Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания, этиологически связанные с патогенными стрептококками и энтерококками, представляют в настоящее время одну из серьезных медицинских, социальных и экономических проблем здравоохранения. Стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека Патогенные стрептококки, такие как S. pyogenes, S. agalacliae и 5. pneumoniae, ассоциированы с тяжелыми формами острых и хронических инфекций. В то же время стрептококки других видов и энтерококки, персистирующие у лиц с нммунодефицитами, нередко являются причиной позокомиальных инфекций (Schouten М.А et al., 1999; ShankarN.L.etal.,2001).
Несмотря на высокую природную чувствительность стрептококков к антибиотикам некоторых классов, в ряде случаев антимикробная терапия ими может быть ограничена аллергическими проявлениями и развитием тяжелых форм дисбиозов Кроме того, в последние десятилетия неуклонно растет распространенность антибиотикоустойчивых штаммов (Bass J \V. et al, 1991; Yang J.H. et al., 1996, Traub W.H. et al, 1997). Указанные проблемы диктуют необходимость не только рационального применения антибиотиков, но и сочетания их с безвредными средствами, обладающими антибактериальным и противовоспалительным действием Использование с лечебно-профилактической целью пробиотических молочнокислых бактерий (лактобацилл и энтерококков) является одним из перспективных направлений подобного решения проблемы оздоровления населения. Пробиотические препараты на основе живых лактобацилл и энтерококков относятся к числу наиболее употребляемых вследствие их высокой антагонистической активности в отношении пагогенной микрофлоры.
Пробиотики чаще используют для лечении и профилактики заболеваний, связанных с различными формами нарушения качественного и количественною состава нормальной микрофлоры желудочно-кишечного и урогенитального трактов. В связи с эгим антагонистическая активность молочнокислых бактерий изучена в большей степени в отношении микроорганизмов, ассоциированных с дчсбиотическими состояниями. В то же время данные об антибактериальном действии пробиотических молочнокислых бактерий в отношении патогенных стрептококков и энтерококков встречаются редко и, как правило, представляют собой сообщения об активности метаболитов лактобактерий в отношении отдельных штаммов стрептококков и энтерококков (Ross K.F. et al., 1993; Upton М.А. et al., 2001; Tagg J.R. et al., 2003). Кроме того, эти исследования носят качественный характер, так как доза антагониста, ингибирующая рост индикаторных
энтерококков, не определялась. Таким образом, антимикробное действие пробиотических молочнокислых бактерий в отношении стрептококков и энтерококков остается недостаточно изученным. Это составляет определенную проблему, так как широкое применение лечебно-профилактических средств на основе живых молочнокислых бактерий требует четкого обоснования использования определенных доз препаратов в терапевтических и профилактических целях.
Анализ антимикробной активности пробиотических препаратов затруднен отсутствием единых стандартных подходов, которые могли бы быть использованы для оценки и сравнения антагонистического действия различных штаммов молочнокислых бактерий в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Известно, что антагонизм лактобацилл и энтерококков обусловлен продукцией метаболитов (органических кислот, перекиси водорода, лизоцима и др.) и бактериоцинов (Доронин А.Ф. и др., 2002). Однако механизмы регуляции их синтеза, а также влияние на жизнеспособность и морфофункциональные свойства стрептококков и энтерококков остаются недостаточно освещенными.
Приведенные данные свидетельствует о высокой актуальности исследований, касающихся особенностей антимикробного действия пробиотических штаммов, разработки методов изучения ингибирующей активности лактобактерий и создания условий для максимального проявления активности пробиотиков в отношении возбудителей инфекций человека, в том числе обусловленных патогенными стрептококками и энтерококками.
Цель исследования - изучить особенности антагонистического действия пробиотических штаммов лактобацилл и энтерококков в отношении патогенных стрептококков.
Задачи исследований:
-
Изучить антагонистическую активность живых культур пробиотических молочнокислых бактерий (лактобацилл и энтерококков) в отношении штаммов стрептококков различных серологических групп и энтерококков, выделенных от больных с различными формами инфекции.
-
Оценить ингибирующее влияние супернатантов культур пробиотических молочнокислых бактерий на рост индикаторных штаммов стрептококков и энтерококков.
-
Изучить факторы микробного антагонизма пробиотических молочнокислых бактерий, используя молекулярно-генетические и биохимические методы.
-
Подобрать условия, способствующие повышению антагонистической активности пробиотических штаммов в системе in vitro.
Научная новизна
Впервые предложен метод, позволяющий качественно и количественно оценивать антагонизм молочнокислых бактерий против патогенных стрептококков. Изучено антимикробное действие пробиотиков в отношении 50 штаммов стрептококков и энтерококков, установлены штаммовые, а в случае стрептококков и групповые, отличия по чувствительности к антагонистическому влиянию лактобацилл и энтерококков. В штамме Enierococcus faecium L3 впервые показана экспрессия генов, кодирующих синтез бактериоцинов (энтероцинов А и В), а также факторов регулирующих их синтез. На примере бактериоциногенного штамма Е. faecium L3 продемонстрировано, что добавление в питательную среду искусственно синтезированных специфичного пептида-индуктора, повышающего уровень экспрессии бактериоцинов, а также его аналогов, приводит к значительному увеличению ингибирующей активности пробиотика.
Практическая значимость работы
Исследования, проведенные на 5 пробиотических препаратах («Лактобактерин», «Витафлор», «Бифиформ», «Ламинолакт», «Линекс») с набором индикаторных культур стрептококков, показали, что данные препараты существенно различаются по силе и спектру антимикробного действия, что свидетельствует о необходимости индивидуального подбора пробиотических препаратов в лечебно-профилактических целях. Метод двухслойного агара может быть рекомендован для изучения антагонистических свойств пробиотиков. Продемонстрированный на примере штамма Е. faecium L3 феномен индукции синтеза бактериоцинов может быть использован при разработке новых высокоэффективных пробиотических препаратов, включающих не только живые бактерии-антагонисты, но и специфические индукторы продукции бактериоцинов.
Основные положення, выносимые на защиту:
-
Штаммы стрептококков различных серологических групп и энтерококков обладают индивидуальной чувствительностью к антагонистическому действию пробиотических молочнокислых бактерий.
-
Низкомолекулярные пептидные фракции, выделенные из супернатанта Е. faecium L3, способны подавлять рост патогенных стрептококков.
-
Штамм Е. faecium L3 содержит гены трехкомпонентной сигнальной системы, ответственной за синтез бактериоцинов, с которыми связана антимикробная активность данного штамма.
-
Искусственно синтезированные пептиды-индукторы и их гомологи повышают антимикробную активность бактериоциногенных штаммов молочнокислых бактерий.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе двух статей в изданиях, рекомендованных ВАК России. Материалы исследований доложены и обсуждены на многих отечественных и международных научных совещаниях («XVI международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд», Палм Ков, Австралия, 2005; заседании Научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Санкт-Петербург, Россия, 2006; международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты*, Санкт-Петербург, Россия, 2007, IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Россия, 2007; 10-м Юбилейном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2008», Санкт-Петербург, Россия, 2008; международной конференции «Probiotics for the 3 Millennium», Высокие Татры, Словакия, 2008; «XVII международном симпозігуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд», Порто Хели, Греция, 2008).
Личный вклад диссертанта
Основная часть исследований выполнена лично автором. Ряд микробиологических экспериментов проведен совместно с к.м.н. Ермоленко Е.И. (ГУ НИИЭМ РАМН) и к.в.н. Марцинковской И.В. (СП6ТАВМ). Выделение антимикробных пептидов из супернатанта энтерококков выполнялось при консультации сотрудников Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИЭМ РАМН к.б.н. Берлова М.Н., к.б.н. Алешиной Г.М., к.б.н. Цветковой Е.А. Электронная микроскопия ультраструктуры стрептококков выполнена д б.н., проф. Рыбальченко О.В. (ФГУП ГНИЙ ОЧБ ФМБА, СПб). Пептиды-индукторы синтезированы к.х.н. Колобовым А.А. (ФГУП ГНИЙ ОЧБ ФМБА, СПб)
Структура и объем диссертации
