Содержание к диссертации
Введение
1 Рибонуклеаза sa, родственные ферменты и их ингибиторы 7
1.1. Принципы классификации нуклеаз 7
1.2. Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз 7
1.3. Структура и свойства РНКазы Sa и подобных ей РНКаз 9
1.3.1. Структура и механизм действия РНКазы Sa 10
1.3.2. Каталитические свойства РНКазы Sa и ее гомологов 12
1.3.3. Термостабильность РНКазы Sa, ее гомологов и мутантов 17
1.4. Влияние остатков активного центра на стабильность белка 21
1.5. Ингибиторы рибонуклеаз 24
1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы РНКаз 24
1.5.2. Белковые ингибиторы РНКаз 27
1.5.2.1. Барстар 27
1.5.2.2. Цитоплазматический ингибитор рибонуклеаз животного происхождения 29
1.6. Цитотоксичность РНКаз 31
1.6.1. Токсическое действие РНКазы на клетку 32
1.6.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности РНКаз 34
2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Объекты и материалы 39
2.1.1. Бактериальные рибонуклеази 39
2.1.2. Барстар А и его мутанты 42
2.1.3. Получение З'-Ы-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфата 43
2.1.4. Использованные реагенты 45
2.2. Методы исследований 45
2.2.1. Измерение каталитических параметров реакций гидролиза субстратов РНКазами 45
2.2.2. Определение жизнеспособности клеток в присутствии РНКазы 46
2.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК) 47
2.2.4. Круговой Дихроизм (КД) 49
2.2.5. Измерение констант связывания 50
2.2.6. Определение концентраций 50
З. Результаты и обсуждение 51
3.1. Структурно-функциональный анализ активного центра РНКазы Sa 51
3.1.1. Роль остатков GIn38 и GIu41 в связывании субстрата 54
3.1.2. Функциональная роль остатков Glu54, Arg65, His85 и Glu74 56
3.1.3. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее активность 60
3.2. Конструирование ингибиторов РНКазы Sa и родственных ферментов 65
3.2.1. Ингибирование РНКаз металлохелатами 65
3.2.2. Ингибирование активностей РНКазы Sa и биназы З'-М-гидроксиуреидо-З'-дезокситнмидин 5'-фосфатом в присутствии цинка(Н) 67
3.2.3. Ингибирование активности Glu54Gln мутанта РНКазы Sa З'-М-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфатом в присутствии цинка(П) 72
3.3. Изучение вклада остатков активного центра РНКазы Sa в конформационную стабильность фермента 76
3.4. Цитотоксические свойства РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с измененным зарядом 82
3.4.1. Изменение общего заряда молекулы с отрицательного на положительный делает РНКазу Sa цитотоксичиой 83
3.4.2. Роль активируемых кальцием калиевых (Кса) каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами 87
3.4.3. Положительный заряд является основной детерминантой цитотоксичности микробных РНКаз 90
Выводы 92
- Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз
- Ингибиторы рибонуклеаз
- Методы исследований
- Конструирование ингибиторов РНКазы Sa и родственных ферментов
Введение к работе
Рибонуклеазы (РНКазы) являются традиционными объектами исследования молекулярной биологии, поскольку они участвуют в ключевых процессах реализации генетической информации и представляют собой важнейшие ферменты клеточного метаболизма [1-5]. Биологические функции РНКаз заключаются в трансформации РНК от первичных генных транскриптов до функциональных компонентов трансляционной системы, продукции малых регуляторных РНК и деградации определенных типов РНК. В настоящее время большое внимание уделяется функциям РНКаз, связанным с регуляцией экспрессии генов, ростом и дифференцировкой клеток, защитой от патогенов, индукцией апоптоза. Эти ферменты находят широкое применение в генной инженерии, биохимии и медицине. Кроме того, они являются удобными объектами для изучения механизмов реализации высокой специфичности ферментов. Поэтому изучение молекулярного механизма действия РНКаз представляет собой важную задачу не только для энзимологии ферментов нуклеинового обмена, но и для понимания процессов клеточной регуляции.
В последние годы вырос интерес к созданию эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКаз как потенциальных противораковых средств, подавляющих активность ангиогенина, а также как противоаллергических препаратов, ингибирующих активность РНКаз эозинофилов человека [6]. Потребность в эффективных ингибиторах РНКаз связана и с необходимостью блокирования активности примесных РНКаз при биохимических работах с РНК-содержащими препаратами. Понимание молекулярного механизма действия этих ферментов и изучение структуры их активных центров важно для создания эффективных ингибиторов РНКаз.
Было обнаружено, что некоторые РНКазы семейства РНКазы А токсичны для клеток млекопитающих, особенно для опухолевых клеток [7-9]. В ряде случаев они избирательно атакуют злокачественные клетки, запуская апоптозную реакцию, и поэтому могут рассматриваться как альтернатива классическим химиотерапевтическим препаратам. Так, РНКаза из ооцитов лягушки Rana pipiens, онконаза, в настоящее время проходит клинические испытания для лечения мезотелиомы легких. Бактериальные РНКазы составляют важное семейство РНКаз, некоторые представители которого также обладают цитотоксическими свойствами. Одним из важных факторов цитотоксичности микробных РНКаз по отношению к клеткам млекопитающих является их невосприимчивость к действию цитоплазматического ингибитора РНКаз, присутствующего практически во всех тканях человека и блокирующего каталитическую активность экзогенных РНКаз животного происхождения. Несмотря на большой интерес исследователей к цитотоксичным РНКазам, факторы, определяющие их цитотоксичность, до сих пор недостаточно изучены.
Настоящая работа посвящена установлению молекулярного механизма действия и определению цитотоксических свойств РНКазы Sa из Sireptomyces aureofaciens. Выбор этого фермента обусловлен тем, что РНКаза Sa является одним из наименьших ферментов, состоящим из 96 аминокислотных остатков. Ее пространственная структура хорошо изучена как в кристалле, с разрешением 1 А [10], так и в растворе методом ЯМР [И], а небольшой размер молекулы позволяет в значительной степени варьировать свойства белка внесением минимальных изменении в его последовательность. Поэтому РНКаза Sa представляет собою удобную модель как для изучения взаимоотношений между белковой структурой и функцией, определяющих эффективность действия фермента, так и для исследования факторов, влияющих на конформационную стабильность белков в растворе.
В задачи работы входило: 1) определение функциональной роли остатков активного центра РНКазы Sa и их вкладов в каталитическую активность фермента; конструирование эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКазы Sa; изучение влияния замен остатков активного центра РНКазы Sa на конформационную стабильность фермента; 4) исследование цитотоксических свойств РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом, оценка влияния отдельных клеточных компонент на цитотоксические эффекты, проявляемые РНКазами.
Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз
Циклизующие РНКазы являются эндонуклеазами. Они проявляют более или менее выраженную специфичность к природе нуклеозидов, примыкающих к расщепляемой фосфод и эфирной связи. Схема реакции гидролиза РНК циклизующими РНКазами представлена па рис, 1. На первой стадии в результате трансэтерификации происходит расщепление РНК на два олигонуклеотида. Один из них несет на З -конце 2 ,3 -циклофосфат, а второй на 5 -конце ОН-группу. На следующей стадии циклофосфат гидролизуется до З -фосфата [12]. Первая стадия обычно протекает значительно быстрее, чем последующий гидролиз циклофосфата. РНКазы проявляют большую или меньшую специфичность к природе гетероциклического основания, находящегося на З -конце гидролизуемой фосфодиэфирпой связи. По этому признаку они подразделяются на пиримидинспецифичные (КФ 3.1.4.22), гуанилспецифичные (КФ 3.1.4.8), неспецифичные РНКазы (КФ 3.1.4.23) и т.п. Первым широко изучавшимся представителем циклизующих РНКаз является бычья панкреатическая РНКазаА [13]. Механизм каталитического действия РНКазы А был предложен Матиасом, Рабиным и соавт, [14, 15]. На основании исследования рН- зависимостей кинетических параметров реакций гидролиза низкомолекулярных субстратов было предположено, что реакция катализируется по механизму кислотно-основного катализа с участием двух остатков гистидина (рис. 1). На стадии циклизации один из них (His 12) играет роль общего основного катализатора, акцептируя протон 2 -ОН группы, а второй (His 119) -роль общей кислоты, протонируя 5 -0 атом уходящего нуклеотида. На стадии гидролиза циклофосфата роли остатков гистидина меняются: Hisll9 активирует атаку воды по механизму общего основного катализа, а НІ5І2 выступает в роли общего кислотного катализатора, протонирующего уходящую группу. Нуклеофилыюе замещение у атома фосфора в реакции этого типа протекает как реакция присоединения-отщепления, в которой образуется промежуточное состояние с пентакоординированным атомом фосфора. Реакция протекает по механизму "in line", т.е. атакующий нуклеофил присоединяется к атому фосфора со стороны, противоположной по отношению к уходящей группе.
В настоящее время общепринято, что этот механизм реализуется для всех циклизующих РНКаз (рис. 1). В случае РНКазы А в роли акцептора протона ОН-группы рибозы выступает имидазольное кольцо остатка Hisl2 [17], для РНКазы Ті (из Aspergillus oryzae) - карбоксильная группа остатка GIu58 [18], для барназы (РНКазы из Bacillus amyioUquefaciens) - карбоксильная группа остатка Glu73 [19]. В качестве донора протона для уходящей 5 -0-группы в случае РНКазы А выступает положительно заряженное кольцо остатка His И 9, для РНКазы Ті - остатка His92, для барназы -остатка His РНКаза Sa была первой внеклеточной рибонуклеазой, выделенной из ростовой среды микроорганизма Sireptomyces aureofaciens, штачм ВМК [20]. Этот фермент содержит 96 аминокислотных остатков, одну дисульфиднуго связь и не содержит остатков метионина, лизина или триптофана. РНКаза Sa из стрептомицетов относится к подсемейству микробных РНКаз семейства Ті [21]. Позже были выделены два изозима РНКазы Sa из других штаммов Streptomyces aureofaciens\ РНКаза Sa2 (штамм R8/26) и РНКаза Sa3 (штамм ССМ 3239). Эти три РНКазы обладают примерно 50% гомологией первичной структуры. Первичные структуры РНКаз Sa, Sa2 и Sa3, а также наиболее близких их гомологов, барназы и биназы (РНКазы из Bacillus intermedins), показаны на рис. 2. Содержание РНКаз Sa, Sa2 и Sa3 в природном источнике низкое. Поэтому, для получения достаточных количеств РНКаз Sa было разработано получение рекомбинантных форм этих ферментов [22, 23], Из-за токсичности РНКаз по отношению к клеткам хозяина, Е. coli, успешная гетерологическая экспрессия была достигнута только при совместной экспрессии генов РНКаз Sa с геном, кодирующим их ингибитор. В качестве него был использован белковый шігибитор барназы, барстар, Барстар ингибирует ферментативную активность РНКаз Sa, стерически блокируя их активные центры [24]. Константы диссоциации комплексов РНКаз Sa, Sa2 и Sa3 с барстаром равны 2x10" ,4x10" и 2x10" М, соответственно. Для сравнения, значение константы диссоциации комплекса барназа-барстар составляет 10"НМ[22]. Кристаллическая структура нативного фермента была определена первоначально с разрешением 1,8 А [25], затем с разрешением 1,2 А [26], а недавно с разрешением 1,0 А [10], В настоящее время структура фермента определена также в растворе методом ЯМР [11]. Гомология первичной структуры РНКазы Sa с первичными структурами РНКазы Sa2, Sa3, биназы и барназы составляет 56%, 69%, 24% и 23%, соответственно (рис. 2). Различия в пространственном расположении полипептидных цепей РНКазы Sa и Sa3 наблюдаются только в областях N- и С-концов, причем они не превышают 5 А и 2 А, соответственно [27].
Сравнение пространственных структур молекул биназы и РНКазы Sa также показало значительное сходство (рис. 3). Структура активного центра обеих РНКаз практически одинакова (рис. 4). Участок, ответственный за специфическое связывание РНКазой Sa гуапи нового основания нуклеотидов, включает отрезок полипептидной цепи между остатками 37 и 40 и боковую цепь остатка GIu41. Конформация полипептидгюй цепи в этом участке РНКазы Sa и биназы практически одинакова (рис, 4). Сравнение активных центров гуанилспецифичных РНКаз дает хорошее соответствие не только для остатков, вовлеченных в узнавание нуклеотида, но также и для боковых цепей каталитических остатков, структурно гомологичных аминокислотным остаткам Glu54, Arg69 и His85 РНКазы Sa. По аналогии с РНКазой Ті инвариантный остаток Glu54 в РНКазе Sa может играть роль акцептора протона 2 -ОН-группы рибозы (в РНКазе Т[ остаток GIu58), тогда как остаток His85 может служить донором протона для уходящей 5 -0-группы (в РНКазе Ті инвариантный остаток His92). Аналогичная схема реализуется и для биназы, в которой каталитическими остатками являются остатки Glu72 и HislOl [28, 29]. РНКаза Sa является гуанилспецифичной рибонуклеазой. Гуаниловые РНКазы — это РНКазы, которые расщепляют фосфодиэфирные связи на ОЗ -конце гуанозиновых нуклеозидов РНК с образованием олигонуклеотидов с гуанозин-2 ,3 -циклофосфатом на 3 -конце и гидроксильной группой на 5 -конце. Гуанозин-2 ,3 -циклофосфат гидролизуется гуаниловыми РНКазами с образованием гуанозин-З -фосфата. Поэтому в качестве субстратов для изучения и сравнения свойств таких РНКаз используются гуанозин-2 ,3 -циклофосфат, GpN динуклеозид фосфаты (где N - A,G,C или U) и синтетические полирибонуклеотиды poly(I), poly(A), poly(U) и poly(C). Ро1у{1) используется в качестве субстрата вместо poIy(G) который сильно агрегирует в растворах. Poly(A), poly(U) и poly(C) являются плохими субстратами для гуаниловых РНКаз. Они используются для определения степени гуаниловой специфичности этих ферментов. Каталитические свойства РНКазы Sa были изучены в сравнении с каталитическими свойствами других гуаниловых РНКаз из микроскопических грибов, РНКаз Tu Pbi из РетсіШит brevicompactmn и Thi из Trihoderma harzianum [ЗО]. Параметры реакции гидролиза гуанозин-2 ,3 -циклофосфата для этих четырех РНКаз близки между собой (табл. 1).
Ингибиторы рибонуклеаз
Традиционно конструирование ингибиторов рибонуклеаз было связано с нейтрализацией их активности при биохимических работах с РНК-содержащими препаратами. Использование для этих целей белкового цитоплазматического ингибитора (RI) ограничено с одной стороны его ингибирующим действием только в отношении РНКаз панкреатического типа, принадлежащих к семейству РНКазы А. С другой стороны, даже в этом случае его использование часто малоэффективно из-за необратимой денатурации ингибитора в условиях эксперимента, В последнее время интерес к созданию эффективных небелковых ингибиторов усилился в связи с потенциальной возможностью их использования в терапии онкогенных заболеваний. Было обнаружено, что одна из рибонуклеаз семейства РНКазы А (ангиогенин) является индуктором образования кровеносных сосудов в тканях человека. Мутанты ангиогенипа с исчезающе малой рибонуклеазной активностью не проявляют ангиогенезных свойств [55]. И наоборот, мутанты аигиогепина с более высокой рибонуклеазной активностью показали себя более эффективными индукторами образования кровеносных сосудов [55]. Ангиогенезис является необходимым фактором развития раковых опухолей. Поэтому ингибирование РНКазной активности ангиогенина вокруг раковой опухоли может стать эффективным способом подавления ее развития. Похожая ситуация имеет место с РНКазами эознофилов человека. Нейротоксин из эозинофилов (РНКаза 2) и катионный белок эозинофилов (РНКаза 3) являются пиримидинспецифичными РНКазами со сравнительно малой РНК-гидролизующей активностью [56]. Они являются цитотоксичными агентами, провоцирующими аллергическую реакцию организма. Их мутанты с элиминированной РНКазной активностью теряют эту способность [57]. Поэтому ингибиторы рибонуклеазной активности указанных РНКаз эозинофилов могут быть эффективными противоаллергическими препаратами [6]. Взаимодействие бычьей паЕпсреатической РНКазы А с низкомолекулярными ингибиторами, в том числе с моно- и олигонуклеотидами, широко изучалось различными кинетическими и физическими методами. К настоящему времени имеется более двух десятков молекулярных структур комплексов РНКаз с низкомолекулярными ингибиторами, полученных методами рентгеноструктурного анализа в кристалле и Л MP в растворе [58], В табл. б представлены значения констант ингибирования панкреатической РНКазы А рядом ее нуклеотидных ингибиторов, а также орто- и пирофосфатом [б]. Наиболее эффективным ингибитором в группе моно-, ди- и олигонуклеотидфосфатов является тимидин-3 ,5 -дифосфат (рТ-З -р) с константой ингибирования около 1 мкМ.
В начале 1970-х годов было изучено ингибирование РНКазы А уридином в присутствии ионов оксида четырех- и пятивалентного ванадия [59]. Комплексы уридина с указанными окислами ванадия, связанными по цисдиольной группировке, являются структурными аналогами переходного состояния субстрата уридин 2 ,У-циклофосфата. Исходя из этого, предположили, что они должны иметь высокое сродство к РНКазе А. Измеренные значения КІ в случае РНКазы А оказались равными ШмкМ и 12 мкМ для четырех- и пятивалентного ванадия, соответственно. Позже эти данные были уточнены и значение К; для РНКазы А комплексами уридин ванадата составило 0,45 мкМ [60]. Комплексы нуклеозидов с окисью четырехвалентного ванадия широко использовались как ингибиторы РНКаз панкреатического типа. Однако, ванадат не всегда пригоден в качестве ингибитора РНКазы, поскольку является ингибитором также и большого числа других ферментов. Недавно был предложен новый класс нуклеотидных ингибиторов с высоким сродством к РНКазе А [61]. Ими являются моно- и динуклеотидные производные аденозин 5 -пирофосфата (ррА). Первоначально были изучены как ингибиторы 51-дифосфоаденозин З -фосфат (ррА-З -р) и 5 -дифосфоаденозин 2 -фосфат (ррА-2 -р). Измеренные значения констант ингибирования активности РНКазы А для этих соединений оказались равными 0,2 мкМ и 0,5 мкМ, соответственно, т.е. в б и 2,5 раза меньше чем для 5 -АДФ [6]. Кристаллическая структура комплексов РНКазы А с ррА-З -р и ррА-2 -р была использована как основа для разработки производных нуклеотидов, обладающих повышенным сродством к ферменту [61]. В результате был синтезирован pdUppA-3 -p, для которого константа ингибирования РНКазы А равна 27 нМ. Ингибиторы такого типа являются конкурентными ингибиторами, то есть их эффективность зависит от уровня субстрата. Также эти ингибиторы эффективно действуют только в диапазоне рН 5-6 и при низкой ионной силе раствора. Недавно было обнаружено, что олиго(винилсульфоновая кислота) и ее производные также являются эффективными ингибиторами РНКазы А [62]. Было показано, что способность олиго(винилсульфоновой кислоты) ингибировать РНКазную активность сильно зависит от ионной силы. В 50 мМ имидазольном буфере при рН 6,0 КІ = 11 рМ, тогда как в присутствии 100 мМ NaCl К,=120 нМ, что близко к значению для pdUppA-З -р в таких же условиях. Кроме РНКазы А, относительно мало информации имеется об ингибировании низко молекулярными ингибиторам других РНКаз. Было показано, что человеческая РНКаза 4 ингибируется 5 -фосфоуридин 2 -фосфатом в области тех же концентраций ингибитора, что и РНКаза А; значение Kj для РНКазы 4 составляет 40 мкМ. 2 - и 3 -фосфатыуридина и цитидина, 5 -фосфоаденозин и 5-фосфоаденозин З -фосфатот 90 до 1000 раз хуже связываются с ангиогенином, чем с РНКазой А [б].
Также было изучено ингибирование человеческой РНКазы 2, РНКазы 4 и ангиогеиина производными аденозин 5 -пирофосфата. ррА-З -р эффективно ингибирует РНКазу 2 и РНКазу 4, значения Kj для этих ферментов равны 0,3 и 0,5 мкМ, соответственно, что близко к значениям, измеренным для РНКазы А. Значение Kj для РНКазы 2 и РНКазы 4 при ингибировании pdUppA-З -р составляет 0,2 и 0,3 мкМ, соответственно, что в 7 и 11 раз выше чем для РНКазы А. Ангиогеиин значительно хуже чем РНКаза 2 и РНКаза 4 ингибируется ррА-З -р и pdUppA-З -р, величина Kj для этих ингибиторов составляет 300 и 360 мкМ, соответственно [б]. Очевидно, что актуальной является дальнейшая разработка подходов для создания эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКаз. 1.5.2. Белковые ингибиторы РНКаз 1.5.2.1. Барстар В 1965 г. Смитон и др. [63] обнаружили, что штамм Bacillus amyloliquefaciens продуцирует внутриклеточный белковый ингибитор, предохраняющий клетку от летального действия собственной рибонуклеазы. Позже этот белок получил название барстар. Клонирование и экспрессия гена этого белка в Е. coli создали основу для изучения структуры и механизма действия барстара с помощью методов белковой инженерии [64]. Молекула барстара (Мг=10213 Да) состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 89 аминокислотных остатков. В белке присутствует два остатка цистеина, но дисульфидная связь между ними не образуется. Пространственная структура барстара определена рентгеноструктурным анализом в кристалле [65] и ЯМР- спектроскопией в растворе [66]. Барстар образует с барназой очень сильный эквимолярный комплекс (рис. 6) с константой диссоциации порядка 10"14-10"13 М [67]. Первоначально остатки барназы и барстара, вовлеченные в связывание, были установлены с помощью сайт-направленного мутагенеза поверхностных остатков обоих белков [19]. Затем структура комплекса барназа-барстар была определена методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,0 А [65]. Оказалось, что комплекс стабилизируется, в основном, электростатическими взаимодействиями между отрицательными зарядами барстара и положительными зарядами остатков, расположенных преимущественно в активном центре фермента. Ингибирование барназы барстаром обусловлено тем, что активный центр фермента стерически блокируется второй с N-конца а-спиралью барстара и петлей, соединяющей ее с первой ос-спиралью. Кроме барназы, барстар ингибирует и гомологичную ей биназу [68]. РНКазы Sa, Sa2 и Sa3 также эффективно ингибируются барстаром [24].
Методы исследований
Исследование кинетики гидролиза poly(l) и GpU рибонуклеазами проводили при 25С и рН 6,5 или рН 6,2, в буферных растворах следующего состава: 0,05 М Трис-НС1, 0,1 М NaCl, 0,05 М ацетат натрия (рН 6,5); 0,1 М цитрат натрия, 0,1 М NaCl (рН 6,2). Начальные скорости реакции определяли спектрофотометрически на спектрофотометре V-560 ("Jasco" Япония) по изменению поглощения раствора на 248 нм для poly(I) и 280 нм для GpU, используя разностные молярные коэффициенты поглощения Дє=1330 М см [30J и Дє=850 М" см" [Нб], соответственно. Для получения кинетических параметров ферментативной реакции начальные скорости измеряли для 7-8 концентраций субстрата. Величины kcat и Км определяли из графиков Лайнуивера-Берка, используя метод наименьших квадратов. Ошибка в определении параметров kcat и Км не превышала 8%. Зависимость каталитических параметров гидролиза poly(I) от рН измеряли в интервале рН 4,0-8,5 в буферном растворе 0,05 М Трис-НСІ, 0,1 М NaCl, 0,05 М ацетат натрия, доведенном уксусной кислотой до нужного рН. Начальные скорости при различных значениях рН определяли используя одно и то же значение коэффициента молярного поглощения 1330 М"1 cm 1, потому что poly(I) не титруется в указанном интервале рН. Анализ зависимостей kcat и kcat/Км от рН проводился так же как описано в работе [117], с использованием следующих уравнений: Kcat kcat = (1) 1 + [Н]/КА + [Н]2/КА -КВ + Кс /[Н] + Kc -KD7[H]2 kCat/ Км кЄа(/Км = , (2) 1 + [Н]/КА + [Н]2/Кл-Кв + Кс/[Н] + Кс-Ко/[Н]2 где kcat и Км - независимые от рН величины соответственно числа оборотов фермента и константы Михаэлиса, Кд , KQ, Кс , и KD - макроскопические константы кислотной диссоциации, характеризующие группы на свободном ферменте/субстрате, Кд , KG , Кс, и KD - константы диссоциации ионогенных групп фермент-субстратного комплекса [117, 118]. Параметры уравнений 1 и 2 находили из графиков зависимости рН от log(kCat) или 1о(кса1/Км) методом нелинейной регрессии с использованием программного пакета Origin (OriginLab Corporation). 2.2.2. Определение жизнеспособности клеток в присутствии РНКазы Использовали две пары линий клеток в соответствии с предполагаемыми мишенями действия микробных РНКаз; (а) НЕК293 клетки почки эмбриона человека, в которых изначально отсутствуют активируемые кальцием калиевые каналы (Кса каналы), и те же клетки, трансфецированные генами Кса каналов hSK4 на вирусном векторе.
В качестве контрольных клеток, не содержащих Кса каналов, во избежание влияния вирусного вектора на выживаемость клеток, использовали линию клеток HEKCV, сконструированную с помощью внесения в клетки НЕК293 вирусного вектора, не несущего гены Ка каналов; (б) NIH3T3 фибробласты мышей и фибробласты, трансформированные онкогеном ras из v-Ha-ras-трансфецированных psi-2-клеток на ретровиральном векторе. Фибробласты животных культивировали при 37С в среде Eagle s (рН 7,2), содержащей 5% телячьей сыворотки, 2мМ L-глутамина и антибиотики в увлажненной атмосфере 6% СОг/94% воздуха. После слияния культуры обрабатывали трипсином в течение одной минуты и клетки высевали с плотностью 6x10s клеток на чашку диаметром 35 мм. Перед добавлением РНКазы клетки культивировали в течение 24 часов. Концентрацию РНКазы варьировали от 1 до 50 мкМ. Клетки НЕК293 культивировали в смеси сред DMEM и Ham s F12 (1:1, об/об), содержащей 10% телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина без антибиотиков в увлажненной атмосфере 6% СОг/94% воздуха. После слияния культуры обрабатывали трипсином в течение одной минуты и клетки высеивали из расчета 2x105 клеток на чашку диаметром 35 мм. Клетки культивировали в течение 24 часов перед добавлением РНКазы. Концентрацию РНКазы варьировали от 1 до 50 мкМ. Выживаемость клеток контролировали при помощи реактива на пролиферацию клеток WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Этот тест основан на расщеплении водорастворимой соли тегразолия митохондриальньши дегидрогеназами, содержащимися в жизнеспособных клетках. Клетки инкубировали 20 мин. с WST-1. После центрифугирования жидкой фазы в течение 5 мин. при 5000 g измеряли поглощение в аликвотах надосадочнои жидкости на длине волны 450 им. В качестве контроля использовали смесь бесклеточной среды с реактивом WST-1. Выживаемость клеток рассчитывали как разницу между поглощением каждого варианта и контроля, как описано ранее [85]. Выживаемость необработанных клеток принимали за 100%. Число клеток в каждой чашке подсчитывали после трипсинизации в счетной камере, используя световой микроскоп. Скорость дыхания определяли как изменение поглощения раствора WST-1 за 1 час на 10 клеток. Приведенные в диссертации величины являются средними из трех измерений со стандартным отклонением. 2.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК) Измерения параметров тепловой денатурации белков Td и ДНсаі (температура денатурации и калориметрическая энтальпия денатурации, соответственно) проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО "Биоприбор", Пущино, Россия) при скорости нагрева 1 К/мин. Рабочий объём капиллярных калориметрических ячеек из платины составлял 0,48 мл. Для предотвращения образования пузырьков и закипания растворов при повышении температуры в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление 1,5 атм. Калибровка приборов ДАСМ-4 осуществлялась путём подачи на одну ячейку фиксированной мощности (AW = 25 мкВт). Для каждого калориметрического эксперимента определяли инструментальную базовую линию. В обе калориметрические ячейки (рабочую и контрольную) помещали исходный буферный раствор и проводили прогрев при заданной скорости. Затем обе ячейки перезаправляли: в контрольную помещали тот же буферный раствор, а в рабочую - раствор исследуемого белка.
При внесении в одну из ячеек раствора белка в том же растворителе наблюдается отклонение от базовой линии, ДСрарр, связанное с разностью Для проверки обратимости процесса тепловой денатурации, после первого прогрева образца и записи зависимости теплоемкости раствора от температуры раствор белка охлаждали и проводили повторный нагрев. 90 10 30 50 70 Температура (С) Рис. 12, Типичная экспериментальная термо грамма денатурации глобулярного белка. AW - дополнительная мощность известной величины, подаваемая на одну из ячеек для калибровки теплового эффекта. ДСрарр - разница теплоемкости между растворителем и раствором белка. Базовая линия получена при заполнении обоих ячеек растворителем [б]. Экспериментальные кривые корректировали путём вычитания приборной базовой линии, чтобы учесть имеющийся разбаланс ячеек. Обратимость процесса тепловой денатурации определяли как отношение теплоты денатурации белка при повторном нагреве после охлаждения к её значению при первом нагреве. Парциальную молярную теплоемкость белка, Ср, определяли как описано в работе [119], принимая парциальной удельной объем для РНКазы Sa и ее мутантов равным 0,73 см3/г. Парциальный объём белков был рассчитан по их аминокислотному составу в соответствии с работой [120]. Термодинамические параметры тепловой денатурации белка Т , ДНсаі и ДНеп- (эффективная (Вант-Гоффа) энтальпия денатурации) определяли как было описано ранее в работе [119]. Калориметрическую энтальпию денатурации рассчитывали из площади под кривой зависимости избыточной теплоемкости белка от температуры; эффективную энтальпию денатурации рассчитывали в соответствии с уравнением: ДНея- = 4R(Td) ДСртах/ДНса[, где R -универсальная газовая постоянная (8,314 Дж-ІС -моль" ); Та - температура денатурации в градусах Кельвина; ДСртах - максимальное изменение теплоемкости белка в точке соответствующей температуре денатурации. Точность определения величин калориметрических и эффективных энтальпий составляла 6-8%, а величины Ср±0,4 ккал-Ю -моль 1. Экспериментальная ошибка измерения T t не превышала ±0,2С. Анализ калориметрических кривых. Для обработки и анализа кривых плавления использовали программные пакеты "WinScal1 ЗЛО "Скал" (Россия) и "Origin 4,0" фирмы "МїсгоСаГ (США).
Конструирование ингибиторов РНКазы Sa и родственных ферментов
Анализируя подходы ингибирования ферментов различных классов, мы обратили внимание на предложенный в последнее время подход к ингибированию сериновых протеаз. Он основан на способности белков связывать ионы двухвалентных металлов. Как известно, цинк занимает второе место в биологии среди наиболее распространенных переходных металлов и незаменим для жизни [136]. В клетках почти весь цинк связан с белками в виде двухвалентного иона цинка [137]. Несмотря на то, что для проявления своей ферментативной активности сериновым протеазам не нужно присутствие ионов металлов, они эффективно связывают ионы цинка. Эта способность и была использована для создания новых ингибиторов протеаз. Используя дифракцию рентгеновских лучей, Кац с сотрудниками установили, что ингибитор трипсина бис(5-амидино-2-бензимидазолил)метан (ВАВІМ) ингибирует этот фермент, связывая один ион цинка из раствора [138-140]. Этот ион цинка образует связи с четырьмя гетероатомами - двумя из ВАВІМ и двумя из боковых цепей фермента. Величина Kj для одного только ингибитора ВАВІМ составляет 19 мкМ, а для одного ZnI+ - 1 мМ. Однако ЬСІ для комплекса BABIM + Zn2+ составляет 5 нМ [138]. Было показано, что способность комплексов металлов ингибировать активность ферментов, не требующих металлов для реализации своей функции, может использоваться не только для сериновых протеаз, но и для ряда других ферментов [141-145]. РНКаза Sa и биназа катализируют расщепление РНК без участия ионов металлов в качестве кофакторов. Анализ кристаллических структур этих РНКаз показывает, что остатки Glu54 и His85 в РНКазе Sa и Gtu73 и His 102 в биназе в каталитическом процессе расщепления РНК действуют как общая кислота и общее основание. Карбоксильная и имидазольная группы боковых цепей этих остатков могли бы служить лигандами для иона Zn при наличии определенного заместителя в 3 -положении рибозы, связанного в активном центре нуклеотида. В качестве такого заместителя мы предложили использовать N-гидроксимочевину [146, 147]. Соответственно, в качестве ингибитора РНКаз, использующего хелатированный ион цинка, был предложен З -К-гидроксиуреидо-З -дезокситимидин 5 -фосфат (рТ-З -К-гидроксимочевина). Выбор этого соединения был основан на следующих соображениях. Гидроксамовые кислоты хорошо связывают ионы Zn + [145].
Нуклеозид как аналог субстрата должен специфично связываться с ферментом. Использование дезоксинуклеозида позволяет иону Zn2+o6pa30BbiBaTb две координационные связи с группами белка (схема 2). 3.2.2. Ингибирование активностей РНКазы Sa и биназы З -N-гидроксиуреидо-З -дезокситимидин б -сроссратом в присутствии цинка(П) На рис. 18 и 19 показаны изменения активностей РНКазы Sa и биназы под действием рТ-З -К-гидроксимочевины Б отсутствии в растворе цинка. Значения констант ингибирования РНКаз, найденные из данных на рис. 18 и 19, представлены в табл. II. В таблице также приведены кинетические параметры реакции гидролиза poly(I) РНКазой Sa и биназой. Ингибирования активности как РНКазы Sa, так и биназы ионами Zn2+ при отсутствии в растворе рТ-З -М-гидроксимочевины не наблюдалось вплоть до концентрации ионов цинка 5-10" М. Из табл. 12 и 13 видно, что величина К; для РНКазы Sa составляет около 0,12 мМ, а для биназы К;=0,05 мМ для произведения концентраций [I][Zn2+] M07 М. При значениях произведения [I][Zn ] выше указанной величины, рассчитанное значение Kj возрастает. Это, скорее всего, отражает неправомерность использования в расчетах величин [1о] и [Zno2+] при больших значениях произведения [I][Zn +] вместо значений [I] и [Zn +], так как они могут существенно отличаться из-за комплексообразования между I и Zn2+ за счет взаимодействия ионов цинка с заряженной фосфатной группой ингибитора. Поэтому следует считать, что наиболее точное значение величины Kj может быть получено при низких концентрациях ионов цинка и pT-3 -N-гидроксимочевины. Это соответствует величине 0,12 мМ для РНКазы Sa, что примерно на порядок ниже константы ингибирования без цинка. В случае биназы ингибирование рТ-3 -N-гидроксимочевиной в присутствии ионов цинка улучшается более чем в 25 раз, значение Kj составляет 0,05 мМ. РНКаза Sa представляет собою кислую рибонуклеазу с изоэлектрической точкой pi 3,5. При рН 6,2, при котором измерялись константы ингибирования, суммарный заряд молекулы фермента отрицательный. Биназа, напротив, является щелочной рибонуклеазой с pi 9,б и имеет положительный суммарный заряд при рН 6,2. Однако, константы ингибирования РНКазы Sa комплексом рТ-З -К-гидроксимочевины с ионом Zn2+ близки к соответствугощим значениям для ингибирования биназы и составляют величину 0,05-0,10 мМ. Это показывает, что связывание ионов цинка с РНКазами в присутствии нуклеотидов с N-гидроксимочевиной в З -положении рибозы определяется структурой их активных центров, а не общим зарядом молекулы белка. 3.2.3. Ингибирование активности Glu54Gln мутанта РНКазы Sa З -М-гидроксиуреидо-З -дезокситимидин 5 -фосфатом в присутствии цинка(П) Для подтверждения способа связывания ионов цинка в активном центре РНКазы мы исследовали ингибирование рТ-3-N-гидроксимочевиной в присутствии ионов Zn2+ активности мутанта РНКазы Sa, в котором остаток Glu54 заменен на остаток глутамина. Схема 2 предполагает, что связывание иона цинка реализуется при участии в качестве лигандов двух групп белка. В случае РНКазы Sa ими должны быть карбоксильная группа боковой цепи остатка GIu54 и имидазольное кольцо остатка His85.
Поэтому следует ожидать, что замена этих остатков другими, не способными координировать ионы цинка, будет приводить к существенному ухудшению связывания комплекса рТ-З -Ы-гидроксимочевина п + с ферментом. В разделе 3.1 было показано, что замена остатка His85 другой аминокислотой приводит к полной потере активности РНКазы Sa. Это затрудняет изучение связывания комплекса цинка(П) и рТ-З -М-гидроксимочевины в активном центре фермента. Известно, что замена остатка Glu73 на остаток Ala в барназе (близком гомологе биназы) также приводила к практически полной потере активности фермента [16]. Замена же Glu54Gln в РНКазе Sa уменьшает активность фермента в 740 раз (табл. 7). Такое уменьшение активности позволяет провести измерение указанных констант ингибирования. Следует заметить, что хотя концевая группа остатка глутамина может быть лигандом ионов цинка, ее взаимодействие с ионом цинка будет существенно слабее, чем отрицательно заряженной карбоксильной группы остатка глутаминовой кислоты. Поэтому для подтверждения способа связывания ионов цинка в активном центре РНКазы мы исследовали ингибирование комплексом Zn с рТ-З -Ы-гидроксимочевиной активности мутанта РНКазы Sa с заменой Glu54Gln. Параметры, характеризующие ингибироваиие GIu54GIn мутанта РНКазы Sa комплексом рТ-3 -гидроксимочевина-7п , приведены в табл. 14, В случае Glu54Gln мутанта константа ингибирования комплексом I-Zn2+ примерно на порядок хуже, чем для РНКазы Sa и практически совпадает по величине с константой ингибирования рТ-З -М гидроксимочсвиной в отсутствие цинка. Это свидетельствует о значительном снижении сродства комплекса ионов цинка с рТ-З -Ы-гидроксимочевиной к активному центру РНКазы Sa при замене остатка Glu54 на остаток глутамина.
