Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Литературный обзор 8
2.1. Трансмиссивные плазмиды 8
2.2. Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий 10
2.2.1. Три типа систем рестрикции-модификации 12
2.2.2. Системы рестрикции-модификации 1-го типа 15
2.2.2.1. Субъединица узнавания. 18
2.2.2.2. Субъединица модификации 24
2.2.2.3. Модифицирующий фермент 25
2.2.2.4. Субъединица рестрикции 26
2.2.2.5. Комплекс рестрикции-модификации 1-го типа 2S
2.2.3. Системы бактерий, гидролизующие специфически модифицированную ДНК 37
2.3. Системы антирестрикции 37
2.3.1. Антирестрикционная активность бактериофагов 38
2.3.2. Антирестрикциоиные системы, кодируемые трансмиссивными плазмидами 40
3. Материалы и методы 47
3.1. Штаммы E.coli, использованные в работе 47
3.2. Плазмиды и бактериофаги, использованные в работе 48
3.З. Среды для выращивания бактерий и фагов 48
3.3.1. Жидкие среды 48
3.3.2. Твердые среды 49
3.4. Антибиотики, растворы солей и реактивов 50
3.5. Выращивание культур бактерий 51
3.6. Выращивание бактериофагов 51
3.7. Высев бактерий и бактериофагов. Опыты по изучению эффективности рестрикции 52
3.7.1. Высев бактерий 52
3.7.2. Высев бактериофагов , 52
3.7.3. Опыты по изучению эффективности рестрикции 52
3.8. Методы работы с плазмидной ДНК 53
3.8.1, Выделение ДНК малых плазмид для аналитических опытов 53
3.8.2. Очистка плазмид в равновесном градиенте плотпости CsCl 54
3.8.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 55
3.8.4. Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля 55
3.8.5. Рестрищионный анализ плазмид 56
3.8.6. Протокол клонирования фрагментов ДНК в вектор 57
3.9. Получение однотяжевых ДНК-матриц.. 58
3. 10. Фосфорилировапие синтетических олигонуклеотидов 59
3.11. Сайт-направленный мутагенез 59
3.12. Определение нуклеотидиой последовательности ДНК 62
3.12.1.Проведение реакций секвенирования 62
3.12.2.Приготовление сиквепсных гелей. Сиквепсный электрофорез 63
3.13. Получение делеций с помощью Bal 31 нуклеазы 63
3.14. Полимеразная цепная реакция 64
3.15. Мечение фрагмента ДНК при помощи реакции ПЦР 66
3.16. Идентификация белков в системе экспрессии на основе Т7 РНК полимеразы 66
3.17. Идентификация белков в системе экспрессии на основе Т7 РНК полимеразы с включением S-Met.. 67
3.18. Фракционирование клеточных белков 68
3.19. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 68
3.19.1. Подготовка образцов для анализа 68
3.19.2.Проведение электрофореза. 68
3.20. Замедление подвижности ДНК в геле 69
3.21. Измерение промоторной активности с использованием системы вектора рКК232-8 70
3.22. Очистка белков при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA колонке 71
3.23. Связывание белков in vitro 71
3.24. Определение агрегатного состояния белка ArdA, с использованием метода гель-фильтрации 72
3.25. Ингибирование рестрикции немодифицировашюй ДНК pBR322 in vitro 73
4. Результаты и их обсуждение 74
4.1. Картирование области белка ArdA, существенной для его функционирования с помощью тонкого делеционного анализа 74
4.2. Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования 80
4.3. Изучение взаимодействия [ SJ-меченных белка ArdA и EcoKI метилтрансферазы ш vitro 87
4.4. Определение агрегатного состояния белка ArdA в растворе 92
4.5. Белок ArdA блокирует способность R-M системы 1-го типа связываться со специфической немодифицироваипой ДНК 92 IV.6. Белок ArdA способен ингибировать ЕсоКІ-рестрикцию немодифицированной ДНК/и vitro , 95
4.7. Белок ArdA более эффективно иигибирует рестрикционную, чем модификационную активность EcoKJ-системы in vivo 99
Выводы 104
- Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий
- Системы антирестрикции
- Методы работы с плазмидной ДНК
- Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям, в природе между различными, в том числе и филогенетически отдаленными, группами бактерий и даже таксономическими царствами (бактерии и дрожжи, бактерии и растения) постоянно осуществляется (посредством природных векторов - трансмиссивных плазмид) фундаментальный биологический процесс - обмен генетической информацией, который может оказать существенное воздействие на геном бактериальной клетки. Часто эти трансмиссивные плазмиды, а следовательно и объемы, кодируемой ими информации, сравнимы по размеру с бактериальной хромосомой, что позволяет классифицировать их как дополнительные мини-хромосомы клетки. С другой стороны, нередко такие плазмиды могут функционировать как эффективные доноры или, наоборот, акцепторы важных генетических факторов (вирулентности, резистентности к антибиотикам и др.), которые способны обмениваться между геномами плазмид и бактерий с помощью специальных рекомбинационных механизмов. В этой связи большую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение механизмов, контролирующих эти потоки генетической информации и способных тем самым играть важную роль в регуляции скорости и эффективности прохождения процессов адаптации и, возможно, эволюции бактерий. Один из таких уже известных регуляторных механизмов может осуществляться посредством систем рестрикции-модификации. Эти системы распознают “чужую” ДНК по специфическому метилированию, играющему роль своеобразного молекулярного паспорта”, а их активность ассоциируются в настоящее время с природным механизмом “иммиграционного контроля”, который, по-видимому, осуществляет контроль потока генов между различными популяциями бактерий и способствует определенной генетической изоляции между отдаленными микроорганизмами. Тем не менее, известно, что многие большие трансмиссивные плазмиды способны с высокой эффективностью осуществлять перенос своей ДНК между бактериями с различными системами рестрикции-модификации 1-го типа. Этот феномен связан с тем, что трансмиссивные плазмиды кодируют антирестрикционные белки, названные Ard (alleviation of restriction of DNA) белками. Показано, что белки Ard способны эффективно ингибировать активность системы рестрикции-модификации 1-го типа (Belogurov and Delver, 1995; Murray et al., 2002; Wilkins, 2002). В настоящее время известны три типа Ard белков (ArdA, ArdB и ArdC), которые классифицированы на основании сходства их аминокислотных последовательностей и кодируются плазмидами IncI, IncFV, IncN и IncW групп (Belogurov et al. 2000; Wilkins, 2002). Кроме того, в результате определения полных нуклеотидных последовательностей различных бактериальных геномов в настоящее время обнаружено целое семейство (около 50) ArdA-подобных белков, которые, по-видимому, широко распространены среди бактерий и плазмид и наряду с системами рестрикции-модификации 1-го типа играют важную роль в процессах регуляции обмена генетическим материалом между бактериальными клетками. Настоящая работа посвящена мутационному анализу антирестрикционного белка ArdA, кодируемого трансмиссивной плазмидой ColIb-P9 группы IncI, и изучению механизма его действия на системы рестрикции-модификации 1-го типа.
Цель и задачи работы. Цель данной работы являлось изучение механизма действия белка ArdA на системы рестрикции-модификации 1-го типа и идентификация его аминокислотных остатков, которые существенны для его активности. В соответствии с этим в ходе исследования были поставлены следующие задачи:
-
Картировать участки белка ArdA, существенные для его функционирования.
-
Идентифицировать аминокислотные остатки белка ArdA, которые существенны для его активности.
-
Изучить действие белка ArdA на активность системы рестрикции-модификации 1-го типа in vitro.
Научная новизна результатов. В данной работе показано, что в основе антирестрикционного действия белка ArdA лежит его способность блокировать взаимодействие комплекса рестрикции-модификации 1-го типа EcoKI со специфической немодифицированной ДНК. Идентифицирован участок антирестрикционного белка ArdA, содержащий аминокислотный остаток Phe164, который, по-видимому, играет ключевую роль в функционировании белка ArdA. Показано, что кодируемый трансмиссивными плазмидами белок ArdA значительно более эффективно ингибирует рестрикционную, чем модификационную активность системы рестрикции-модификации 1-го типа клетки-хозяина. Предполагается, что это свойство белка ArdA может иметь важное значение для успешной адаптации немодифицированной ДНК трансмиссивной плазмиды, входящей в новую бактериальную клетку.
Практическая ценность работы. Данная работа позволяет прояснить механизмы регуляции обмена генами между различными бактериями, осуществляемого в природе при помощи трансмиссивных плазмид. Полученные результаты важны для понимания путей и способов распространения генов вирулентности и резистентности к антибиотикам среди бактерий, что имеет важное значение для медицины и медицинской генетики.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: “Biocatalysis-2002” (Москва, 2002), “Ломоносов-2004” (Москва, 2004), “Biocatalysis-2005” (С.-Петербург-Кижи-Валаам, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисных сообщения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 141 ссылку. Работа изложена на 115 страницах, содержит 27 рисунков и 9 таблиц.
Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий
Феномен рестрикции-модификации был открыт Бертани (Beertrani) и Вейгл (Weigle) более сорока лет назад в опытах с бактериофагами Р2 и X [27]. Они обнаружили, что эффективность роста бактериофагов, выращенных на штаммах Е. coli С и К-12, сильно отличалась при высеве фагов на штамм Е. coli К-12, но не на штамм Е. coli С. Молекулярно-биологическое объяснение этому удивительному эффекту было дано позднее в опытах Арбером (Arber) с сотрудниками [28, 29]. Было показано, что ДНК фагов, выращенных на бактериях Е. coli С, разрушается в клетках Е. coli К-12 посредством особой эндонуклеазы, узнающей специфические сайты в ДНК и деградирующей ДНК, если эти сайты специфически немодифицированы. В клетках Е. coli К-12 присутствует также модифицирующая активность, которая защищает свою ДНК от действия эндонуклеазы, в то время как в клетках Е. coli С обе активности (рестрикция и модификация) отсутствуют (рис. 2). Системы рестрикции-модификации довольно широко распространены среди бактерий и подразделяются в настоящее время на три больших класса в соответствии с их сложностью, требуемыми кофакторами, сайтом узнавания и положением места разрыва ДНК по отношению к сайту узнавания [30]. Основные характеристики этих систем приведены на (рис. 3) и в (табл.1). Системы второго типа наиболее просты и состоят из двух отдельных ферментов, эндонуклеазы и метилтрансферазы. Эндонуклеаза второго типа представляет собой симметричный гомодимер, такая димеризация облегчает осуществление согласованного разрыва ДНК по двум нитям. Эндонуклеаза требует для своей рестрикционной активности только один кофактор Mg + и осуществляют только одну ферментативную реакцию: эндонуклеазный разрыв ДНК в строго определенном месте в сайте узнавания, представляющем собой симметричную последовательность, палиндром (например, GATC). Модификационпые метилазы представляют собой, как правило, мономеры и катализируют перенос метальных групп от S-адеіюзилметионина (SAM) в специфическую позицию сайта узнавания. В результате метилирования образуется либо М6-метиладенозин, либо 5-метилцитозин в зависимости от типа системы. Характерной особенностью систем рестрикции-модификации 2-го типа является то, что все известные в настоящее время системы этого типа кодируются плазмидами, то есть внехромосомной ДНК, и широко используются в генной инженерии [31]. Системы 3-го типа представляют собой ферменты следующей по сложности категории, состоят из двух субъединиц и требуют для своей рестрикционной активности кроме Mg2+ еще и АТР, присутствие SAM стимулирует эту реакцию.
Однако, в этих условиях фермент способен действовать как модификационная метилаза, в результате чего рсстрикциопная и модификационпая активности конкурируют за SAM. Было установлено, что системы рестрикции модификации 3-го типа могут осуществлять транслокацию ДНК. Разрыв ДНК стимулируется столкновением комплексов и вносится на не большом расстоянии от сайта узнавания [32]. Две наиболее изученные системы 3-го типа EcoPl и ЕсоР15, узнают несимметричные последовательности AGACC и CAGCAG, соответственно, и вносят двухтяжевый разрыв в ДНК примерно через 25 п.н. от сайта узнавания с образованием коротких 5 -избыточностей. Поразительной чертой этих систем является свойство модифицировать сайт узнавания только по одной из нитей дуплекса ДНК. Отсутствие модификации во второй нити дуплекса неизбежно повлечет за собой при последующей репликации ДНК образование модифицированного сайта узнавания, который в свою очередь является субстратом рестрикционной активности и, следовательно, может привести клетку к летальным последствиям. Было показано, что необходимым требованием системы ЕсоР15 для рестрикции ДНК является наличие полностью пемодифицированных сайтов узнавания CAGCAG, расположенных в обратной ориентации и на различных расстояниях друг от друга [33]. Это открытие дает понимание, каким образом бактериальной клетке, содержащей гены системы рестрикции-модификации 3-го типа, удается уберечь свою ДНК от летального действия рестриктаз. Системы рестрикции-модификации 1-го типа являются мультифункциональными ферментами, которые способны катализировать как реакцию рестрикции, так и реакцию модификации ДНК. S-Аденозилметионші (SAM) является кофактором и донором метильной группы для метилтрапсферазпой активности системы рестрикции-модификации 1-го типа. Для нуклеазной активности системы рестрикции-модификации 1-го типа требуется АТР, SAM и Mg +. Сайт узнавания комплекса системы рестрикции-модификации 1-го типа представляет собой асимметричную последовательность, состоящую из двух компонентов (первый длиной 3 или 4 п.и., второй длиной 4 или 5 п.н.), разделенных неспецифичной последовательностью длиной 6 или 8 п.н. Все известные ферменты этого типа метилируют адепиновые остатки на противоположных нитях каждого компонента сайта узнавания. Комплекс рестрикции модификации 1-го типа присоединяется к сайту узнавания и если сайт полностью не метилирован, то фермент начинает протягивать через себя ДНК с образованием шпильки - этап траислокации, при этом используется энергия гидролиза АТР. Установлено, что именно встреча двух комплексов рестрикции-модификации в процессе транслокации ДНК может индуцировать образование рсстрикционного разрыва [34]. Фермент системы рестрикции модификации 1-го типа состоит из трех субъединиц, кодируемых тремя связанными генами: ksdR, hsdM и hsdS, Для систем рестрикции-модификации 1-го типа характерна транскрипция генов, кодирующих субъединицы узнавания и модификации, в составе одного оперона, в то время как ген, кодирующий субъединицу рестрикции, транскрибируется отдельно (рис. 3). Две субъединицы, кодируемые генами hsdM и hsdS, HsdM и HsdS (часто называемые М и S) необходимы и достаточны для метилтранферазной активности, третья субъединица рестрикции R, кодируемая геном hsdR, требуется для рестрикции ДНК. Субъединица узнавания S содержит два сайт-специфических домена узнавания TRD (target recognition domens), ответственные как за рестрикционную, так и за модификационную активности комплекса. Субъединица метилирования М содержит сайт связывания с SAM и сайт для метилирования ДНК. Субъединица рестрикции R содержит активный сайт для гидролиза АТР и другие последовательности, необходимые для транслокации ДНК и эндонуклеазной активности. В бактериях активны два комплекса: первый комплекс влючает в себя три субъедшшцы (R2M2S]) и является системой рестрикции модификации 1-го типа и второй комплекс, у которого отсутствует субъединица рестрикции R (МгЭОэ обладающий только метилтранферазной активностью [35].
Отдельный промотор, с которого осуществляется транскрипция гена hsdR, подразумевает регуляцию рестрикционной активности, но никаких экспериментальных данных, подтверждающих регуляцию на уровне транскрипции для систем рестрикции модификации 1-го типа, найдено не было [36]. В штамме Е. coli К-12 гены, определяющие систему EcoKI, фланкированы генами, которые кодируют метил-зависимые рестрикционные эндонуклеазы (Міг и МсгВС). Сегмент генома, который кодирует эти три эндонуклеазы, был назван областью иммиграционного контроля (immigration control region) [37]. Фундаментальное значение в анализе систем рестрикции - модификации 1-го типа внесло открытие, что ферменты существуют как тесно связанные члены различных семейств. Штаммы Е. соІіК-\2,Е. coli В, S. enterica typhimuriwn LT2 и potsdam несут аллели, определяющие системы рестрикции -модификации 1-го типа с различными специфичностями. Соответствующие ферменты EcoKI, EcoBI, StyLTIII и StySPI отличаются друг от друга либо одним, либо двумя сайт-специфическими доменами узнавания (TRD) [38]. Было показано, что эти ферменты можно рассматривать, как члены одного семейства с взаимозаменяемыми субъединицами. Напротив, штамм Е, coli 15Т" кодирует отличный от данного семейства фермент системы рестрикции-модификации 1-го типа EcoAl [39]. Первоначально эти результаты были получены из гибридизационного скрининга бактериальных ДНК и серологического анализа бактериальных экстрактов. Как и ожидалось, пуклеотидпые последовательности генов hsd для EcoKI и EcoBI гибридизуются друг с другом и антитела против EcoKI реагируют с EcoBI. В противоположность этому пробы ДНК, содержащие EcoKI гены, не гибридизуются с пробами ДНК Е.соІІ 15Т, также как антитела против фермента EcoKI не реагируют с EcoAI. В настоящее время системы рестрикции-модификации 1-го типа разделены па четыре семейства: IA, 1В, 1С, ID (табл.2).
Системы антирестрикции
В отличие от выше рассмотренных систем рестрикции-модификации 1-го, 2-го и 3-го типов, которые гидролизуют немодифицированную ДНК, эти бактериальные системы узнают и деградируют специфически модифицированную ДНК. Системы получили название MCR (modified-citosine restriction) ввиду того, что узнают и рестрицируют ДНК, специфически метилированную по цитозину. В настоящее время известны, по крайней мере, три Мег системы МсгА, МсгВС и McrF(Mrr), которые активны на ДНК, содержащей 5-метилцитозин (все три системы), 5-гидроксиметилцитозин (МсгА и МсгВС) и N4-метилцитозин (МсгВС) [102]. Мишенью для МсгА системы является неглюкозилированная ДНК Т-четных фагов, содержащая 5-гидроксиметил цитозин (ГМЦ), а также ДНК, модифицированная НраІІ метилазой с образованием последовательностей Cme CGG [ЮЗ]. Система МсгВС, по-видимому, обладает меньшей специфичностью и узнает метилированный цитозин в последовательности GmeC [102]. Высокая активность обеих Мег систем по отношению к ДНК четных фагов, содержащей ГМЦ, позволила идентифицировать эти системы в генетических экспериментах много лет назад. Относительно системы McrF(Mrr) известно, что она активна на ДНК, модифицированной SssI метилазой, метилирующей цитозин в последовательности CG [104]. Важно отметить, что ДНК растений и млекопитающих очень часто довольно сильно метилирована по цитозину в сайтах CG, что сильно затрудняет ее клонирование в бактериях, экспрессирующих Мег системы. Поэтому в таких опытах стараются использовать штаммы Е. coli, дефектные по всем известным системам рестрикции, включая Мег системы [105]. Н.Э. Системы антирестрикцин. В настоящее время известно несколько способов, с помощью которых ДНК плазмид и бактериофагов способна защититься от действия рестриктаз при вхождении в новую бактериальную клетку. Бактериофаги имеют большие возможности преодоления межклеточных рестрикционных барьеров, так как используют бактериальную клетку лишь для размножения с последующим лизисом клетки, а не для совместного сосуществования (исключение составляют умеренные фаги в форме профагов). Широко распространенный среди вирулентных фагов способ избежать действия клеточных рестриктаз -специфическая модификация фаговой ДНК, определяющая устойчивость ДНК к рестриктазам. Например, Т-четные бактериофаги глюкоз ил ируют цитозины в своей ДНК, в результате чего ДНК становится устойчивой к действию систем МсгА и МсгВС [106].
Значительной модификации (примерно 15%) подвергается ДНК бактериофага Ми; продукт фагового гена тот модифицирует адениловые остатки (адеиин превращается в ацетамидоаденин) в последовательностях типа 5 ...(CG)-A-(GC)-N-Py...3 , что также делает ДНК устойчивой к рестриктазам [107]. В больших количествах белок Мот леталеп для клеток. Поэтому регуляция активности гена тот носит строгий характер. Транскрипция гена тот активируется с помощью фагового белка С при условии дополнительного метилирования адеииновых остатков Оаш-метилазой в трех GATC-сайтах, расположены в районе промотора, иначе с этим участком ДНК связывается клеточный белок-репрессор OxyR. Кроме того, для нормальной трансляции необходимо присутствие второго фагового белка Com, который, связываясь с мРНК в области инициации трансляции, разрушает формирование шпильки, ингибирующей трансляцию [108]. Иначе действует умеренный бактериофаг \. Продукт фагового гена ral обладает способностью значительно ускорять процесс специфического метилирования полностью неметилированной ДНК [70]. Фермент рестрикции-модификации 1-го типа ЕсоК практически не способен метилировать ДНК, обе нити которой неметилированы; реакция метилирования происходит, но крайне медленно (часы вместо секунд). Продукт гена га/ связывается с ферментом ЕсоК и резко ускоряет процесс специфического метилирования. В результате ДНК фага в клетке сравнительно быстро превращается в "свою", которую рестриктаза ЕсоК не деградирует. Ral действует на членов семейства IA, но не действует на семейство IB, для которого модификация неметилированной ДНК происходит эффективно [70]. Ген типа ral найден также в дефектных профагах Rac, где он получил название lar [109]. Обычно ген lar не активен, но при введении в геном . coli мутации sbcA (регуляторная область перед lar) в клетке синтезируется значительное количество белка Lar, что приводит к ослаблению активности рестриктазы ЕсоК. Интересный метод борьбы с клеточными рестриктазами 1-го типа выработал бактериофаг ТЗ. Ген sam фага ТЗ отвечает за синтез SAM-гидролазы [ПО]. В результате действия этого фермента в клетке значительно уменьшается концентрация SAM -субстрата модификации и необходимого кофактора рестриктаз типа 1-го, а следовательно, снижается и активность клеточных рестриктаз. Необходимо отметить, что некоторые вирулентные фаги способны преодолевать межклеточные рестрикционные барьеры с помощью белков-ингибиторов рестриктаз. В настоящее время известны три фаговых белка-ингибитора клеточных рестриктаз: Осг (0.3), кодирующий ген 0.3 бактериофага Т7; DarA, продукт гена darA бактериофага Р1; белок Агп, продукт гена am бактериофага Т4. Белок Осг (0.3) специфически ингибирует рестриктазы 1-го типа и является небольшим, кислым белков (117 аминокислотных остатков, суммарный заряд -28). Сравнительно недавно в работе [111] при помощи рентгеноструктуриого анализа было установлено, что белок Осг (димер) мимикрирует структуру двух фрагментов по 6 п,о. В-формы ДНК, разделенных сегментом ДНК, содержащим изгиб. Распределение отрицательных зарядов на поверхности белка совпадает распределением зарядов фосфатного остова ДНК. При помощи атомного силового микроскопа было показано, что изгиб в структуре белка Осг совпадает с изгибом, индуцируемым в ДНК системой рестрикции-модификации 1-го типа.
Также было показано, что Осг ингибирует действие представителей всех четырех семейств систем рестрикции-модификации 1-го типа независимо от их сайта узнавания, путем мимикрирования структуры ДНК. Белок Осг вытесняет ДНК из R-M комплекса 1-го типа путем прямой конкуренции за сайт связывания на ферменте. Сходен по фенотипическому проявлению, но отнюдь не по молекулярным параметрам, с белком Осг (0,3) белок DarA бактериофага Р1 (фаг Р1 широко используется при генетическом картировании как фактор общей трансдукции) [112]. DarA также ингибирует лишь рестриктазы 1-го типа и относится к группе кислых белков (суммарный заряд -35), но он значительно больше размером (639 аминокислотных остатков) и негомологичеи белку Осг(0.3). Белок DarA входит в состав фаговой частицы и вместе с ДНК попадает в клетку при инфицировании, так что защиту модифицированной ДНК он осуществляет сразу после инъекции ДНК, В геноме Т-четных бактериофагов содержится ген агп, который кодирует белок Агп - ингибитор рестриктазы МсгВС [ИЗ]. Как упоминалось выше, глюкозидированная ДНК этих фагов устойчива к действию любых рестриктаз. Однако неглгокозилированная ДНК мутантных бактериофагов Т4 glu де градируется различными рестриктазами и, в частности, рестриктазой МсгВС, которая расщепляет ДНК по специфическим участкам, содержащим метилированный по положению 5 цитозин. Так как ДНК Т4 содержит вместо цитозина 5-гидроксиметилцитозин, то естественно, что у мутантных фагов Т4 glu ДНК расщепляется клеточной рестриктазой МсгВС. Продукт гена агп ингибирует рестриктазу МсгВС и тем самым защищает ДНК от клеточных ферментов этого типа. Механизм подобной защиты выработан у Т-четных фагов, по-видимому, в связи с задержкой глюкозшшровапия, так как гидроксиметилирование цитозина происходит раньше. Am -небольшой, кислый белок (92 аминокислотных остатка, суммарный заряд -10) также негомологичен другим ингибиторам рестриктаз. П.3.2. Антирестрикционные системы, кодируемые трансмиссивными плазмидами. Все рассмотренные выше примеры аптирестрикциошшх систем кодируются бактериофагами.
Методы работы с плазмидной ДНК
ДНК рекомбинантных плазмид размером до 20 т.п.н. выделяли в соответствии с модифицированной методикой щелочного лизиса Бирнбойма и Доли [129, 130]. 1) Культуры бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивали в течение ночи на качалке при +37 С в 4 - 5 мл LB среды, содержащей соответствующий антибиотик. 2) Утром клетки из 3 мл бактериальной культуры собирали центрифугированием (центрифуга Eppendorf 5415, 7000 об/мин, 5 мин) и осадок промывали 0,5 мл буферного раствора TSS (25 мМ трис-НС1 рН 8,0; 50мМ сахароза). Супериатант тщательно отсасывали при помощи водоструйного насоса и замораживали осадки клеток при -70 С по крайней мере на 20 минут. Начиная с этого момента, все этапы (за исключением центрифугирования) делали во льду 3) Каждый осадок ресуспендировали при помощи семплера в 0,2 мл холодного раствора TSS, содержащего 5 мг/мл лизоцима. Инкубировали 5 минут во льду, после чего добавляли ЭДТА до 10 мМ и инкубировали еще 5 минут. 4) Добавляли 0,4 мл лизирующего раствора (0,2 М NaOH, 1% додецилсульфат натрия) и перемешивали содержимое пробирок, плавно переворачивая 10 раз. Инкубировали 5 минут во льду. 5) Добавляли 0,3 мл раствора ацетатного буфера (ацетат калия ЗМ, рН доведен до значения 4,8 уксусной кислотой) и аккуратно перемешивали, как в случае добавления щелочи. Инкубировали 1 час во льду. 6) Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут. Аккуратно, стараясь не задеть мощный осадок, отбирали 0,75 мл супернатанта и переносили в чистые пробирки. Добавляли 0,45 мл изопропилового спирта, перемешивали и инкубировали 1 час во льду. 7) Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут. Спиртовой супериатант выбрасывали, а осадок подсушивали, подержав пробирки открытыми на столе в течение 10 минут, после чего принудительно растворяли в 0,1 мл буферного раствора ТЕ (10 мМ трис-НС1рН7,6;1мМЕДТА). 8) К раствору плазмидной ДНК в ТЕ добавляли 0,1 мл 5 М раствора ацетата калия (готовиться разведением насыщенного раствора ацетата калия в два раза) и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут. 9) Супернатант переносили в чистые пробирки, добавляли 0,5 мл этанола и инкубировали 1 час во льду. 10) Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Образовавшийся осадок промывали 1 мл холодного 80 % этанола и подсушивали, подержав пробирки открытыми на столе в течение 10-15 минут. Затем осадок принудительно растворяли в 0,1 мл буферного раствора ТЕ, содержащего РНКазу А в концентрации 10 мкг/мл. Инкубировали пробы при +42 С в течение 1 часа.
Полученные препараты хранили в холодильнике при температуре -20 С. Ш.8.2. Очистка плазм ид в равновесном градиенте плотности CsCI. В опытах по очистке плазмидной ДНК в равновесном градиенте плотности CsCI использовали следующее оборудование: центрифуга Beckman L5-50B Ultracentrifugc; бакетный ротор Beckman SW50,1, рассчитанный на 6 центрифужных пробирок; центрифужные пробирки для этого ротора Beckman Polyallomer Centrifuge Tubes 1/2x2 in. (13х15мм) объемом около 5,2 мл. Для очистки в одну пробирку вносили 0,1-0,5 мг плазмидной ДНК. Добавляли 0,4 мл раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. При помощи насыщенного раствора CsCI (плотность р=1,923 г/см3 при температуре +25С) доводили плотность раствора в центрифужной пробирке до значения 1,59 г/см . Затем, используя раствор CsCI с плотностью 1,59 г/смЗ, уравновешивали все 6 центрифужных пробирок на весах. Центрифугировали пробирки при 35000 об/мин при +22С в течение 48 часов. После такого центрифугирования полоса плазмидной ДНК была хорошо заметна в середине пробирки при облучении УФ с длиной волны 366 им. Фракцию, содержащую плазмидпую полосу, отбирали, прокалывая стенку пробирки иглой, надетой на шприц объемом 1 мл. Из шприца раствор плазмидной ДНК переносили в пробирку типа Eppendorf на 1,5 мл. Для экстракции бромистого этидия использовали бутаиол-1, насыщенный водным раствором 5М NaCI; 10 мМ трис-НС1; 1 мМ ЭДТА; рН 8,0. К раствору ДНК добавляли равный объем бутанола-1 и перемешивали на вортексе. После кратковременного центрифугирования верхнюю органическую фазу выбрасывали, а к водной фазе добавляли новую порцию бутанола-1. После того, как органическая фаза при экстракции переставала окрашиваться, повторяли процедуру еще три раза. Затем водную фазу разбавляли в три раза дистиллированной водой и высаживали ДНК из раствора равным объемом изопропилового спирта. Препарат ДНК, полученный после растворения осадка в ТЕ буфере, обрабатывали смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), после чего обрабатывали смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и высаживали ДНК этанолом в присутствии ацетата калия и осадок растворяли в воде. Для определения концентрации очищенной плазмидной ДНК использовали однолучевой программируемый спектрофотометр Pharmacia Biotech Ultrospec 3000 и кварцевые кюветы объемом 0,4 мл и длиной оптического пути 1см. Небольшую аликвоту раствора плазмидной ДНК разводили в 200 раз в 50мМ трис-НС1 буфере рН 7,6, переносили в кювету и прописывали спектр поглощения раствора в интервале длин волн от 220 до 320 им. Концентрацию ДНК определяли из величины поглощения при 260 нм, считая, что поглощением 1 О.Е. в данных условиях обладает раствор двухцепочечиой ДНК с концентрацией 50мкг/мл.
Препараты плазмид с известной концентрацией хранили в холодильнике при -20 С. III.8.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле [131[. В наших опытах мы использовали подводный ("субмариновский") вариант электрофореза. Источником постоянного напряжения служил прибор BioRad Power Supply Model 250/2.5. В опытах использовали 0,8 % агарозу при напряженности электрического поля 3 В/см. Однократный буфер для электрофореза содержал: 40 мМ трис-ацетат; 2 мМ ЭДТА; рН 8,0; 0,5 мкг/мл бромистого зтидия. Образцы ДНК вносили в лупки агарозного геля в составе однократного загрузочного раствора (5% глицерин, 10 мМ ЭДТА, краситель Ponceaus S "Rcanal"). Фотографирование результатов электрофореза осуществляли при помощи стационарной УФ-системы и фотокамеры Kodak ED AS 290 (длина волны возбуждающего света 254 нм). Ш.8.4. Электроэлгоция фрагментов ДНК из агарозного гели (131]. Известно, что эффективность процедур клонирования заметно увеличивается с использованием очистки и выделения рестрикционпых фрагментов при помощи электрофореза в агарозном геле. В этих целях препарат ДНК плазмиды (2-8 мкг), обработанный соответствующими рестриктазами, вносили в составе загрузочного раствора в лунку агарозного геля. После примерно двух часов электрофореза, когда достигалось разделение фрагментов ДНК, гель помещали под лампу, излучающую длинноволновый УФ-свет (366 им), который не вносит повреждений в ДНК, но делает ее видимой благодаря флуоресценции интеркалировавшего в нее бромистого этидия. Кусочки агарозного геля, содержащие интересующие нас фрагменты ДНК, вырезали скальпелем и помещали в самодельную ячейку для электроэлюции. Электроэлюцшо проводили в тех же условиях, что и электрофорез (см, выше пункт Ш-8.3), После электроэлюции буфер, в который перешли из кусочка агарозы интересующие нас фрагменты ДНК, переносили из ячейки в пробирку типа Eppendorf, Затем раствор ДНК концентрировали, используя в качестве отбирающего воду агента бутанол-1. После того, как объем раствора достигал значения 50-100 мкл, ДНК высаживали этанолом в присутствии ацетата калия. Осадок промывали холодным 80 % этиловым спиртом. ДНК растворяли в воде и использовали для реакции лигировапия.
Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования
Вышеприведенный делеционный анализ показал, что С-конец белка ArdA может быть существенен для его активности. Для подтверждения этой гипотезы каждая из пар VF и RR при помощи сайт-направленного мутагенеза была заменена на два аланина (АА). В отличие от замен RI65A+R166A, двойная мутация V163A+F164A полностью подавляет антирестрикционную активность белка ArdA, Очевидно, что аминокислотный остаток F164 играет основную роль в этой паре, так как в отличие от одиночной замены V163A, мутация FI64A сильно подавляет ArdA активность (рис.19). Отметим также, что замена этого ключевого аминокислотного остатка FI64 на V умеренно снижает антирестрикционную активность белка ArdA. Эти результаты позволяют предположить, что высокая гидрофобность F164 может играть существенную роль при взаимодействии белка ArdA и системы рестрикции-модификации (R-M) 1-го типа. Это предположение подкрепляется наблюдением, что активность белка ArdA толерантна к мутациям остатка F164 при его замене на гидрофобные или ароматические аминокислотные остатки и возрастает в ряду V, I, L, W и Y (рис.19). Так как эта пара гидрофобных аминокислотных остатков V163 и F164 существенна для антирестрикционной активности белка ArdA и консервативна среди 17 членов семейства ArdA белков, представленных на рис. 20, мы назвали этот участок VF-мотивом. Роль других аминокислотных остатков, расположенных на С-конце ArdA {D160, G161.H162, R165 и R166) не так существенна для антирестрикционной функции, так как их аланиновые замены слабо влияют на активность белка ArdA (рис.19). Мы также провели аланиновые замены каждого из пяти аминокислотных остатков региона 91-YRLWV-95, примыкающего к N-концевой границе мини-ArdA. Было показано, что из пяти мутаций только одна Y91A существенно влияет на ArdA активность (рис, 19). Можно предположить, что ароматические аминокислотные остатки могут играть важную роль во взаимодействии между ArdA и R-M системы 1-го типа. Поэтому в следующей серии опытов мы изучили эффект аланиновых замен всех ароматических аминокислотных остатков, локализованных в мини-ArdA области. Анализ этой серии аланиновых мутаций (13 ароматических аминокислотных остатков) показал, что только две мутации Y141A и особенно F142A в значительной степени подавляют антирестрикционную активность белка ArdA (табл. 6). Возможно, что эффект этих мутаций связал с тем, что эти два ароматических аминокислотных остатка Y141 и F142 входят в состав "аитирестрикционпого" мотива, который как было показано ранее [1], консервативен для всех известных плазмидных аптирестрикционных белков Ard и аитирестрикционного белка Осг бактериофага Т7 и, по-видимому, может играть определенную роль во взаимодействии между антирестрикционными белками и R-M системами 1-го типа.
Белок ArdA, подобно антирестрикционному белку Осг, обладает избытком отрицательно заряженных аминокислотных остатков, и некоторые из них могут быть значимы для антирестрикциошюй активности, поэтому в следующей серии экспериментов мы изучили эффект аланиновых замен шести отрицательно заряженных аминокислотных остатков (DI27, DI33, Е136, D143, D150, D154, D160), расположенных на С-копцс и в "аптирестрикционном" мотиве области мини-ArdA. Данные, приведенные на рис. 19 и в табл. 7, показывают, что аланиновые и валиновые замены этих отрицательно заряженных аминокислотных остатков не вызывают значительного ослабления антирестрикциошюй активности белка ArdA. Так как в консервативных позициях аитирестрикционного мотива белка ArdA присутствуют сходные по физико-химическим свойствам гидрофобные аминокислотные остатки L130, L131, V138 (рис. 20) и их аланиновые замены не привели к существенному ослаблению ArdA активности (табл. 7), то можно ожидать, что скорее всего к заметным последствиям для функционирования белка ArdA могут привести только "сильные" замены, когда исходная аминокислота заменяется аминокислотой из другой физико-химической группы. Поэтому в следующей серии опытов мы заменили гидрофобные остатки в консервативных позициях на отрицательно заряженный остаток глутаминовой кислоты. И было показано, что две замены L131E, V138E приводят к существенному снижению функциональной активности белка ArdA (табл.7). Эти наблюдения являются дополнительным свидетельством того, что консервативный "антирестрикциопный" мотив белка ArdA действительно значим для его функционирования. Таким образом, мутационный анализ белка ArdA обнаружил, что аитирестрикцнонная активность зависит, как минимум, от четырех ароматических аминокислотных остатков Y9I, Y141, F142 и F164, которые консервативны для ArdA белков (рис. 20) и расположены в мини-ArdA области. Однако заметное изменение подвижности мутантных ArdA белков Y91A, Y141A и F142A на электрофорезе в денатурирующих условиях в присутствии SDS и низкая растворимость мутантного белка Y91A по сравнению с нативным белком ArdA и его мутантом F164A может быть, по крайней мере, частично связано с влиянием этих трех замен (Y91A, Y141A и F142A) на фолдинг белка ArdA (рис.21).
Похожие диссертации на Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия
