Гомология аминокислотной последовательности стрептококковых липопротеинов с белком EfaA Enterococcus faecalis составляет 55-71% [99].
Липопротеины семейства Lral - компоненты вакцин против стрептококков
Основной функцией рассматриваемых нами стрептококковых липопротеинов семейства Lral, как отмечалось выше, является функция связывания ионов Мп2+ и транспорт их в клетку. Следует также отметить, что ряд стрептококковых Lral липопротеинов являются факторами адгезии и коагрегаиии. Функция адгезии была продемонстрирована для PsaA. липопротеина Streptococcus pneumoniae, FimA Streptococcus parasanguis, EfaA Enterococcus faecalis [26, 99, 119]. Эксперименты по сравнению адгезии Streptococcus pneumoniae исходного штамма и мутантного, с нарушенной экспрессией гена psaA к культуре А-549 клеток легкого показали, что адгезия мутантного по гену psaA штамма была ниже адгезии исходного штамма на 40,2% [108]. Липопротеин FimA является важным фактором вирулентности, связанным со способностью Streptococcus parasanguis вызывать эндокардиты. Было показано, что роль FimA в развитии инфекции обуславливается способностью адгезии к фибрину [26]. ScaA липопротеин Streptococcus gordonii является фактором коагрегации с Actinomyces naeslundii [6].
Таким образом, ряд липопротеинов семейства Lral стрептококков объединяет не только сходный аминокислотный состав, локализация на поверхности клетки и способность связывать ионы Мп в процессе транспорта Мп через мембрану, но и дополнительная функция адгезии и агрегации. Роль стрептококковых липопротеинов семейства Lral, как факторов вирулентности, была продемонстрирована рядом экспериментов на модельных инфекциях лабораторных животных. В подобных экспериментах использовались вирулентный штамм стрептококков и его мутант с нарушенной экспрессией липопротеина семейства Lral. Исследования показали, что инактивация гена psaA штамма D39 Streptococcus pneumoniae методом инсерционного мутагенеза приводит к существенному снижению вирулентности этого штамма для мышей при интраназалыюй и интраперитонеалыюй модели инфекции [13]. Дополнительные эксперименты выявили гиперчувствительность psaA мутантов S. pneumoniae к оксидативному стрессу, в условиях которого бактериальные клетки находятся внутри организма хозяина [138]. В модели эндокардита на крысах мутанты Streptococcus mutans по гену sloC, кодирующему липопротеин семейства Lral, проявили значительное уменьшение вирулентности по сравнению с исходным штаммом, хотя в гнотобиотической модели кариеса на крысах вирулентности исходного и мутантного штаммов были сходными [79].
Вышеперечисленные свойства липопротеинов семейства Lral определили интерес исследователей к ним как к потенциальным компонентам вакцин против стрептококков. В настоящее время показано, что ряд стрептококковых липопротеинов семейства Lral обеспечивают протективный эффект при иммунизации лабораторных животных в различных моделях стрептококковых инфекций. Так, иммунизация мышей рекомбинантным PsaA липопротеином оказывала протективный эффект на развитие летальной бактериемии, вызываемой Streptococcus pneumoniae [135]. Иммунизация липопротеином PsaA не давала такого сильного протективного эффекта против сепсиса, как, например, пневмококковый белок PspA. Несмотря на это, эксперименты по интраназальной иммунизации мышей смесью белков PsaA и PspA показали высокую протективность в модели инфекционного носительства пневмококков в носоглотке у мышей [23]. Поэтому рядом исследователей PsaA липопротеин рассматривается как важный компонент вакцин против Streptococcus pneumoniae. Большинство экспериментов по иммунизации проводится с использованием адьюванта Freund s, что недопустимо для иммунизации человека. В настоящее время разрабатываются генетические конструкции, в которых последовательность PsaA липопротеина присоединяется к последовательности, кодирующей интерлейкин-2 или интерлейкин-4, или же к двум копиям иммуностимулирующих пептидов, происходящих от интерлекина-ір [57].
Липопротеин FimA Streptococcus parasanguis также рассматривается как важный потенциальный компонент вакцин против заболеваний, вызываемых этим видом стрептококков. Было показано, что иммунизация крыс рекомбинантным FimA оказывает протективный эффект в модели инфекционного эндокардита, вызываемого штаммом Streptococcus parasanguis, из которого первоначально был клонирован ген fimA [139].
Таким образом, все вышеизложенные данные свидетельствуют о том, что липопротеиыы Lral семейства играют важную роль в формировании вирулентного фенотипа стрептококков разных групп, так как осуществляют функцию адгезии и агрегации, способствуют, выживанию патогена в условиях организма хозяина, принимая участие в гомеостазе Мп +. Поскольку эти липопротеины оказывают протективный эффект при иммунизации лабораторных животных, они рассматриваются как потенциальные компоненты противострептококковых вакцин.
Следует отметить, что у стрептококков группы В ранее был идентифицирован белок Lmb, который является липопротеином, локализованным на поверхности клетки и относится к Lral семейству липопротеинов. Данный липопротеин экспрессируется в большинстве штаммов Streptococcus agalactia [50, 128] и способен связывать ламинин. Это указывает на возможную роль данного липопротеина в колонизации и инвазии эпителия стрептококками группы В. Однако, до сих пор не ясно, участвует ли белок Lmb в адгезии СГВ на клетках эпителия, как и большинство вышеперпчисленных представителей липопротеинов семейства Lral. Отсутствуют также доказательства участия белка Lmb в транспорте металлов. Таким образом, с одной стороны белок Lmb обладает рядом характерных для всех липопротеинов Lral свойств, а с другой стороны он функционально отличен от рассматриваемых выше стрептококковых липопротеинов семейства Lral. В результате анализа научной литературы, нами было сделано предположение о том, что у стрептококков группы В существует другой липопротеин, входящий в состав ABC транспортной системы, гомологичной подобным системам других видов стрептококков. Эксперименты по генетическому клонированию и анализу данного белка приводятся в экспериментальной части настоящей работы. Интерес к идентификации и анализу гена, кодирующего липопротеин из семейства Lral у СГВ обусловлен ролью гомологичных белков других микробных видов в формировании вирулентности, а также тем фактом, что многие из липопротеинов семейства Lral рассматриваются как компоненты вакцин. Последнее обстоятельство особенно актуально в связи с увеличением случаев стрептококковых заболеваний и отсутствием в настоящее время вакцинных препаратов против СГВ с целью, как минимум, предотвратить патологии беременности и новорожденных.
Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности гена scaAB
Для определения полной нуклеотидной последовательности гена scaAB СГВ было предпринято создание библиотеки генов СГВ в фаговом векторе. Первоначально была получена библиотека генома СГВ в векторной системе на основе фага X Blue Star system (Novagen, США). Хромосомную ДНК СГВ рестрицировали ферментами Ват HI и Sau3a в режиме неполного гидролиза в течение 20 минут. После этого рестрицированную ДНК СГВ разделяли в агарозном геле методом электрофореза и вырезали из геля зону с фрагментами ДНК в диапозоне от 6 до 9 тыс. н.п. Фрагменты данного размера выделяли из агарозы и осуществляли лигирование с ВатШ фрагментами фагового вектора. Рекомбинантную фаговую ДНК упаковывали в головки фага согласно протоколу фирмы Novagen и высевали на чашки с культурой штамма реципиента Е. coli ER16. Фаговые частицы экстрагировали из агара в SM-буфер, титровали, а полученную таким образом фаговую библиотеку генома СГВ анализировали на наличие гена scaAB СГВ посредством гибридизации. Для этого делали десятикратные разведения фагов, смешивали с культурой штамма реципиента в высевали тонким слоем в 0,7% агарозе на чашки с 2% агаризованной питательной средой. Фаговые бляшки переносили на нейлоновый фильтр и анализировали методом ДНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовался меченый дигоксигенином ПЦР продукт, соответствующий центральной части гена scaAB СГВ. Из фаговых клонов, выявленных ДНК-ДНК гибридизацией выделяли ДНК, которую после рестрикции ферментами Sail и SphI переклонировали в вектор pUC19. Полученные в результате клонирования плазмиды анализировали на наличие вставки, содержащей ген scaAB методом ДНК-ДНК гибридизации с использованием зонда на исследуемый ген. Отобранная таким образом плазмида, обозначенная нами pS3, как показала гибридизация с зондом на ген scaAB, содержала часть нуклеотидной последовательности генома СГВ, включающую ген предполагаемого фактора адгезии и агрегации scaAB. Для определения нуклеотидной последовательности плазмидной вставки было предпринято секвенирование плазмиды pS3 с использованием Т7 и SP6 праймеров, соответствующих вектору pUC 19. В результате секвенирования была определена нуклеотидная последовательность (рис. 5). Анализ полученной последовательности показал, что она содержит две открытые разнонаправленные рамки считывания. Одна из рамок считывания соответствовала гену предполагаемого фактора адгезии и агрегации ScaAB. Полученный сиквенс содержал полную нуклеотидную последовательность гена scaAB, которая соответствовала последовательности 258-1184 н.п. сиквенса. Вторая открытая рамка считывания соответствовала гену, гомологичному генам регулятора транскрипции sca-оперона стрептококков других групп (ген scaR Streptococcus gordonii). Впоследствии было установлено, что полученная последовательность содержит только начало этого гена с 91 по 1 н.п. Результаты секвенирования участка ДНК СГВ, содержащего гены scaAB и scaR были депонированы в банк данных нуклеотидных последовательностей GenBank под номером AY 267033.
Таким образом, проведено клонирование и секвенирование участка ДНК СГВ, содержащего ген scaAB, кодирующий предполагаемый фактор адгезии и агрегации СГВ. Анализ полученной нуклеотиднои последовательности позволил установить расположение гена регулятора транскрипции scaR относительно гена scaAB.
Последовательность ДНК СГВ, содержащая ген scaAB и участок гена scaR, где рамкой выделены первые триплеты открытых рамок считывания. Направления транскрипции генов обозначены стрелками. Предполагаемой последовательности гена scaAB предшествуют участки сайта связывания с рибосомой (ggacca и tattaa-бокс), характерные для грамположительных бактерий. Данные последовательности выделены на рисунке жирным шрифтом. Подчеркиванием выделен стоп-кодон гена scaAB.
Анализ полученной нами ДНК последовательности по сравнению с банком данных нуклеотидных последовательностей GenBank показал наличие полноразмерного гена scaAB, гомологичного генам липопротеинов других грамположительных микроорганизмов и часть гена вероятного регулятора транскрипции scaR. ДНК последовательность оказалась на 99% идентичной известным последовательностям геномов СГВ серотипов III и V [56, 136].
На основании анализа нуклеотидной последовательности гена scaAB с использованием компьютерной программы BLAST была определена аминокислотная последовательность белка ScaAB, представленная на рисунке (рис.6). Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка ScaAB показал, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка состоит из 310 аминокислот и имеет молекулярную массу около 35 KDa. Данный белок может быть отнесен к Lral семейству липопротеинов, так как имеет с N-терминального конца последовательность LGAC, которая соответствует последовательности LxxC, являющейся сайтом отщепления сигнального пептида протеазой II. Аминокислотная последовательность LxxC характерна для всех липопротеинов Lral семейства и находится в исследуемом белке ScaAB с 17 по 20 аминокислотный остаток. Наличие данной последовательности позволяет предположить, что в стрептококковых клетках происходит процессинг белка ScaAB с отщеплением сигнального пептида и образованием зрелого белка. Данное предположение подтверждает тот факт, что предполагаемый трансмембранный домен белка ScaAB находится с 4 по 24 аминокислоту.
Изучение иммунного ответа на рекомбинантный белок ScaAB
Стрептококки группы В способны вызывать тяжелые инфекционные заболевания у новорожденных (сепсис, пневмонию, менингит) и патологию беременности. Кроме этого, СГВ являются причиной серьезных заболеваний взрослых: пиелонефрита, артрита, эндокардита, септицемии. Патология, вызываемая стрептококками группы В, представляет важную медицинскую проблему во всем мире. Хорошо известно, что вирулентность стрептококков группы В коррелирует с их способностью продуцировать типоспецифическую полисахаридную капсулу [43]. Однако, наряду с полисахаридами, СГВ продуцируют на поверхность клетки большую группу веществ белкового происхождения, роль которых в формировании вирулентности изучена недостаточно. К числу белков, участвующих в формировании вирулентности СГВ, относятся белковые факторы адгезии и агрегации. У стрептококов других групп выделяют липопротеины, относящиеся к семейству Lral и являющиеся факторами адгезии и агрегации [72].
Представленное исследование имело целью исследовать стрептококки группы В на предмет выявления в их геноме гена scaAB и изучения свойств кодируемого им белка, участвующего в процессах адгезии и агрегации и гомологичного липопротеинам Lral стрептококков других групп. В связи с этим был поставлен ряд задач, включающих в себя идентификацию и клонирование гена scaAB СГВ, кодирующего липопротеин из данного семейства, получение изогенных мутантов СГВ по гену scaAB, выделение и очистку рекомбинантного белка ScaAB, изучение иммуногенности и протективных свойств данного белка.
Исследования проводились с использованием современных методов молекулярной микробиологии, генетики и иммунохимии. В работе были применены разнообразные генетические методы: клонирование и секвенирование, полимеразная цепная реакция, гибридизационный анализ, инсерционный мутагенез. Кроме того, использовались методы хроматографической очистки белков и методы иммуноферментного анализа.
С целью идентификации и клонирования гена scaAB был использован штамм 78/471 серотипа Пс. ДНК этого штамма была выделена и использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Праймеры были сконструированы в результате анализа консервативных участков нуклеотидных последовательностей генов липопротеинов семейства Lral стрептококков других групп. В результате ПЦР был амплифицирован участок гена scaAB СГВ размером 300 п.н., который оказался на 74-90% гомологичен центральным участкам генов липопротеинов Lral стрептококков других групп. Для определения полной нуклеотидной последовательности гена scaAB была получена библиотека генома СГВ в векторной системе на основе фага X Blue Star. В результате анализа полученной библиотеки методом ПЦР с использованием праймеров на центральную часть гена scaAB и методом ДНК-ДНК гибридизации был обнаружен рекомбинантный клон, содержащий фрагмент хромосомной ДНК СГВ размером 1287 п.н. Результаты секвенирования показали, что данный фрагмент хромосомной ДНК содержал полноразмерный ген scaAB и фрагмент гена scaR, кодирующий предполагаемый регулятор транскрипции данного гена. Полученная нуклеотидная последовательность была депонирована в банк данных GenBank под номером AY 267033. Таким образом, проведено клонирование и секвенирование участка ДНК СГВ, содержащего ген scaAB, кодирующий предполагаемый фактор адгезии и агрегации СГВ. Анализ нуклеотидной последовательности позволил установить расположение и ориентацию гена регулятора транскрипции scaR относительно гена scaAB.
Компьютерный анализ полной нуклеотидной последовательности гена scaAB позволил определить аминокислотную последовательность предполагаемого фактора адгезии и агрегации ScaAB. Анализ аминокислотной последовательности белка показал, что полноразмерный белок ScaAB состоит из 310 аминокислот и имеет молекулярную массу около 35 KDa. В N-терминальном конце белка обнаружена последовательность LGAC, которая соответствует последовательности LxxC, являющейся сайтом отщепления сигнального пептида белков семейства Lral протеазой II. Данная аминокислотная последовательность LxxC характерна для всех липопротеинов семейства Lral и находится в исследуемом белке ScaAB с 17 по 20 аминокислотный остаток. Таким образом, белок ScaAB может быть отнесен к Lral семейству липопротеинов,
Для определения степени гомологии белка ScaAB с липопротеинами семейства Lral стрептококков других групп был проведен сравнительный анализ их аминокислотных последовательностей. В результате было показано, что белок ScaAB на 75,5 % гомологичен белку SsaB S. sanguis, на 74% - FimA S. parasanguis и PsaA S. pneumoniae, на 73% - ScbA S. crista и ScaA S. gordonii, на 57% - белку EfaA Enterococcus faecalis. Сравнительный анализ выявил также идентичное расположение аминокислотных остатков, формирующих Мп2+-связывающий центр. Полученные данные позволяют утверждать, что ген scaAB СГВ кодирует липопротеин семейства Lral, гомологичный липопротеинам — факторам адгезии и агрегации стрептококков других групп.
С целью выяснения возможного участия белка ScaAB СГВ в процессах адгезии и агрегации были проведены эксперименты по инактивации гена scaAB посредством инсерционного мутагенеза. Для инактивации гена scaAB была сконструирована плазмида на основе несущего ген устойчивости к эритромицину вектора, не реплицирующегося в стрептококках. Конструкция содержала центральный участок гена scaAB размером 300 п.н. Данная плазмида использовалась для трансформации клеток штамма 58/59 стрептококков группы В методом электропорации. Отобранные по признаку устойчивости к эритромицину клоны СГВ имели инсерцию плазмиды в области гена scaAB. Полученные таким образом ScaAB" мутанты обладали способностью образовывать крупные, до 50 клеток, агрегаты. При этом индекс адгезии мутантных клеток к клеткам вагинального эпителия уменьшался по сравнению с индексом адгезии исходного штамма. Результаты экспериментов по инсерционному мутагенезу позволяют предположить, что белок ScaAB задействован в процессах прикрепления стрептококков к клеткам слизистого эпителия хозяина. Поскольку адгезия микроорганизма на клетках эпителия является первым этапом колонизации организма, нам представляется правильным рассматривать новый белок, обнаруженный у СГВ, в качестве потенциального фактора вирулентности.
