Введение к работе
Актуальность проблемы. Стрептококковые инфекции относятся к числу одних из наиболее распространенных заболеваний в мире. Наибольшее значение в патологии человеха имеют Р-гемолитические стрептококки группы Л (Streptococcus pyogenes), вызывающие целый спектр разнообразных клинических проявлений таких как ангину, скарлатину, фарингит, хронический тонзиллит, а также негнойные постстрептококковые заболевания (вторичные формы стрептококковой инфекции), как ревматическая лихорадка, ревматические поражения сердца, рожистые воспаления, гломерулонефрит, хорея и другие.
Составляя значительный удельный вес в структуре инфекционной
патологии человека, эта нозоологическая форма наносит большой социально-
экономический ущерб и является одной из причин аллергиэации и инвалидизации
людей, как правило, еще трудоспособного возраста. При этом широкое
распространение первичных и вторичных форм стрептококковых инфекций
происходит на фоне принципиальной возможности лечения и профилактики
заболеваний, обусловленной неспособностью S. pyogenes вырабатывать
устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда. Учитывая многообразие
клинических проявлений стрептококковой инфекции (от бессимптомного
носительства до выраженных клинических форм) и в силу ненадежности
только клинического диагноза, все чаще возникает необходимость широкого применения различных методов лабораторной диагностики, и особенно экспрессного иммуноанализа, как основного современного диагностического "инструмента". В 1983 году Всемирная организация здравоохранения приняла резолюцию о развитии системы экспресс-диагностики стрептококка группы А (СГА) и в настоящее время во многих зарубежных странах существует широкий спектр коммерческих тест-систем, в том числе и для экспресс-диагностики СГА, которые активно используются в практике. К сожалению, практическое отсутствие в нашей стране достаточного количества и разнообразия подобных отечественных тест-систем, а также слабое развитие материально-технической Сократит*, в тексти АПСХ группоспецяфическия А полисахарид: АПСХ-БСА -группоспецифнческиП А полисахарид коныогмроваиныи с бычьим сывороточным альбумином; БСА - бычий сывороточный альбумин; СГА - стрептококк группы А; ФСБТ - фосфатно-солевой буфер содержащий 0.05% Твин-20; N-АГА-ПАА - N-auenm-D-rraoKoiaMini коіп.югироааіпп>гй с полиякрішамидом.
лабораторной базы, делают невозможным своевременную диагностику, особенно в периферическом звене здравоохранения в малооснащенных лабораториях и полевых условиях, как того требуют мероприятия, направленные на предотвращение эпидемического процесса.
Цель и задачи работы. Целью данной работы являлись разработка
основных компонентов и конструирование на их основе отечественных
иммуноаналитических систем анализа (инструментальных и безин-
струментальных) для первичного определения стрептококка группы А и антител к нему.
В ходе работы решались следующие задачи:
-
Отработка технологии выделения группоспецифического полисахарида из культур клеток стрептококка группы А. Синтезирование на его основе антигенного препарата с улучшенными сорбционными свойствами и аффинного сорбента для выделения и очистки специфических антител. Исследование возможность использования в иммуноанализе химически синтезированного антигена, содержащего группоспецифическую детерминанту.
-
Исследование возможности использования в экспресс-диагностических целях литического комплекса из Streptomyces levoris 96 для экстракции группоспецифического антигена
-
Синтезирование на основе выделенных и очищенных поликлональных антител коньюгатов с ферментными и неферментными метками, сравнение эффективности выделенных антител и синтезированных коньюгатов с импортными аналогами для оценки возможности их применения в конструировании высокоэффективных отечественных тест-систем.
-
Конструирование на основе полученных реагентов инструментальных и безинструментальных моделей тест-систем для идентификации стрептококка группы А на основе определения группоспецифического полисахарида.
-
Конструирование на основе полученных реагентов инструментальных и безинструментальных моделей тест-систем для определения антител к группоспецифическому полисахариду.
-
Оценка возможность применения сконструированных систем в клинико-диагностической практике
Научная новизна. Впервые отработана методика эффективного
кратковременного лизиса стрептококковых клеток с использованием
ферментативного комплекса, выделенного из Streptomyces levoris, что
позволило использовать его в создании тест-систем для диагностики СГА с тампонов от больных.
Впервые синтезирован коньюгат группоспецифических антител к СГА с частицами коллоидного углерода, что позволило разработать варианты экспрессных и безопасных иммуноаналитических систем для определения стрептококка группы А и антител к нему, не требующих какого-либо инструментального обеспечения. Отработаны методики получения высокоаффинных антител и коньгогатов на их основе из отечественных компонентов, не уступающие по эффективности зарубежным аналогам.
Сконструированы модели тест-систем для определения антител к СГА в инструментальном (плашечном) варианте с использованием природного группоспецифического полисахарида или искусственного антигена, состоящего из группоспецифической детерминанты N-ацетилглкжоэамина на инертном носителе.
Сконструированы модели тест-систем для определения антител к СГА в безинструментальном экспрессном варианте с использованием природного группоспецифического полисахарида или искусственного антигена, состоящего из группоспецифической детерминанты N-ацетилглюкозамина на инертном носителе в качестве твердофазных реагентов и суспензоидного коньюгата в качестве детектирующего агента.
Сконструированы модели тест-систем для определения
группоспецифического полисахарида СГА в инструментальном (плашечном) варианте с использованием нового способа лизиса стрептококковых клеток.
Сконструированы модели тест-систем для определения
группоспецифического полисахарида СГА в безинструментальном экспрессном варианте с использованием нового способа лизиса стрептококковых клеток и суспензоидного коньюгата в качестве детектирующего агента.
Сконструированные модели тест-систем продемонстрировали высокую чувствительность и специфичность, соответствующую требованиям практического здравоохранения.
Практическая значимость:
- Разработанный метод эффективного лизиса стрептококковых клеток позволяет упростить и ускорить определение группоспецифического полисахарида с тампонов от больных.
- Отработанные методики получения антител и коньюгатов на их основе из
отечественных компонентов позволяют разработать ряд тест-систем для
инструментального и безинструментального определения стрептококка группы А
и антител к нему.
Разработанные варианты инструментального определения группоспецифнческого полисахарида и антител к нему позволяют повысить эффективность анализов.
Разработанные варианты безинструментальной идентификации группоспецифнческого полисахарида и антител к нему позволяют проводить быстрые и эффективные определения в условиях малооснащенных лабораторий и полевых условиях.
По материалам работы получен Патент Российской Федерации N 5018297 "Способ экстракции группоспецифнческого антигена для экспресс-диагностики стрептококковой инфекции" от 01.07.1992 г
По результатам работы начата подготовка документации для регистрации и сертифицирования в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича иммуноферментной тест-системы для определения антител к стрептококку группы А для лабораторного применения.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на XII и XIII Международных Симпозиумах по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Санкт-Петербург 1993, Париж 1996), на Российско-Германской выставке "Достижения российской биотехнологии" (Берлин 1996) и на IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста (без списка литературы) и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результатов и заключения, выводов. Список литературы включает 156 наименований: 28 на русском и 128 на иностранном языках. Текст иллюстрирован 3 таблицами и 26 рисунками.
